楊端鵬, 李仲先, 王勝男, 牛建峰, 王廣策,李 健, 2

微藻基因誘變研究及應(yīng)用進(jìn)展

楊端鵬1, 李仲先1, 王勝男1, 牛建峰3, 王廣策3,李 健1, 2

(1. 攀枝花學(xué)院 生物與化學(xué)工程學(xué)院, 四川 攀枝花 617000; 2. 攀枝花市格薩拉生物技術(shù)有限公司, 四川 攀枝花 617000; 3. 中國科學(xué)研究院海洋研究所, 山東 青島 266071)

微藻是單細(xì)胞小型光合生物, 是自然界最重要的初級生產(chǎn)者, 在食品、能源、醫(yī)藥和環(huán)境等行業(yè)領(lǐng)域有重要應(yīng)用。微藻生物技術(shù)產(chǎn)業(yè)發(fā)展所需要的優(yōu)良微藻株系, 除了通過篩選獲得外, 還可以利用基因誘變或者基因工程等方法獲得。利用基因誘變方法獲得的突變株, 不是轉(zhuǎn)基因作物, 且具有更適宜生產(chǎn)需要的優(yōu)良性狀。本文主要綜述基因誘變在微藻育種中最新的應(yīng)用研究進(jìn)展, 為微藻產(chǎn)業(yè)化研發(fā)工作提供參考。

微藻; 基因誘變育種; 突變株篩選; 高附加值產(chǎn)品

微藻是初級生產(chǎn)者, 能夠通過光合作用吸收二氧化碳, 釋放氧氣, 在生態(tài)系統(tǒng)中有舉足輕重的地位。微藻在形態(tài)上主要以單細(xì)胞或簡單的多細(xì)胞形式存在, 主要包括藍(lán)藻、綠藻和硅藻等[1]。某些微藻在特殊條件下能夠生產(chǎn)氫氣、脂類等, 是有效的新能源生產(chǎn)者, 具有巨大的潛在研究利用價值[2-3]。同時, 微藻在污水處理[4]、二氧化碳吸收[5]及重金屬污染治理[6]方面也有良好效果。一些微藻經(jīng)過基因工程改造可以作為良好的細(xì)胞工廠, 用于生產(chǎn)高附加值產(chǎn)品, 如用于藥品的植物次生代謝產(chǎn)物和植物源病毒抗體等[7]。微藻含有豐富的蛋白質(zhì)、維生素和微量元素, 可以用作魚類飼料、食品、保健品和藥品等產(chǎn)品的原料[8]。

目前已經(jīng)實現(xiàn)大規(guī)模產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)的經(jīng)濟(jì)微藻有螺旋藻、小球藻、杜氏鹽藻和雨生紅球藻等。螺旋藻主要用于水產(chǎn)動物飼料和保健品, 主要生產(chǎn)地是我國福建、江西、海南和內(nèi)蒙古等地區(qū)[9]。日本、美國、前蘇聯(lián)等國家率先開發(fā)小球藻作為單細(xì)胞蛋白, 其后日本將小球藻開發(fā)為食品、健康及美容產(chǎn)品系列。此外小球藻還在環(huán)境污染治理中, 發(fā)揮著重要作用。中國在20世紀(jì)60年代初展開了對小球藻的研究和開發(fā)利用, 但未能持續(xù), 目前大規(guī)模生產(chǎn)企業(yè)較少, 與國外養(yǎng)殖水平差距較大[10-11]。杜氏鹽藻在食品、醫(yī)藥保健以及化工和養(yǎng)殖業(yè)中具有獨特經(jīng)濟(jì)價值。這種藻類在澳大利亞、美國和以色列等國家已經(jīng)實現(xiàn)了工業(yè)化生產(chǎn)。其產(chǎn)業(yè)化所涉及方面主要是β-胡蘿卜素類保健品、化妝品、營養(yǎng)補充劑和藻粉等[12]。內(nèi)蒙古蘭太實業(yè)有限公司已生產(chǎn)大量藻粉投入市場[13]。雨生紅球藻能生產(chǎn)具有極強(qiáng)抗氧化能力的天然蝦青素, 可廣泛運用于食品、藥品、化妝品及動物飼料中。2010年我國已批準(zhǔn)雨生紅球藻為新資源食品[14]。2017年蝦青素全球市場價值為5.5億美元, 并且以每年8%的速度增長, 預(yù)計到2022年產(chǎn)值能達(dá)到8億美元, 有較好的產(chǎn)業(yè)化前景[15]。

微藻在人類生產(chǎn)生活的各個領(lǐng)域發(fā)揮著越來越重要的作用。為了開發(fā)更加適合特殊領(lǐng)域需求的微藻種株, 有必要通過一定的手段進(jìn)行種質(zhì)資源的培育, 從而得到用于產(chǎn)業(yè)化的工程藻類[16]。微藻多采用無性繁殖手段進(jìn)行繁殖, 因此不能像傳統(tǒng)農(nóng)作物那樣進(jìn)行雜交育種[17]。通過人工手段增加微藻的基因突變幾率并通過有效手段進(jìn)行人工篩選, 可以得到特定性狀的藻種, 這種方法成為基因誘變育種?；蛘T變育種的誘變方式主要包括物理誘變和化學(xué)誘變, 其原理是通過物理或者化學(xué)的手段, 增加細(xì)胞中基因突變的概率, 通過設(shè)置特定的條件進(jìn)行篩選, 最終獲得具有優(yōu)良性狀的藻種, 用于研究和生產(chǎn)實踐[1]。此外常用的藻種改良方法還包括傳統(tǒng)的品種選育技術(shù)、基因工程技術(shù)[18]以及合成生物學(xué)技術(shù)等[19]。采用人工育種技術(shù)改良藻種, 對于選育特定性狀藻種, 適用于不同生產(chǎn)需要, 有重要的意義[20-21]。

