秦瑞陽, 李永富, 劉建國

鹽度、光強和溫度對鹽生杜氏藻生長的影響及其交互作用

秦瑞陽1, 2, 3, 李永富1, 2, 劉建國1, 2

(1. 中國科學院海洋研究所 實驗海洋生物學重點實驗室 海洋大科學研究中心, 山東 青島 266071; 2. 青島海洋科學與技術試點國家實驗室 海洋生物學與生物技術功能實驗室, 山東 青島 266237; 3. 中國科學院大學, 北京 100049)

為明確各環(huán)境因子對鹽生杜氏藻生長的影響是否存在交互作用及其影響的程度, 采用3因素2水平正交試驗方法, 以7天批次培養(yǎng)獲得的比生長速率為評價指標, 研究了鹽度()、光照強度()、溫度()及兩因素交互作用、、對細胞增殖速率的影響, 并測定了各條件下光合放氧速率、呼吸耗氧速率、葉綠素熒光及色素含量等以闡釋作用機制。結果表明: 溫度是影響藻細胞增殖的最顯著因素, 其次是鹽度與光照, 交互作用×、×對綠色鹽藻細胞生長有一定作用, 但影響程度不如單一因子。確定利于鹽藻細胞增殖的最優(yōu)條件為: 溫度30 ℃、鹽度110、光照強度120 μmol·m–2·s–1, 而利于類胡蘿卜素積累的條件則需將鹽度提升至160。溫度、光照通過影響光合放氧速率, 而鹽度通過影響呼吸耗氧速率調控藻細胞生長。

鹽生杜氏藻; 正交試驗; 比生長速率; 色素含量; 交互作用

鹽生杜氏藻()是廣鹽性單細胞真核綠藻, 特定條件下能大量積累β-胡蘿卜素, 是目前天然β-胡蘿卜素的主要來源[1]。鹽藻還含有豐富的蛋白質, 是海參等水產動物的優(yōu)質餌料[2], 且其甘油含量最高能達到干重的50%, 具有生產甘油的應用潛力[3]。目前, 澳大利亞、以色列、中國等均已經實現該藻的規(guī)模化生產[4]。

鹽度、光照和溫度是影響鹽藻生長的主要非生物環(huán)境因子[5-6]。目前, 各因素單獨作用時鹽藻細胞的生長響應已相對明確: 水溫25～30 ℃時鹽藻生長最好, 細胞最適光強約100～120 μmol·m–2·s–1[7-8]; 鹽度范圍因藻株不同而存在差異, 但普遍在鹽度高于100時生長較好[9-11]。我們利用鹽生杜氏藻(IOCAS 879ss)的實驗結果也表明該藻生長的適宜鹽度為110～120[12]。然而, 實際生產中鹽生杜氏藻生長受多個物理化學因素共同作用, 特別是開放池養(yǎng)殖模式下, 自然強光、高溫以及因水分大量蒸發(fā)導致的鹽度劇升等條件共同影響藻細胞增殖。國內外學者也開始認識到多因素共同作用的問題, 研究重點開始由單一的環(huán)境因子影響機制向多因素的共同或交互作用規(guī)律轉移[6, 13]。Bonnefond等[6]發(fā)現, 光照和溫度同步波動比光照波動而溫度恒定條件下的凈固碳速率提升25%, 光照下升高溫度對微藻光合固碳具有明顯的正向協同作用。劉真等[13]發(fā)現高鹽和強光均可提高鹽藻β-胡蘿卜素含量, 而高光高鹽聯合作用明顯要強于單獨作用。但是, 影響鹽藻生長的各因素中, 其影響程度如何排序, 各因素間是否存在交互作用, 交互作用以及背后蘊含的科學規(guī)律, 這些問題尚不清楚。本研究針對以上問題, 圍繞多因素共同作用開展鹽藻生長響應研究。

