2種木霉菌肥對(duì)馬尾松幼苗生長(zhǎng)及抗立枯病的影響*

蔣仙，祝靜，于存

(貴州大學(xué) 林學(xué)院，貴州 貴陽(yáng) 550025)

木霉菌(Trichodermaspp.)在抵御病原菌對(duì)植物的侵害過(guò)程中發(fā)揮了重要的作用，是目前應(yīng)用最廣泛的控制土傳病害的生防真菌。木霉菌可以通過(guò)直接拮抗植物土傳病原菌、改善植物營(yíng)養(yǎng)狀況、誘導(dǎo)抗病物質(zhì)積累和防御酶體系建立等途徑提高植物對(duì)土傳病害的抗病性[1]。木霉防治病害的主要機(jī)制包括：通過(guò)代謝產(chǎn)物抑制病原菌生長(zhǎng)，激發(fā)植物免疫系統(tǒng)[2]，以及通過(guò)營(yíng)養(yǎng)競(jìng)爭(zhēng)、菌絲纏繞、分泌抑菌的代謝產(chǎn)物等多種機(jī)制進(jìn)行病害的防治[3]。袁玉娟等[4]研究發(fā)現(xiàn)木霉通過(guò)產(chǎn)生木霉素、膠霉素、綠木霉素、抗菌肽等抑制植物病原菌生長(zhǎng)。涂晶晶等[5]研究發(fā)現(xiàn)擬康寧木霉(Trichodermakoningiopsis)Hailin菌株對(duì)尖孢鐮孢菌(Fusariumoxysporum)產(chǎn)生明顯抑制，并且可以有效地提高馬尾松(Pinusmassoniana)對(duì)立枯病的抗性。另外，木霉在對(duì)多種植物病害發(fā)揮防治作用的同時(shí)，還可以促進(jìn)植物的生長(zhǎng)。如張樹(shù)武等[6]研究發(fā)現(xiàn)深綠木霉(T.atroviride)可以通過(guò)改善植株的葉綠素含量、可溶性蛋白質(zhì)含量等生理指標(biāo)的方式來(lái)促進(jìn)白三葉草(Trifoliumrepens)的生長(zhǎng)。然而，木霉菌在田間應(yīng)用時(shí)易受環(huán)境條件影響使其防病和促生效果不穩(wěn)定[7]。因此，將木霉菌制作成固態(tài)菌肥可以有效提高其在土壤中的定殖率，還可以極大地改善木霉活體儲(chǔ)存期短、使用不方便等缺點(diǎn)。木霉菌肥是一種微生物活體制品，可以通過(guò)自身生命活動(dòng)的方式來(lái)促進(jìn)植物對(duì)營(yíng)養(yǎng)元素的吸收，使得植物獲得特定的肥料效應(yīng)[8]。木霉菌肥施用后可在土壤內(nèi)快速繁殖，短時(shí)間即可形成優(yōu)勢(shì)群體，優(yōu)勢(shì)群體可以提高土壤酶活性，使不溶性土壤養(yǎng)分溶解，促進(jìn)植物對(duì)養(yǎng)分的吸收，提高土壤中養(yǎng)分的循環(huán)轉(zhuǎn)化，促進(jìn)形成良好的根際環(huán)境[9]。以往已有較多利用木霉菌肥促進(jìn)植物生長(zhǎng)的例子，不同植物開(kāi)發(fā)特定功能的木霉菌肥配方對(duì)不同植物的促生和防病具有重要的意義[10]。

馬尾松是松科(Pinaceae)松屬(Pinus)的常綠喬木，是我國(guó)南方重要的山地造林先鋒樹(shù)種[11]。因馬尾松苗期栽植密度大、短期集約式育苗導(dǎo)致的土壤肥力下降已成為遏制馬尾松育苗產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展的重要限制因子[12]。此外，馬尾松在幼苗期病害頻發(fā)，使得馬尾松在育苗造林和資源利用上受到了嚴(yán)重制約，而立枯病被認(rèn)為是馬尾松苗期最嚴(yán)重的病害之一，嚴(yán)重時(shí)可致80%幼苗的死亡[13]。目前，利用生物菌肥代替?zhèn)鹘y(tǒng)的化學(xué)肥料和農(nóng)藥進(jìn)行林木促生和病害防治是現(xiàn)代林業(yè)的發(fā)展方向之一。以往主要通過(guò)利用外生菌根菌來(lái)對(duì)馬尾松的生長(zhǎng)進(jìn)行研究，但外生菌根菌對(duì)馬尾松的作用受溫度、pH環(huán)境條件和菌根菌在根部的有效侵染等因素的限制[14]。而木霉可以定殖于土壤和植物體內(nèi)，進(jìn)而發(fā)揮促生和病害防治的功能，針對(duì)馬尾松開(kāi)發(fā)高效的木霉菌肥，對(duì)馬尾松的促生和病害的生物防治具有重要的現(xiàn)實(shí)意義。

本研究分別以長(zhǎng)枝木霉(T.longibrachiatum)菌肥和擬康寧木霉菌肥處理馬尾松幼苗，研究2種木霉菌肥對(duì)馬尾松苗生長(zhǎng)、生理和馬尾松苗立枯病的抗性，進(jìn)而為木霉菌肥在馬尾松促生及立枯病防控上的應(yīng)用提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

