邱 實(shí)，張含露，朱丹怡，呂 熙，萬(wàn)春云，趙懿侔，楊豐利*，李鵬飛

（1．長(zhǎng)江大學(xué)動(dòng)物科學(xué)學(xué)院，湖北荊州434025；2．湖北石首麋鹿國(guó)家級(jí)自然保護(hù)區(qū)管理處，湖北石首434407）

隨著人類活動(dòng)及現(xiàn)代化農(nóng)業(yè)的發(fā)展，醫(yī)療行業(yè)和畜禽養(yǎng)殖業(yè)中抗生素的濫用情況使得抗生素成為環(huán)境中檢出頻率最高的新型環(huán)境污染物，抗生素環(huán)境污染問題已成為國(guó)內(nèi)外環(huán)境衛(wèi)生領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)[1]。獸用抗生素被廣泛使用于治療和預(yù)防畜禽疾病，一些抗生素在動(dòng)物體內(nèi)吸收較差，可隨動(dòng)物的排泄物進(jìn)入環(huán)境中，加劇了耐藥菌的出現(xiàn)并增強(qiáng)了細(xì)菌的耐藥性[1]。隨著耐藥菌傳播速度加快，多重耐藥細(xì)菌增多已成為全球關(guān)注的問題[2]。目前對(duì)于抗生素耐藥基因的來(lái)源有2種推測(cè)：一是天然存在的耐藥基因，主要是由于某些微生物在產(chǎn)生抗生素的同時(shí)也具有相應(yīng)的耐藥機(jī)制[3]；二是基因突變，由于抗生素的過量使用使細(xì)菌產(chǎn)生了選擇并促進(jìn)耐藥基因的富集，讓許多原本不具備耐藥基因的細(xì)菌獲得了新的耐藥基因[4]。

本試驗(yàn)以某麋鹿自然保護(hù)區(qū)水源內(nèi)的細(xì)菌為研究對(duì)象，檢測(cè)四環(huán)素類、糖肽類、碳青霉烯類以及喹諾酮類耐藥基因的攜帶情況。研究旨在了解保護(hù)區(qū)水源中耐藥基因的攜帶情況，以期為后續(xù)探討保護(hù)區(qū)周邊地區(qū)耐藥基因的攜帶情況提供依據(jù)，同時(shí)為周邊地區(qū)抗生素的使用提供參考，降低耐藥菌及耐藥基因轉(zhuǎn)移的風(fēng)險(xiǎn)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 樣本來(lái)源

本試驗(yàn)的水源樣本于2021年3月采自某麋鹿保護(hù)區(qū)內(nèi)地表湖泊，設(shè)置14個(gè)采樣點(diǎn)，每個(gè)采樣點(diǎn)采集1份水樣。使用滅菌吸管吸取距水平面以下20 cm處的地表水源，每個(gè)采樣點(diǎn)采集10 mL水樣保存于滅菌EP管中，做好標(biāo)記，編號(hào)1~14。

1.1.2 試劑與耗材

LB瓊脂、蛋白酶、細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒（北京天根生化科技有限公司）；溶菌酶（合肥博美生物科技有限責(zé)任公司產(chǎn)品）；2×fast Pfu PCR Mix（北京佳蘭生物科技有限公司）；DL2000 DNA Marker（北京聚合美生物科技有限公司產(chǎn)品）；瓊脂糖（Biowest公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 收集菌體

分別吸取14份水源樣品100μL均勻涂布于LB瓊脂培養(yǎng)基中，37℃恒溫培養(yǎng)18~24 h，將培養(yǎng)出的菌落使用0.9%生理鹽水沖洗并收集于2 mL離心管中，12 000 r/min離心1 min，吸凈上清收集菌體。