本研究以鹽生杜氏藻(IOCAS 879ss)為研究對象, 通過正交試驗方法考察鹽度、光照以及溫度之間的交互作用對鹽藻生長的影響, 并通過活體葉綠素熒光等方法挖掘各單因素或兩因素交互作用的光合生理機制。

1 材料與方法

1.1 藻種培養(yǎng)

鹽生杜氏藻(IOCAS 879ss), 由中國科學院海洋研究所藻類與藻類生物技術實驗室保存。以改良版Johnson’s培養(yǎng)基[14]培養(yǎng)藻細胞, 通過向培養(yǎng)基中添加NaCl調節(jié)鹽度。所有藻懸液均在光強為50 μmol·m–2·s–1、溫度為(25±1)℃連續(xù)預培養(yǎng)4 d, 每天隨機調換三角瓶的位置并定時充分搖動3次。

1.2 正交試驗設計

以鹽度、光照強度和溫度3個環(huán)境因子為考察因素, 選擇正交表L8(27), 設計有交互作用的3因素2水平正交試驗(表1), 表頭設計見表2。按照表2模擬試驗條件, 將預培養(yǎng)4 d至指數生長期的藻種接入已滅菌并冷卻的不同鹽度培養(yǎng)基中, 分別將藻液培養(yǎng)在100 mL三角瓶中, 每瓶加入50 mL上述藻液, 初始接種密度分別為6.75×104cell·mL–1(培養(yǎng)基鹽度110)和1.725×105cell·mL–1(培養(yǎng)基鹽度160)。在人工培養(yǎng)箱中連續(xù)培養(yǎng)7 d, 光暗比為14 h︰10 h。

表1 因素水平表

表2 L8 (27) 表頭設計

1.3 評價指標

以比生長速率()為評價指標, 對試驗結果進行直觀分析和方差分析, 確定有顯著影響的因子以及有交互作用的試驗條件。比生長速率()按下式計算[15]:

式中,0和1分別表示第0天的(0)和第7天(1)的藻細胞密度(單位: cells·mL–1)。

1.4 色素含量測定

取5 mL藻懸液于10 mL離心管中, 2 770(= 9.8 m/s2)離心5 min, 棄去上清液, 向濕樣中加入5 mL 95%乙醇, 旋渦混合后放置在黑暗處4 ℃過夜, 浸泡至藻體為白色, 2 770離心5 min, 用紫外-可見光分光光度計測定液相在665 nm(665nm)、649 nm(649nm)和470 nm(470nm)處吸光度值, 按下式計算色素含量[16]:

a= 13.95665nm– 6.88649nm, (2)

b= 24.96649nm– 7.32665nm, (3)

carot= (1 000470nm– 2.05a– 114.8b)/245,(4)

式中,a、b和carot分別表示葉綠素、葉綠素和類胡蘿卜素質量濃度(單位 mg·L–1)。

1.5 藻細胞呼吸耗氧速率和光合放氧速率測定

取2 mL藻液, 加入Chlorolab-2型液相氧電極(Hansatech, 英國)反應室內, 對各試驗組藻細胞進行耗氧/放氧速率測定, 并計算其光合和呼吸作用速率[17]: 測定時, 打開磁力轉子后首先測定暗處理10 min內氧氣的平均消耗速率, 以單個藻細胞產生的氧氣量(μmol)進行換算, 即為單個藻細胞的呼吸耗氧速率(μmol·min–1)。打開光源, 在培養(yǎng)光強下照射藻細胞, 測定10 min內氧氣平均釋放速率, 計算單個藻細胞產生的氧氣量(μmol), 即為單個藻細胞的凈光合放氧速率(μmol·min–1)。每個處理組重復3次。測定時通過水浴控溫保證測定溫度與試驗溫度一致[18]。