基因誘變育種相對于其他的育種方法有很大的技術(shù)優(yōu)勢。首先基因誘變方法產(chǎn)生的藻種不屬于轉(zhuǎn)基因植物[17], 不受到轉(zhuǎn)基因植物的種植和運用限制。由于轉(zhuǎn)基因植物存在對環(huán)境和生態(tài)的潛在威脅[22-23], 各個國家和地區(qū)出對轉(zhuǎn)基因植物的大規(guī)模種植和使用作出了限制[24]?；蚬こ逃N產(chǎn)生的藻種屬于轉(zhuǎn)基因植物, 其大規(guī)模生產(chǎn)及產(chǎn)品的運用受較大影響[25]?；蛘T變是通過人工手段增加了基因的突變頻率, 這種突變是自然界中普遍存在的, 只是人為增加了頻率, 沒有引入其他物種的基因和報告基因序列, 其篩選過程也只是將具有特定性狀的藻種從眾多突變體中選擇出來?；蛘T變過程完全模擬自然突變和自然選擇, 因此不屬于轉(zhuǎn)基因植物[17]。人工誘變所需設(shè)備簡單, 操作容易, 對實驗室經(jīng)費要求和人員操作要求不高。相較于基因工程和合成生物學(xué)等方法, 適用的范圍廣, 對藻種沒有嚴(yán)格限制, 不需要對其遺傳背景深入研究, 周期短, 容易產(chǎn)生突變株。

基因誘變方法也存在一定挑戰(zhàn), 一是如何選擇適當(dāng)?shù)暮Y選方法和篩選平臺以保證符合目標(biāo)的優(yōu)良藻株被選擇出來; 二是誘變是隨機(jī)的, 需要大量的樣本才能篩選到符合要求的藻種, 對于實驗樣本量有一定要求。盡管如此, 基因誘變的方法以及其在微藻育種中的實際運用近年均發(fā)展迅速, 為此, 本文對其進(jìn)行綜述, 以期為微藻產(chǎn)業(yè)化開發(fā)工作提供參考和研發(fā)思路。

1 基因誘變方法

物理誘變選育微藻通常是使用紫外線、常壓室溫等離子體、激光、X射線、γ射線、微波和離子注入等方法[26]。紫外線誘變具有誘變效應(yīng)高, 設(shè)備簡單、操作安全簡便的特點。此技術(shù)是運用紫外光誘變的手段去改造生物遺傳信息, 改變微藻性狀, 進(jìn)而選育高活性或高代謝效率, 同時還具有抗逆性等的優(yōu)良遺傳性狀藻種[27-28]。常壓室溫等離子體誘變技術(shù)主要運用等離子體活性粒子作用于微生物, 能夠使微生物細(xì)胞膜結(jié)構(gòu)及通透性改變, 引起基因損傷, 進(jìn)而使微生物基因序列及代謝網(wǎng)絡(luò)發(fā)生顯著變化, 最終導(dǎo)致突變[29]。激光輻射可以引起細(xì)胞DNA或RNA、質(zhì)粒、染色體畸變效應(yīng)、酶的激活或鈍化, 以及細(xì)胞分裂和細(xì)胞代謝活動的改變, 這是激光誘變育種的基本原理。常用的誘變育種方法還包括X射線和γ射線輻照法, 這2種射線可以引起DNA鏈斷裂, 當(dāng)修復(fù)不能恢復(fù)到原狀時就會出現(xiàn)突變[30]。

曹媛媛等[31]研究了紫外線(UV)及60Co-γ射線對鈍頂節(jié)旋藻()的誘變效應(yīng), 結(jié)果表明,60Co-γ射線對鈍頂節(jié)旋藻A9菌株的損傷比UV造成的損傷強(qiáng)烈, 具有更大的誘變效應(yīng)。Ermavitalini等[32]研究了60Co-γ對微擬球藻脂類的影響, 結(jié)果表明,60Co-γ處理后微擬球藻脂類發(fā)生了變化, 其中以10 Gy輻照后微擬球藻脂類百分含量最高, 達(dá)到62.65%, 并且其脂肪酸種類比野生型多了3種(野生型脂肪酸種類為6種)。