1.2.2 提取水樣細(xì)菌基因組DNA

提取水源樣本DNA，按照細(xì)菌基因組DNA提取試劑盒的提取步驟進(jìn)行。

1.2.3 耐藥基因引物的合成（見表1）

四環(huán)素類耐藥基因8種（tetA、tetC、tetL、tetM、tetO、tetW、tetB、tetX）[5-6]，糖肽類耐藥基因3種（VanA、VanB、VanC）[5]，碳青霉烯類耐藥基因5種（KPC、NDM、VIM、OXA-48、IPM）[7]，喹諾酮類耐藥基因3種（qnrB、qnrS、qepA）[5-6]。耐藥基因引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，引物序列及條件見表1。引物4 000 r/min離心1 min，根據(jù)生物公司提供的參數(shù)，加入ddH2O配制成100 μmol/L的貯存液，并稀釋為10 μmol/L使用，分裝至EP管中－20℃保存，備用，避免反復(fù)凍融。

表1 耐藥基因引物序列Tab.1 Resistance genes primer sequences

1.2.4 PCR擴(kuò)增耐藥基因序列

以單個(gè)耐藥基因?yàn)?組，配置14個(gè)PCR體系進(jìn)行耐藥基因序列的擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增程序：94℃預(yù)變性5 min；94℃變性30 s，退火30 s，72℃延伸20~60 s，共30~35個(gè)循環(huán)；72℃延伸10 min。

1.2.5 PCR產(chǎn)物凝膠電泳檢測(cè)

取3μL PCR擴(kuò)增產(chǎn)物，進(jìn)行1.0%瓊脂糖凝膠（耐藥基因tetA使用2%瓊脂糖凝膠）電泳檢測(cè)。電泳結(jié)束觀察結(jié)果，并拍照記錄。

2 結(jié)果與分析

某麋鹿保護(hù)區(qū)水源中細(xì)菌耐藥基因檢測(cè)結(jié)果見表2。由表2可知，共檢測(cè)到4種四環(huán)素類耐藥基因，其中耐藥基因tetA、tetB、tetO、tetX的檢出率分別為7.14%（1/14）、28.57%（4/14）、7.14%（1/14）和21.43%（3/14），未檢出耐藥基因tetC、tetL、tetM、tetW；檢測(cè)到1種糖肽類耐藥基因VanA檢出率為35.71%（5/14），未檢測(cè)到VanB、VanC；檢測(cè)到3種碳青霉烯類耐藥基因，其中耐藥基因NDM、KPC、VIM檢出率分別為35.71%（5/14）、14.28%（2/14）、14.28%（2/14），未檢測(cè)到耐藥基因OXA-48及IPM。未檢測(cè)到環(huán)丙沙星耐藥基因qnrB、qnrS、qepA。

表2 耐藥基因檢測(cè)結(jié)果Tab.2 Detection result of resistance genes

3 討論

Ji等[8]對(duì)上海地區(qū)的豬場(chǎng)、禽舍及養(yǎng)牛場(chǎng)內(nèi)糞便樣品進(jìn)行四環(huán)素類耐藥基因的檢測(cè)，檢測(cè)到tetB、tetM、tetO、tetW，與本試驗(yàn)中耐藥基因的檢出情況略有差異。何良英[9]以及Tao等[10]分別對(duì)養(yǎng)殖場(chǎng)附近污水及廢水進(jìn)行四環(huán)素耐藥基因檢測(cè)，前者發(fā)現(xiàn)tetA、tetO、tetW，未檢測(cè)到tetB；后者發(fā)現(xiàn)有tetA和tetW2種耐藥基因，結(jié)果均與本研究耐藥基因的檢出情況略有不同。張雪婧等[5]對(duì)甘肅地區(qū)某奶牛場(chǎng)土壤樣品耐藥基因的檢測(cè)項(xiàng)中，共有7種與本試驗(yàn)重合的四環(huán)素耐藥基因（tetA、tetB、tetC、tetM、tetO、tetL、tetW），檢出的耐藥基因?yàn)閠etA、tetB、tetC、tetM、tetO、tetL，檢出率為50%~100%，未檢測(cè)到耐藥基因tetX，與本試驗(yàn)檢出情況存在差異。