1.6 葉綠素熒光參數測定

實際光化學效率(PSII)、最大光化學效率(v/m)、最大天線轉換效率(v′m′)、反應中心的開放程度(p)及初始熒光產量(o)使用FMS-2 脈沖調制熒光計(Hansatech, 英國)結合修正后的適配器進行測定[19-20]。測定前將樣品置于暗處適應15 min, 測定光強同培養(yǎng)光強, 各參數可在熒光儀上直接讀出, 每個處理組重復4次。

1.7 數據處理

所有試驗結果均進行3～6次重復, 使用Origin 2018軟件作圖, 所有數據均用Minitab 18.0進行方差分析, 用方差分析中Games-Howell(方差非齊性)或Tukey(方差齊性)檢驗方法對組間數據進行顯著性差異檢驗(<0.05)。

2 主要結果

2.1 正交試驗條件對鹽藻細胞比生長速率的影響

表3和表4為鹽藻藻細胞生長的正交試驗結果。極差分析和方差分析發(fā)現, 溫度()和鹽度()對比生長速率的影響最明顯, 而光照強度()的影響相對較小。其次是鹽度和溫度交互作用×、光強和溫度交互作用×, 最后是鹽度和光照交互作用×。鹽藻綠色細胞生長最好的環(huán)境因子組合為212, 即溫度30 ℃、鹽度110、光照強度為120 μmol·m–2·s–1。因×和×對綠色藻細胞生長有一定的影響, 進一步對二者分析發(fā)現(圖1),1與2、2與2配合時, 鹽藻綠色細胞比生長速率最大, 與極差分析結果一致(212, 即溫度30 ℃、鹽度110、光照強度為120 μmol·m–2·s–1)。

表3 正交試驗設計與結果

注: *表示列為空白列[21],1表示各因素在水平1處理條件下的平均值,2表示各因素在水平2處理條件下的平均值,表示各因素的極差。

表4 正交試驗結果方差分析

注: 若>0.1, 則< 0.1, 說明處理間有一定差異, 在值右上方標記*-, 若>0.01, 則< 0.01, 說明處理間差異極顯著, 在值右上方標記**。

2.2 鹽度、光強和溫度對細胞色素含量的影響

不同鹽度處理下綠色鹽藻細胞中色素含量的變化如圖2(a)所示。鹽度增加, 葉綠素含量和類胡蘿卜素含量均顯著增加(<0.05)。光照強度由50 μmol·m–2·s–1升至120 μmol·m–2·s–1, 葉綠素、葉綠素含量均顯著降低。與20 ℃相比, 30 ℃下藻細胞內葉綠素和類胡蘿卜素含量變化差異均不顯著(>0.05), 但單位細胞內葉綠素的含量隨溫度的增加顯著增加(<0.05),a/b比值結果由4.96下降至3.67, 意味著溫度上升后, 細胞光利用能力提高[22]。

圖1 交互作用因素二元圖

2.3 鹽度、光強和溫度對光合放氧及呼吸耗氧速率的影響

圖3列出了藻細胞在各因素水平下的呼吸耗氧速率和光合放氧速率變化?？梢? 鹽藻光合作用過程受光照強度和溫度變化影響顯著, 而受鹽度影響輕微; 但呼吸作用受鹽度影響較大, 受另外兩因素影響較小。因此, 強光下凈光合放氧速率降低應歸因于光合作用速率的下降; 而高溫下因提高了光合作用速率, 使得凈光合放氧速率升高。相應地, 高鹽度下出現凈放氧速率上升, 主要原因是呼吸速率下降。