化學(xué)誘變育種是用化學(xué)誘變劑處理微藻, 以誘發(fā)遺傳物質(zhì)的突變, 從而引起生理特征的變異, 然后根據(jù)育種目標(biāo)對這些變異進(jìn)行鑒定、培育和選擇, 最終育成新品種[33-34]。常用化學(xué)誘變劑的種類有烷化劑和核酸堿基類似物等?；瘜W(xué)誘變只需少量的藥劑和簡單的設(shè)備, 而且不同藥劑對不同植物、不同組織或細(xì)胞、不同染色體節(jié)段、不同基因的誘變有一定專一性, 因此廣泛應(yīng)用于微藻育種中, 并且取得了一定的成效[34-36]。甲基磺酸乙酯(EMS)是一種可以作用于DNA的烷化劑, 分子式為CH3SO2OC2H5, 分子量為124.16, 溶于醇, 微溶于水。這種烷化劑帶有活性烷基, 能夠與電子密度高的堿基發(fā)生烷化作用, 用烷基置換堿基上的氫原子, 從而改變DNA堿基間氫鍵的能力, 最終改變DNA結(jié)構(gòu)。具體效果是在DNA的鳥嘌呤N-7位置上, H離子被烷基取代, 成為帶正電荷的季銨基團(tuán), 進(jìn)而引發(fā)轉(zhuǎn)換型突變和置換型突變。轉(zhuǎn)換型突變, 即烷化后的鳥嘌呤不再與胞嘧啶配對而與胸腺嘧啶配對, 再后續(xù)復(fù)制過程中由GC堿基對轉(zhuǎn)換為AT堿基對, 這種突變方式占多數(shù); 置換型, 即烷基化的鳥嘌呤由于糖苷鍵斷裂造成脫嘌呤, DNA進(jìn)一步復(fù)制時由隨機(jī)堿基填補[37-38]。與此同時, EMS誘變還有較小概率造成染色體斷裂, 從而產(chǎn)生突變[39]。

Cock等[40]采用紫外誘變和EMS誘變兩種策略處理水云屬褐藻, 并通過基因組測序手段檢測誘變后的突變數(shù)量、種類和分布情況。結(jié)果表明紫外誘變比EMS能產(chǎn)生更多的基因突變。紫外誘變的誘變頻率為2.67e–6, 而EMS誘變的頻率為7.72e–7。這兩種方法產(chǎn)生的主要突變?yōu)镾NPs。Kawaroe等[41]研究了不同濃度(對照, 0.1 mol/L, 0.5 mol/L)EMS處理對微擬球藻的作用, 發(fā)現(xiàn)0.5 mol/L EMS處理能得到最高的生長密度, 0.1 mol/L處理的最高的生長速度, 0.5 mol/L處理還產(chǎn)生最高的RNA/DNA比例(0.55, 野生型的這一數(shù)值為0.12)。

烷化劑N-甲基-N'-硝基-N-亞硝胍(MNNG)是一種常用的化學(xué)誘變劑, MNNG誘發(fā)的基因突變主要為堿基的置換和堿基的顛換。用體外DNA復(fù)制技術(shù)證明突變發(fā)生基礎(chǔ)是由于化學(xué)誘變劑引發(fā)細(xì)胞DNA復(fù)制保真度的下降, 而細(xì)胞錯配修復(fù)功能未發(fā)現(xiàn)異常, 但DNA聚合酶酶譜發(fā)生改變[42]。細(xì)胞信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路的激活參與了突變的發(fā)生[43]。

核酸分子堿基類似物包括5-溴尿嘧啶, 5-溴去氧尿核苷, 馬來酰肼, 2-氨基嘌呤等, 其誘變原理是這些分子與核酸中的堿基結(jié)構(gòu)類似, 它們滲入后, 在DNA復(fù)制過程中替代堿基的位置, 從而引起堿基的錯配, 進(jìn)而導(dǎo)致轉(zhuǎn)錄和翻譯過程的改變, 形成突變表型。這種類型的誘變劑在藻類誘變育種中的運用較少, 常見于植物誘變育種[16]。

李勇斌等[44]運用化學(xué)誘變劑MNNG處理壇紫菜()原生質(zhì)體, 觀察不同劑量的誘變劑對體細(xì)胞生長分裂速度和發(fā)育分化方向的影響。結(jié)果顯示: 不同劑量的MNNG[(7.5～120.0)μg/mL]對壇紫菜體細(xì)胞的生長都有明顯的抑制作用, 而且會影響壇紫菜體細(xì)胞的發(fā)育分化方向。7.5 μg/mL、15.0 μg/mL誘變處理組向畸形細(xì)胞團(tuán)和絲狀體發(fā)育; 30.0 μg/mL和60.0 μg/mL誘變處理組向團(tuán)型葉片發(fā)育; 120.0 μg/mL誘變處理組后期多發(fā)育為正常型葉片。鄒立紅等[45]利用化學(xué)誘變劑MNNG處理海洋單細(xì)胞綠藻卡德藻, 觀測其對細(xì)胞形態(tài)和生長的影響。結(jié)果表明: MNNG導(dǎo)致卡德藻細(xì)胞出現(xiàn)鞭毛脫落、細(xì)胞膨脹、內(nèi)部結(jié)構(gòu)松散、胞質(zhì)分布不均勻、色素體異常、產(chǎn)生休眠袍子以及致畸、致死等現(xiàn)象; MNNG對卡德藻在群體水平上的生長有明顯的抑制作用, 細(xì)胞死亡率與誘變劑劑量正相關(guān)。

2 篩選平臺選擇

由于誘變育種具有高效率、隨機(jī)突變的特點, 如何在大量的突變體中篩選出具有應(yīng)用價值的藻株顯得尤為重要[17, 46]。合理的篩選平臺需要具備以下特點: 1) 高通量。能在短時間內(nèi)進(jìn)行基數(shù)較大的篩選, 從而將極小概率的目標(biāo)突變株篩選出來, 進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)。2) 具有明顯的篩選標(biāo)記。篩選目標(biāo)的特性是確定篩選標(biāo)記的主要方法, 任何一個篩選平臺, 必須要有一個明確的篩選標(biāo)記, 以便從大量的藻類中分離出目標(biāo)藻株。這種篩選標(biāo)記可以是自然存在的, 比如抗逆性、抗藥性或其他理化特性; 也可以是人工添加的, 比如染料染色和報告基因等。3) 專一性。篩選得到的突變株必須是單一的克隆, 從而保證突變性狀統(tǒng)一。