VanA是最常見的耐藥基因，VanA型菌株對(duì)萬(wàn)古霉素呈高水平耐藥[11]。張雪婧等[5]試驗(yàn)中糖肽類耐藥基因VanB、VanC的檢出率均為100%，本試驗(yàn)中未檢測(cè)到這2種耐藥基因。劉利強(qiáng)等[12]從鮮蛋表面分離出屎腸球菌并在5株耐萬(wàn)古霉素的菌株中檢測(cè)到了VanA基因，檢出率為14.3%，低于本試驗(yàn)檢出率。

細(xì)菌對(duì)于碳青霉烯類抗生素藥物產(chǎn)生耐藥性最主要的原因是產(chǎn)碳青霉烯酶水解了相應(yīng)的抗生素。碳青霉烯酶最主要有5類[13]，分別為IPM、KPC、VIM、OXA-48和NDM，其中最為常見的是KPC。KPC是由blaKPC同位基因編碼的A類絲氨酸類酶[14]。2017年，張雪婧等[5]并未全部檢出NDM和KPC，但2018年時(shí)2種耐藥基因在2個(gè)牛場(chǎng)檢出率分別為53.55%、44.44%和27.27%、66.67%，表明耐藥基因有可能在不同地區(qū)之間進(jìn)行水平傳播，耐藥基因型分布存在區(qū)域差異性。本試驗(yàn)未檢測(cè)到OXA-48和IPM這2種基因型，可能是由于這2種基因型在國(guó)內(nèi)屬于不常見的基因型[7]。水源中存在NDM、KPC和VIM等耐碳青霉烯類最常見的耐藥基因，可能是由于人類的干擾，存在進(jìn)入保護(hù)區(qū)時(shí)帶入耐藥菌的可能[15]。

本試驗(yàn)結(jié)果表明，該麋鹿保護(hù)區(qū)地表水源中攜帶有四環(huán)素類耐藥基因，檢出率為7.14%~28.57%；糖肽類耐藥基因，檢出率為35.71%；碳青霉烯類耐藥基因，檢出率為14.28%~35.71%?，F(xiàn)有的耐藥基因的研究表明，不同地區(qū)和不同來(lái)源性的細(xì)菌耐藥基因的攜帶率存在差異性，且耐藥基因的檢出可能與檢測(cè)對(duì)象耐藥菌傳播機(jī)制有關(guān)。不同地區(qū)抗生素的使用情況不同，對(duì)應(yīng)的不同地區(qū)耐藥性和耐藥基因的產(chǎn)生可能存在差異。一般使用抗生素較多的地區(qū)耐藥基因檢出率更高。本試驗(yàn)中所檢測(cè)的4類抗生素耐藥基因相較畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)等地區(qū)的耐藥基因的檢出率較低，采樣地區(qū)為麋鹿保護(hù)區(qū)，不存在對(duì)麋鹿針對(duì)性用藥的情況，故耐藥基因的檢出率較低。而該保護(hù)區(qū)仍能檢測(cè)到耐藥基因的情況與耐藥菌的遷移有關(guān)，其耐藥菌可能由周邊地區(qū)遷移而來(lái)。

4 結(jié)論

畜禽養(yǎng)殖過程中應(yīng)減少抗生素藥物的使用，加強(qiáng)對(duì)麋鹿保護(hù)區(qū)周邊和長(zhǎng)江中上游地區(qū)水源中耐藥細(xì)菌的定期監(jiān)測(cè)以及對(duì)制藥廠、畜禽養(yǎng)殖場(chǎng)排放污水的監(jiān)管，以降低耐藥菌在環(huán)境中轉(zhuǎn)移的潛在風(fēng)險(xiǎn)，并減少耐藥基因變異耐藥性增強(qiáng)的可能。