2.4 鹽度、光強和溫度對葉綠素熒光參數的影響

vm,v′m′和PSII分別表示PSII反應中心最大光能轉換效率, 最大天線轉換效率和實際光化學效率, 反映了不同條件下鹽藻細胞的光合生理活性。p是光化學淬滅系數, 表示PSII開放的反應中心所占比例;o為初始熒光, 來自天線色素, 是已經暗適應的光合機構全部PSII中心都開放時的熒光強度[23]。對不同條件下鹽藻細胞的測定結果顯示(圖4), 高、低鹽度下vm,v′m′,PSII和p的差異很小, 僅高鹽下o升高, 這印證了光合放氧速率和色素的測定結果(圖3), 即本研究設置的鹽度范圍在整體上對光合作用影響較小, 但可提高藻細胞內捕光色素的含量。與鹽度影響不同, 光強升高后, 所有參數均明顯降低[圖4(b)], 光強由50 μmol·m–2·s–1升至120 μmol·m–2·s–1,vm極顯著下降(<0.001), 表明藻細胞光合機構所吸收的光能已超出藻細胞本身所能利用的能力, 發(fā)生了光抑制[24]。與鹽度影響規(guī)律類似, 溫度升高對反應中心效率參數, 如vm,v′m′,PSII和p的影響較小, 但o明顯增加。

圖2 不同鹽度(110、160)、光照強度(50、120 μmol·m–2·s–1) 和溫度(20 ℃、30 ℃)下綠色鹽藻細胞色素含量變化

圖3 不同鹽度(110、160)、光照強度(50、120 μmol·m–2·s–1)和溫度(20 ℃、30 ℃)下綠色鹽藻細胞呼吸耗氧速率、光合放氧速率

3 討論

鹽生杜氏藻是一種單細胞耐鹽綠藻, 可以在接近淡水至飽和鹽度下存活[25-26]。本研究表明, 在綠色鹽藻增殖階段, 溫度是最重要的影響因素, 其次是鹽度, 溫度和光照的交互作用、溫度和鹽度的交互作用分別對綠色鹽藻細胞生長有一定作用。當前, 鹽藻養(yǎng)殖的大規(guī)模商業(yè)化培養(yǎng)主要通過戶外淺塘(如澳大利亞)或人工跑道池(如印度、中國和以色列)實現, 尚未見利用光生物反應器培養(yǎng)成功的報道[27]。但是, 由于封閉式光生物反應器具有培養(yǎng)條件可控、光徑小、利用人工光源補充光能、混合效率高、CO2供應方便等優(yōu)點[28], 利用反應器進行鹽藻培養(yǎng)嘗試的報道日益增多[29-31]。例如, Prieto等[29]的研究結果顯示, 利用管道反應器開展的鹽藻兩階段培養(yǎng)模式, 即先在第一階段(鹽藻生長階段)提供適宜的生長條件, 待其增殖到一定密度時, 再轉入第二階段(β-胡蘿卜素積累階段), 通過強光、高鹽、高溫、營養(yǎng)脅迫等手段誘導β-胡蘿卜素大量積累, 其生物質產率和β-胡蘿卜素產率均明顯高于開放池半連續(xù)培養(yǎng)模式。

圖4 不同鹽度(110、160)、光照強度(50、120 μmol·m–2·s–1)和溫度(20 ℃、30 ℃)下鹽藻細胞葉綠素熒光參數

溫度對藻類生長和發(fā)育具有重要的調控作用。鹽藻在–5 ℃到40 ℃的極端環(huán)境條件下均能存活, 但一般認為適宜其快速增殖的溫度是25～32 ℃[29, 32-34]。本研究結果支持這一觀點, 即30 ℃下鹽藻生長速率和凈光合放氧速率均高于20 ℃。本研究進一步顯示, 高溫時藻細胞o明顯增加, 這與鹽藻的色素含量變化相一致, 即高溫通過增加捕光色素含量, 提高光能捕獲效率, 最終提高了光合作用速率[35]。與溫度影響規(guī)律類似, 強光下鹽藻細胞比生長速率略有增長, 但單個藻細胞的凈光合放氧速率均明顯下降, 由1.68× 10–7μmol·min–1降至9.53×10–8μmol·min–1(表3, 圖3)。葉綠素熒光分析結果顯示, 強光下發(fā)生光抑制(圖4b)。微藻對光照的需求既與接種密度有關, 又受到單個藻細胞、藻細胞內部捕光色素及其他化學成分消光的影響[36]。在120 μmol·m–2·s–1的強光下, 藻細胞通過減少天線色素含量或反應中心數量來減少對光能的吸收, 從而減少強光照射對光合機構造成的光損傷。但是, 高光下鹽藻比生長速率高于弱光, 可能是由于鹽藻通過快速分裂增殖, 增加了藻細胞密度, 從而強化細胞間遮擋, 弱化光照對單個細胞造成的損傷。這可能是強光誘發(fā)光抑制, 而促進細胞增殖的另一可能原因, 具體機制需更多研究。