篩選方法中最常見、最方便使用的一類就是通過藻株的生物學(xué)特征進(jìn)行篩選, 比如在脅迫下通過其生物量或者克隆大小來確定突變體[35, 47-48]。檢測生物量通常采用細(xì)胞計數(shù)法和分光光度計檢測, 其中分光光度計檢測方法速度快, 通量較高。利用顏色特性(變綠、變黃或變紅)來對突變體進(jìn)行篩選[49-51]也是一種常用的方法, 可以選擇得到與色素合成相關(guān)表型的突變體。利用葉綠素?zé)晒鈨x檢測光合系統(tǒng)參數(shù), 通過分析篩選得到突變體的方法也越來越多被采用[52-53]。這種方法利用了突變株與野生型間表型特征的不同, 采用相應(yīng)的手段, 直接將特定的突變體從眾多細(xì)胞株中選出來, 簡單易行, 不需要預(yù)處理, 對細(xì)胞傷害較小。其通量的大小由采用的方法和儀器檢測效率決定。

另一類方法就是在篩選培養(yǎng)基中加入相應(yīng)代謝過程抑制物, 在這種平板上仍能生長的藻株通常在該代謝過程能得到更多產(chǎn)物。該方法多用于篩選蝦青素合成[54]和脂類合成[55]的藻株。常用的抑制物一類是除草劑, 如喹喬寧、草銨磷和達(dá)滅草等。研究表明除草劑通常是植物某個代謝過程關(guān)鍵酶的抑制劑, 除草劑的添加會抑制相應(yīng)的代謝過程, 使正常型植株無法生長, 而該代謝過程發(fā)生突變的個體, 能夠存活下來。存活下來的個體在正常培養(yǎng)條件下, 該過程的代謝產(chǎn)物合成會增加, 例如草胺磷能阻斷谷胺酰胺合成酶的活性, 抑制紅球藻的生長并增加其蝦青素的積累[56]。另外一類是抗生素淺藍(lán)菌素或紅霉素[57]等。淺藍(lán)菌素是脂肪酸合成酶一個負(fù)責(zé)催化脂肪酸鏈C14延長的亞型的抑制劑, 在淺藍(lán)菌素處理下生長起來的突變體, 在正常環(huán)境中能產(chǎn)生更多的脂肪酸[57]?；瘜W(xué)試劑β-紫羅酮、二苯胺[54]、煙堿等也是常用于篩選用的抑制物。Chumpolkulwong等[58]通過研究表明篩選得到耐受二苯胺(DPA)的突變株能使法夫酵母積累兩倍的蝦青素。

第三類篩選方法是在誘變后的藻株中加入染色劑或熒光標(biāo)記, 再采用相應(yīng)檢測手段進(jìn)行高通量篩選, 從而得到富含某類代謝產(chǎn)物的藻株。例如尼羅紅熒光染料能與藻類中的代謝產(chǎn)物中的脂類結(jié)合, 從而使脂類含量較高的藻類熒光值較高, 從而被能識別熒光信號的流式細(xì)胞儀分選出來[59-60]。根據(jù)研究的需要可以選取不同的染色劑達(dá)到最佳效果[61-62]。

近年來, 由于高通量測序技術(shù)的快速發(fā)展, 誘變后采用測序技術(shù)進(jìn)行檢測能夠得到誘變頻率及產(chǎn)生的誘變種類的信息[40], 有助于加深對誘變機(jī)理和效率的理解和認(rèn)識。代謝組學(xué)的方法也可運用于突變體的篩選[63]。隨著檢測技術(shù)的發(fā)展, 將會出現(xiàn)越來越多的篩選平臺, 助力基因誘變后的篩選。

3 微藻基因誘變研究進(jìn)展

3.1 誘變提高油脂含量

能源緊缺問題是人類社會發(fā)展過程中遇到的重要問題, 生物柴油作為一種新興的可再生能源, 越來越受到人們的重視。由于微藻的生物學(xué)特性, 相比植物更容易大規(guī)模工業(yè)化培養(yǎng)來生產(chǎn)生物柴油。通過誘變獲得高產(chǎn)藻株對微藻生物柴油的下游生產(chǎn)具有重要意義[64]。誘變育種提高油脂含量研究的具體案例見表1。

Zayadan等[65]采用紫外誘變處理蛋白核小球藻, 獲得脂類合成和積累量提高的突變株C-2m2, 并確定其脂類積累量在培養(yǎng)基中氮元素含量為原培養(yǎng)基1/10, 光照為4 klx時最高。Liu等[66]采用紫外誘變(UV)小球藻, 采用選取綠色懸浮藻培養(yǎng)物方式篩選, 得到突變株比野生型生長速度快7.6%, 在15 d其脂類含量增加到體積的28.1%。Muthurai等[67]采用高能紫外誘變小球藻FC2 IITG, 在缺氮條件下, 通過尼羅紅染色篩選富含油脂的突變體, 得到突變體FC2-25UV, 其中性脂含量比野生型高48.4%。Tanadul等[55]利用EMS誘變處理小球藻, 之后采用添加除草劑喹禾靈(quizalofop)的培養(yǎng)基進(jìn)行篩選, 得到生物量及脂類產(chǎn)量高于野生型的突變株3株, 其中其中最高突變株脂類產(chǎn)量比野生型增加53%。衛(wèi)治金等[68]對普通小球藻()進(jìn)行低溫等離子體誘變, 之后測定培養(yǎng)期間小球藻的生物量、總脂含量及脂肪酸組成等指標(biāo), 從中篩選生長速度快、油脂含量高的小球藻突變株。誘變篩選得到3株油脂含量高的藻株, 其中誘變株M1的總脂含量、中性脂含量、總脂產(chǎn)率及中性脂產(chǎn)率分別較野生株分別提高了103.5%、133.5%、163.7%和202.9%。李青等[69]對若夫小球藻()進(jìn)行紫外誘變, 尼羅紅染色后再利用流式細(xì)胞儀對高含油藻株進(jìn)行篩選。最終篩選到的藻株S16經(jīng)培養(yǎng)總脂產(chǎn)量達(dá)到2.4 g/L, 比野生對照株提高了50%。劉長斌等[52]采用紫外誘變小球藻, 并采用尼羅紅染色熒光與葉綠素?zé)晒獗戎当碚餍∏蛟宓挠椭? 作為篩選方法篩選得到誘變株M2, 其總油脂含量32.1%, 高于野生藻株的23.1%。劉秀花等[70]采用等離子束誘變對小球藻進(jìn)行誘變處理, 通過熒光分光光度法對誘變菌株進(jìn)行初篩, 再通過蘇丹黑染色觀察、尼羅紅染色和酸熱解法提取油脂等進(jìn)行復(fù)篩, 得到高產(chǎn)油量突變株45s2-14, 產(chǎn)油量達(dá)到7.07×10–2g/mL, 45s2-1單位鮮菌體產(chǎn)油量達(dá)到26.9%。周玉嬌等[28]利用紫外誘變技術(shù), 對海南本地淡水水域篩選得到的小球藻Y019進(jìn)行誘變, 得到1100株誘變株。以HSM培養(yǎng)基和HSM氮缺乏培養(yǎng)基分別進(jìn)行篩選, 篩選出M37和M67兩個高含油量株系。與野生型小球藻Y019相比, 其相對生長速率沒有明顯變化, 油脂含量分別提高了24.58%、17.88%, 表明紫外誘變在對野生藻種改良上具有較好作用。胡小文等[71]采用紫外誘變處理小球藻株La4-37, 利用尼羅紅熒光檢測法對獲得的藻株進(jìn)行熒光檢測, 篩選獲得相對含油量最大的誘變藻株M077和M040。誘變株生長周期和油脂積累時期基本一樣, 當(dāng)達(dá)到平穩(wěn)期時脂熒光強(qiáng)度分別是原始藻株的6.2倍和1.7倍。Vigeolas等[72]利用紫外輻照誘變小球藻, 采用尼羅紅染色后進(jìn)行大規(guī)模篩選, 得到四株突變株, 其生長速度, 細(xì)胞大小與原藻種沒有差異, 但細(xì)胞內(nèi)TAG與細(xì)胞干重比顯著提高。

曹旭鵬等[59]以篩選高生長速率或油脂含量高為目標(biāo), 建立一種基于常壓室溫等離子體技術(shù)的湛江等邊金藻誘變方法, 并采用高溫高壓處理后檢測生長速率和尼羅紅熒光的方式進(jìn)行篩選, 證明了常壓室溫等離子體技術(shù)在微藻育種中的運用價值。陳建楠等[73]通過紫外和等離子體誘變育種技術(shù)對球等鞭金藻進(jìn)行誘變, 進(jìn)而采用計算生長速率及尼羅紅染色方法進(jìn)行篩選, 得到不飽和脂肪酸含量比原始藻株提高1.2倍以及巖藻黃素單位含量均高于原始藻株的突變株。Lim等[74]利用紫外線(UV-C)誘變干扁藻()并采用激活熒光細(xì)胞分選技術(shù)和微滴定盤細(xì)胞密度檢測手段篩選脂類含量增加而非細(xì)胞生長量增加的突變體。最終篩選出兩株突變體M5和M24, 其中性脂含量分別為野生型的114%和123%。Bougaran等[60]采用紫外誘變(UVc)結(jié)合尼羅紅染色、流式細(xì)胞篩選方法篩選高脂類含量等邊金藻突變體, 結(jié)果獲得生長速率不變, 中性脂類含量增加80%的突變株。Beacham等[61]利用EMS誘變微擬球藻CCAP849/3后對其中性脂用氟硼二吡咯染色, 然后根據(jù)熒光進(jìn)行篩選, 得到了多不飽和脂肪酸含量和總脂肪酸甲酯含量為野生型含量的156%的藻株。之后, 再對突變體采用UV誘變, 得到脂類是野生型3倍的突變株, 但總的生物量有所下降。Doan等[62]利用EMS對微擬球藻進(jìn)行處理, 利用綠色細(xì)胞染料(SYTOX Green cell stain)對細(xì)胞進(jìn)行染色, 再采用流式細(xì)胞術(shù)對細(xì)胞進(jìn)行分選, 獲得脂類含量增加的突變體。突變體的總脂肪酸含量是野生型的4倍, 其中軟脂酸含量增加了30%, 二十五碳五烯酸含量減少了45%。何文棟等[75]采用NTG誘變微擬球藻, 采用親脂性熒光染料BODIPY505/515染色后流式細(xì)胞儀篩選, 得到4株候選富油藻株(MT-1, 2, 3, 4)。4株誘變株產(chǎn)油性能較野生株有較大提高, 其中MT-4油脂積累達(dá)到了干重的66%, 油脂產(chǎn)率比野生型藻株提高了45%。4株誘變株的脂肪酸C16和C18之和占78%以上, 且主要以飽和脂肪酸和單不飽和脂肪酸為主; 多不飽和脂肪酸只占總脂肪酸的6%～8%, 非常適合生物柴油生產(chǎn)。王芝瑤等[53]采用碳重離子對微擬球藻株(OZ-1)進(jìn)行誘變, 然后采用Imaging-PAM和酶標(biāo)儀進(jìn)行大規(guī)模篩選, 獲得兩株高生長速率微擬球藻突變藻株(HP-1和HP-2)。兩株突變藻株(HP-1和HP-2)生物量積累較野生型藻株大幅提高, 在18 d培養(yǎng)末期生物量分別提高了18%和26%。兩株突變藻株油脂產(chǎn)率分別為295 mg/(L·d)和275 mg/(L·d), 而野生型藻株為 247 mg/(L·d)。