有意思的是, 高鹽條件下藻細胞的呼吸耗氧速率被顯著抑制; 但此時藻細胞內色素含量上升(圖2a),凈光合放氧速率升高(圖3), 但比生長速率降低(表3)。這一現象說明, 在本試驗鹽度范圍內, 相對低的鹽度有利于藻細胞的增殖(表3), 而在高鹽度條件下有利于類胡蘿卜素的積累, 這與Ahmed等的研究結果一致[37-40]。鹽藻在高鹽下會大量積累甘油, 且胞內甘油含量與外部滲透壓成正比[41]。單位體積內和單個細胞的凈光合放氧速率均明顯上升, 說明生物質積累增加, 且增加可能因甘油積累所致。光合作用和呼吸作用活性分析結果進一步說明, 高鹽條件下甘油積累的還原力和底物來源是光合作用, 被顯著抑制的呼吸耗氧所提供的ATP和還原力難以維持甘油含量的瞬時提高[42]。因此, 從細胞密度角度考慮, 應選用鹽度110; 而從生物量積累的角度考慮, 宜選擇鹽度160。以上選擇取決于由第一階段(即細胞增殖階段)向第二階段轉移(即類胡蘿卜素積累階段)時是否采用高鹽脅迫條件。若存在鹽度升高條件, 往往因大量積累甘油而導致生物量提高[43-44], 此時提供盡可能多的藻細胞有利于最終生物質的產出, 選擇110鹽度進行綠色細胞增殖優(yōu)于160。反之, 若無鹽度明顯變化, 宜選用鹽度為160。一般而言, 現有報道的二步法培養(yǎng), 均為在低鹽條件下使鹽藻快速增殖到一定細胞密度后再轉入高鹽條件下使其積累大量的β-胡蘿卜素, 從而達到高密度培養(yǎng)和高β-胡蘿卜素積累, 尚未見兩階段鹽度一致的報道[5, 45]。因此, 確定110為生產選用鹽度為宜。

除單因素作用外, 本研究還發(fā)現鹽度-溫度交互作用和溫度-光照交互作用能明顯影響鹽藻的細胞增殖, 具體表現為: 在低鹽條件下, 高、低溫之間的比生長速率差異明顯高于高鹽條件下; 而高溫條件更利于通過提升光強加速鹽藻細胞增殖(圖1)。單因素分析發(fā)現, 低鹽條件下, 藻細胞的o明顯降低, 葉綠素和類胡蘿卜素含量均低于高鹽條件下的含量; 而30 ℃與20 ℃相比, 葉綠素明顯升高。低鹽條件下, 因溫度升高而色素含量上調, 最終導致藻細胞的捕光能力高于高鹽條件下, 這可能是低鹽條件下, 高-低溫增殖速率出現明顯差異的原因(圖1)。其次, 高-低溫條件下, 藻細胞最大光化學效率vm差異較小, 但強光下調了該參數和總光合放氧速率(圖3, 圖4)。30 ℃高溫尚不足以對藻細胞產生熱損傷, 反而有利于光合作用進行(圖3)。高溫條件下, 強光對藻細胞產生的光抑制程度明顯降低, 這可能是高溫條件下強-弱光藻細胞比生長速率差異大于低溫條件下強-弱光藻細胞比生長速率差異的原因。值得一提的是, 本研究發(fā)現鹽度和光照的交互作用對藻細胞增殖影響較小, 但不足以說明這種交互作用不存在。如前所述, 本研究所設置的鹽度范圍(110～160)均是鹽藻的適宜生長條件, 強、弱光對藻細胞比生長速率的影響差異在不同鹽度下尚未顯現。理論上, 光照和鹽度分別是調控β-胡蘿卜素合成和甘油代謝的關鍵因素, 而β-胡蘿卜素合成和甘油需共同的光合作用產物丙酮酸[46-47], 雖然尚無光照強度直接影響甘油代謝途徑的生物學證據, 但光照至少可通過影響光合作用強度間接調控甘油代謝。光鹽交互作用是否會在增大鹽度梯度范圍時顯現尚需更多研究。