表2 基因誘變增加突變株生物量

3.2 誘變提高生長速率

微藻應(yīng)用于高附加值產(chǎn)品的生產(chǎn)及環(huán)境治理時需要微藻有較高的生長速率, 較高的生長速率對應(yīng)著更高的產(chǎn)出及更低的時間成本, 因此通過誘變獲得具有高生長速率的藻株具有重要意義。表2列舉了誘變育種提高微藻生長速率的研究。

曹曉菲等[76]利用紫外線誘變小球藻, 然后用高濃度NH4HCO3作為篩選壓力對其進(jìn)行篩選。由此獲得的小球藻突變株B4和C6, 在高NH4HCO3濃度下, 生物量比野生藻株提高近30%; 對比野生藻株, B4和C6的最大光能轉(zhuǎn)化效率有顯著提高。Sivarama-kri-shnan等[77]采用紫外線誘變柵藻后, 按平板上克隆大小篩選得到生物量(1.9～2.4 g/L干質(zhì)量)和脂類含量(40%～50%)分別比野生型提高的藻株, 再采用雙氧水處理, 結(jié)果突變株比野生型的脂類含量提高了3倍。Ma等[78]采用重金屬離子誘變微擬球藻, 得到突變體HP-1, 其生物量和最大生長速率分別比野生型提高了19%和6%, 脂類產(chǎn)量提高了8%。Patel等[49]采用誘變劑EMS處理野生型聚胞藻6803, 篩選高生長速率、高碳水化合物、高脂類產(chǎn)量的突變藻株。突變株由誘變后存活藻株平板培養(yǎng)后形態(tài)學(xué)觀察(黑綠色及變大的克隆)得到。從中篩選出高生長速率突變株D1和D8, 與野生型相比其碳水化合物合成增加46%, 脂類合成增加64%; D8突變株脂類產(chǎn)量比野生型增加82%。Zhang等[79]采用誘變劑EMS處理沙漠微藻sp.獲得兩株突變藻S5和G3, 其生長速率和脂類含量都明顯高于野生型。突變體篩選采用尼羅紅染色, 在96孔板中采用微孔板光譜分析儀(spectra max M5 microplate reader)進(jìn)行檢測。S5與G3的生物量和脂類產(chǎn)量比野生型分別高出45.50%, 74.24%和20.67%, 55.77%。Anandarajah等[48]使用誘變劑EMS處理微擬球藻, 之后在平板培養(yǎng)中選擇生長速度快的克隆, 得到的突變體在300 μm photons m–2·s–1光強(qiáng)下生物量比野生型提高了25%。

3.3 誘變增強(qiáng)抗逆性

具有抗逆性的藻株一般對環(huán)境的變化具有更強(qiáng)的耐受性, 在不利或脅迫環(huán)境下其生理生化受到的影響較小, 甚至能夠在特殊環(huán)境下生長; 同時一些特殊環(huán)境, 如高溫還可能提高某些代謝物的產(chǎn)量。因此通過誘變獲得抗逆性增強(qiáng)的藻株, 也是突變株定向篩選的一個方向。表3列舉了誘變育種增強(qiáng)抗逆性的研究。

表3 基因誘變增強(qiáng)突變株抗逆性

Sachdeva等[47]采用EMS誘變方法得到兩株耐高溫的蛋白核小球藻突變株M18和M24, 它們在47 ℃高溫下具有較高的脂類產(chǎn)量和較快的生物量積累。M18和M24高溫培養(yǎng)下脂類產(chǎn)量較30 ℃下生長的野生型分別增加59.62%和50.75%, 而野生型不能在超過35 ℃以上條件下生長。Ong等[35]采用EMS誘變小球藻并在40 ℃高溫下培養(yǎng)平板, 從中挑選出較大的克隆, 獲得突變體MT-7和MT-15。它們的生長速度在25 ℃時為野生型的1.4到1.8倍, 在40 ℃時為野生型的3.3到6.7倍。Chitlaru等[80]采用MNNG和紫外誘變的方法處理杜氏鹽藻, 在高滲透勢的環(huán)境中篩選突變體, 得到在高滲透勢培養(yǎng)后恢復(fù)培養(yǎng)無法正常生長的突變體。

3.4 誘變增加次生代謝產(chǎn)物產(chǎn)量

微藻合成的次生代謝產(chǎn)物具有重要的經(jīng)濟(jì)價值, 提高單位質(zhì)量微藻中次生代謝產(chǎn)物是提高高附加值產(chǎn)物產(chǎn)量、節(jié)約成本的重要手段。通過基因誘變處理微藻, 并針對性地進(jìn)行篩選, 能獲得次生代謝產(chǎn)物高產(chǎn)量的優(yōu)良株系, 對于后續(xù)生產(chǎn)具有重要意義。表4列舉了這類研究的研究情況。

表4 基因誘變增加突變株次生代謝產(chǎn)物水平

續(xù)表

吳曉英等[54]利用常壓室溫等離子體技術(shù)處理雨生紅球藻, 在含有蝦青素合成抑制劑(β-紫羅酮和二苯胺)的培養(yǎng)基上篩選, 得到蝦青素高產(chǎn)藻株M45。突變株的生物量和生長速率分別較出發(fā)株提高了6.45%和8.57%。蝦青素產(chǎn)量比出發(fā)株提高了61.73%。陸開形等[81]利用疊氮鈉(NaN3)處理雨生紅球藻, 采用濃度為1 mmol/L的NaN3處理有利于促進(jìn)藻細(xì)胞的生長, 而其他濃度處理則對藻生長起抑制作用; 但不同濃度處理都有利于促進(jìn)蝦青素的積累。Cheng等[82]利用60Co-γ輻照誘變紅球藻, 并在高CO2環(huán)境條件下篩選生長速度快和蝦青素含量高的藻株。該突變株在通常氣體環(huán)境下生長速率比野生型提高15%, 6%;高CO2濃度下培養(yǎng)的突變株其蝦青素含量比野生型提高了2.4倍。Liu等[83]采用大氣壓氬氣介質(zhì)阻擋放電技術(shù)(atmospheric pressure argon dielectric barrier discharge)誘變紅球藻, 根據(jù)平板中克隆的生長速度篩選, 得到生長速度快, 蝦青素產(chǎn)量高的突變體。對突變體進(jìn)行分析, 發(fā)現(xiàn)高蝦青素含量的突變體中, 其番茄紅素環(huán)化酶的活性較高, 這種酶催化了番茄紅素轉(zhuǎn)化為β-胡蘿卜素的過程。Wang等[84]采用紫外線誘變后再用EMS誘變的方式誘變紅球藻, 之后在含有抑制劑DPA(diphenylamine)的平板上篩選, 選擇轉(zhuǎn)變?yōu)榧t色克隆的藻株。得到突變體DPA12-2, 其蝦青素含量為野生型的1.7倍。

Lee等[85]采用MNNG誘變小球藻在高溫及高CO2利用率條件下進(jìn)行篩選, 得到具有葉黃素含量提高的突變體, 突變體中葉黃素最高產(chǎn)量達(dá)小球藻生物量的80%。Cordero等[86]采用MNNG誘導(dǎo)小球藻隨機(jī)突變, 通過在培養(yǎng)基中加入葉黃素合成代謝阻遏物煙堿和除草劑達(dá)滅草篩選突變株, 最終得到葉黃素含量兩倍于野生型的突變株MR16。Jin等[50]采用EMS誘變杜氏鹽藻, 經(jīng)培養(yǎng)后根據(jù)顏色篩選色素異常突變體, 得到玉米黃素環(huán)氧化作用缺失, 因而持續(xù)積累玉米黃素的突變體, 在低光照培養(yǎng)條件下其細(xì)胞中玉米黃素的積累量是野生型的30倍左右。Minjae等[51]利用EMS誘變杜氏鹽藻后根據(jù)克隆的顏色(黃綠色)挑選突變株, 獲得玉米黃素較野生型高15%的突變株, 并對其培養(yǎng)條件進(jìn)行了研究。

王小萬等[87]利用紫外誘變杜氏鹽藻, 通過平板篩選體積較大的克隆, 得到4株與出發(fā)株相比具有生長優(yōu)勢的藻株。測定了這4個株系的β-胡蘿卜素、蛋白質(zhì)和胞外多糖含量, 結(jié)果顯示, 有2株藻種的β-胡蘿卜素含量有顯著提高, 與出發(fā)株相比分別提高了24.8%和29.9%; 胞外多糖含量有所增加, 有3株藻種胞外多糖含量分別比出發(fā)株增加18.60%、4.65%、9.30%; 而鹽藻的蛋白質(zhì)含量經(jīng)紫外線照射后, 與出發(fā)株相比呈下降趨勢。鐘政等[27]采用紫外線誘變杜氏鹽藻, 篩選橙紅色藻落繼續(xù)培養(yǎng), 再經(jīng)高鹽、強(qiáng)光、低氮誘導(dǎo)后, 檢測其胡蘿卜素含量。得到的突變株11-1具有高產(chǎn)β-蘿卜素的能力, 其β-胡蘿卜索含量高達(dá)干質(zhì)量的9.48%, 顯著高于原出發(fā)株。