4 結論

1) 在設置的水平范圍內, 各因素對藻細胞比生長速率的影響次序為溫度>鹽度>光照; 最適細胞增殖條件為: 鹽度110、光照強度120 μmol·m–2·s–1、溫度30 ℃。若以獲取生物量為培養(yǎng)目的, 鹽度提升至160為宜。

2) 在被前人優(yōu)選的培養(yǎng)條件下, 鹽度通過影響呼吸耗氧速率調控藻細胞生長, 而溫度、光照主要通過影響光合放氧速率起作用。鹽度和溫度交互作用(), 光照和溫度交互作用(×)對藻細胞增殖均有影響。這可能與溫度上升時色素含量升高, 捕光能力和光合放氧速率上調有關。

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Effects of salinity, light, and temperature and their interactions ongrowth

QIN Rui-yang1, 2, 3, LI Yong-fu1, 2, LIU Jian-guo1, 2

(1. CAS Key Laboratory of Experimental Marine Biology, Center for Ocean Mega-Science, Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China; 2. Laboratory for Marine Biology and Biotechnology, Qingdao National Laboratory for Marine Science and Technology, Qingdao 266237, China; 3. University of Chinese Academy of Sciences, Beijing 100049, China)

To confirm the effects of salinity (), light intensity (), and temperature () and interactions between the factors, namely×,×, and×, on the growth ofand the degree of interaction, a three-factor, two-level orthogonal experiment was conducted. The specific growth rate was obtained from eight groups of batch cultures grown for 7 days at different factor combinations as an evaluated index. Rates of photosynthetic oxygen evolution and respiratory oxygen consumption, chlorophyll fluorescence, and pigment content were also measured to clarify the physiological mechanism of the interactions. The results revealed that temperature affected algal growth most significantly, followed by salinity and light intensity. Interactions×and×played important roles in regulating the growth of; however, the degree of influence was not better than that of a single factor. Optimal conditions for algal proliferation included temperature 30 ℃, salinity 110, and light intensity 120 μmol·m?2·s?1, whereas optimal salinity for carotenoid accumulation was 160. Moreover, both temperature and light intensity primarily regulatedgrowth by affecting the rate of photosynthetic oxygen evolution, whereas salinity affected respiratory rate.

; orthogonal experiment; specific growth rate; pigment content; interaction

Aug. 5, 2020

S917.3

A

1000-3096(2021)11-0073-09

10.11759/hykx20200805001

2020-08-05;

2020-09-07

國家自然科學基金項目(32002411, U1706209)

[National Natural Science Foundation of China, No. 32002411, No. U1706209]

秦瑞陽(1992—), 女, 山東日照人, 研究生, 碩士, 主要從事藻類生理生化過程與調控研究, E-mail: qinruiyang@qdio.ac.cn; 劉建國(1964—),通信作者, 男, 山東壽光人, 研究員, 博士, 主要從事藻類和藻類生物技術研究, 電話: 0532-82898709, E-mail: jgliu@qdio. ac.cn

(本文編輯: 叢培秀)