Ratnesh等[57]采用EMS誘變微擬球藻(), 然后在含有淺藍(lán)菌素或紅霉素的平板上篩選, 得到的突變株其二十碳五烯酸含量分別比野生型增加了29%和12%。李悅明等[88]采用重離子束輻照誘變微擬球藻, 在加有三氯生的培養(yǎng)基上進(jìn)行篩選, 得到突變株M44, 其二十碳五烯酸(C20: 5, n-3, EPA)質(zhì)量分?jǐn)?shù)為43.3%, EPA質(zhì)量濃度達(dá)到2.5 g/L, 是出發(fā)藻株的2.38倍。

謝鳳行等[89]對一株從養(yǎng)殖環(huán)境中篩選出的生長較快蛋白含量較高的小球藻TX進(jìn)行了紫外誘變、EMS誘變和紫外—化學(xué)復(fù)合誘變, 采用96孔板高通量篩選技術(shù)和遞進(jìn)式重復(fù)篩選方法選育高生物量、高蛋白突變株, 得到突變株H10, 其總蛋白含量、可溶性蛋白含量和干重分別較出發(fā)藻株提高3.4%、15.8%和26.2%。閆春宇等[63]以螺旋藻TJF1為出發(fā)藻株, 多功能等離子體誘變儀對藻株進(jìn)行誘變處理, 日立L-8900氨基酸自動分析儀測定其氨基酸組成和含量, 利用模糊識別法和氨基酸比值系數(shù)法對突變體與出發(fā)藻株的氨基酸營養(yǎng)價值進(jìn)行評價, 獲得了15個突變株, 其中的17種氨基酸含量均高于出發(fā)藻株, 總氨基酸含量差異顯著; 突變株的氨基酸含量分布與出發(fā)藻株保持一致; 其中總氨基酸含量最高的一株, 比出發(fā)藻株高出53.52%, 可作為高產(chǎn)蛋白優(yōu)勢藻株應(yīng)用。

4 總結(jié)

基因誘變育種具有設(shè)備要求不高、實驗操作簡單、誘變效率高和易于推廣等優(yōu)點[26], 還具有較好的普適性, 對于物種沒有明顯的限制, 不需要遺傳背景清晰, 不要求特殊的轉(zhuǎn)化手段。因此, 基因誘變是目前使用較多的藻種育種手段。但是, 誘變育種也存在一些問題, 比如靶向性不佳。誘變是隨機(jī)的, 需要從大量的突變和沒有突變的后代中篩選具有特定性狀的藻株, 因此對應(yīng)的大規(guī)模的篩選手段非常必要。誘變育種的遺傳穩(wěn)定性也有待考證, 在后代培養(yǎng)中具有二次突變的可能性。

基因誘變育種能獲得具有優(yōu)良性狀的突變株, 有提高產(chǎn)量、簡化培養(yǎng)方法、節(jié)約生產(chǎn)成本的潛力, 從而提高產(chǎn)業(yè)化生產(chǎn)效率, 增加產(chǎn)出, 對于微藻產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有重要意義。誘變育種產(chǎn)生的突變株, 不屬于轉(zhuǎn)基因生物, 在其生產(chǎn)和運用過程中不存在限制, 其產(chǎn)品易于推廣, 應(yīng)該引起微藻生物技術(shù)研發(fā)工作者的高度重視。

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Advances in the research and application of mutagenesis in microalgae

YANG Duan-peng1, LI Zhong-xian1, WANG Sheng-nan1, NIU Jian-feng3, WANG Guang-ce3, LI Jian1, 2

(1. College of Biological and Chemical Engineering, Panzhihua University, Panzhihua 617000, China; 2. Pan-zhihua Gesala Biotechnology Co. Ltd., Panzhihua 617000, China; 3. Institute of Oceanology, Chinese Academy of Sciences, Qingdao 266071, China)

Microalgae are single-cell, photosynthetic organisms and primary producers. They have vital applications in the fields of food, energy, and medicine and the environment. Wild-type strains of microalgae have been used in industry after collection and selection efforts. The genotypes and phenotypes of wild-type strains can be improved through mutagenesis and genetic engineering. Mutants acquired through mutagenesis are not considered genetically modified organisms; however, they may bear superior traits for industrial applications. In this study, we have reviewed advances in mutagenesis of microalgal genes and provided insights for applying this methodology for the industrial exploitation of microalgae.

microalgae; gene mutagenesis; screening of mutants; high value-added products

Nov. 3, 2020

000

A

1000-3096(2021)11-0165-14

10.11759/hykx20201103001

2020-11-03;

2021-01-05

攀枝花市重點科技技術(shù)項目(2018CY-N-5); 四川省科技廳重點科技計劃項目(2019YFN0121); 四川大學(xué)攀枝花市產(chǎn)業(yè)聯(lián)合創(chuàng)新基金項目(2019CDPZH-19); 四川省留學(xué)歸國人員創(chuàng)業(yè)啟動計劃項目

[Panzhihua key technology project(2018CY-N-5); Key science and technology project of Sichuan Science and Technology Department(2019YFN0121); Panzhihua Industrial Joint Innovation Fund project of Sichuan University(2019CDPZH-19); Start-up plan of Returned Overseas Students in Sichuan Province]

楊端鵬(1984—), 男, 四川西昌人, 博士, 講師, 主要從事微藻生物技術(shù)研究, E-mail: Yangduanpeng@pzhu.edu.cn; 李健(1972—),通信作者, 吉林長春人, 博士, 副教授, 主要從事微藻生物技術(shù)研究, E-mail: lij@pzhu.edu.cn

(本文編輯: 叢培秀)