供試菌株為長(zhǎng)枝木霉、擬康寧木霉和尖孢鐮孢菌，由貴州大學(xué)林學(xué)院提供，采用PDA斜面保存于貴州大學(xué)森林保護(hù)實(shí)驗(yàn)室4 ℃冰箱中；供試土壤采自貴陽(yáng)市花溪區(qū)貴州大學(xué)馬尾松人工林；供試馬尾松種子由貴州省都勻市馬鞍山林場(chǎng)馬尾松國(guó)家林木良種基地提供；供試珍珠巖和蛭石由貴州格瑞恩生物技術(shù)有限公司提供；供試菌肥是由木霉菌液(106cfu/mL)按每克基質(zhì)接入0.3 mL的菌液比例添加到混有菜籽油餅和麥麩[菜籽油餅(m)︰麥麩(m)=3︰7]的固體基質(zhì)中，每克基質(zhì)添加2 mL MendeLs營(yíng)養(yǎng)液和2.5 mL蒸餾水，用0.5 mol/L的NaOH和0.5 mol/L的HCl調(diào)整基質(zhì)的pH值為6.0，于28 ℃恒溫箱中培養(yǎng)7 d后獲得孢子濃度為1011cfu/g的木霉菌肥。MendeLs營(yíng)養(yǎng)液的組成為：(NH4)2SO44 g/L、MgSO40.3 g/L、KH2PO42g/L、CaCl2·2 H2O 0.3 g/L、FeSO4·7 H2O 5 mg/L、MnSO41.6 mg/L、ZnSO41.4 mg/L、CoCl22 mg/L，蒸餾水定容至1 L；菜籽油餅和麥麩購(gòu)自貴陽(yáng)花溪區(qū)農(nóng)貿(mào)市場(chǎng)；木霉和尖孢鐮孢菌的培養(yǎng)采用馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(PDA)和馬鈴薯葡萄糖液體培養(yǎng)基(PDB)。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

采用室內(nèi)盆栽試驗(yàn)，將菌肥與基質(zhì)土(馬尾松林土︰蛭石︰珍珠巖=6︰3︰1)混勻后移栽5個(gè)月生馬尾松幼苗，每1 000 g滅菌基質(zhì)土中加入10 g的木霉菌肥，使得每克基質(zhì)土中木霉孢子濃度為109cfu/g。采用傷根浸泡法和灌根法將尖孢鐮孢菌菌液(孢子濃度為106cfu/ml)接種至馬尾松苗根部[15]。設(shè)置6個(gè)處理，分別為：菌肥基質(zhì)(CK)、長(zhǎng)枝木霉菌肥(P1)、擬康寧木霉菌肥(P2)、菌肥基質(zhì)+尖孢鐮孢菌(Fo)、P1+Fo和P2+Fo。每個(gè)處理30盆，每盆移栽4株幼苗。于2020年5月在貴州大學(xué)西校區(qū)林學(xué)院溫室內(nèi)進(jìn)行。將盆栽幼苗置于溫室內(nèi)培育，統(tǒng)一管理培育60 d后，對(duì)馬尾松幼苗的生長(zhǎng)指標(biāo)、根際土壤養(yǎng)分、病害發(fā)生率及抗病生理指標(biāo)進(jìn)行測(cè)定。

1.2.2 指標(biāo)測(cè)定

(1)馬尾松苗生長(zhǎng)及生物量測(cè)定 不同處理馬尾松苗60 d后，每個(gè)處理隨機(jī)選取10株幼苗，使用卷尺測(cè)量并記錄苗高。自地徑處將新鮮馬尾松幼苗剪斷，將幼苗分為地上和地下兩部分。以上樣品用流水反復(fù)沖洗直至洗凈，使用濾紙吸干表面多余水分后，測(cè)量主根長(zhǎng)并統(tǒng)計(jì)側(cè)根數(shù)，同時(shí)對(duì)洗凈的地上和地下部分的樣品進(jìn)行生物量的測(cè)定，葉片和根系的鮮重利用十萬(wàn)分之一的電子天平稱(chēng)量，然后放入80 ℃烘箱烘至恒重后，再稱(chēng)量葉片和根系干重。

(2)馬尾松苗生理指標(biāo)測(cè)定 取處理60 d后的馬尾松苗，利用丙酮提取法測(cè)定葉綠素含量[16]。將取完根際土的苗經(jīng)自來(lái)水沖洗干凈附著土壤后，用無(wú)菌水清洗3次，用無(wú)菌濾紙吸干水分，每個(gè)處理隨機(jī)選取3株幼苗，利用TTC法測(cè)定根系活力[17]。以上處理均重復(fù)3次。

(3)土壤養(yǎng)分測(cè)定 取不同處理60 d后馬尾松苗，每個(gè)處理隨機(jī)選擇10株苗，用無(wú)菌毛刷將馬尾松根系附近(<4 mm)范圍內(nèi)的土壤刷下后，保存于無(wú)菌三角瓶中用于根際土壤養(yǎng)分的測(cè)定。土壤養(yǎng)分測(cè)定采用鮑士旦的方法[18]。其中，土壤全氮測(cè)定采用凱氏定氮法，土壤水解氮測(cè)定采用堿解-擴(kuò)散吸收法，土壤全磷測(cè)定采用堿熔-鉬銻抗比色法，土壤有效磷測(cè)定采用鉬銻抗比色法，土壤全鉀測(cè)定采用消煮液-火焰光度法，土壤速效鉀測(cè)定采用乙酸銨浸提-火焰光度法。以上每個(gè)處理均重復(fù)3次。

(4)立枯病發(fā)病情況調(diào)查及抗病指標(biāo)測(cè)定 采用傷根浸泡法和灌根法對(duì)健康的馬尾松幼苗進(jìn)行室內(nèi)防治試驗(yàn)[15]。病原菌處理馬尾松苗60 d后統(tǒng)計(jì)馬尾松苗立枯病的發(fā)病率和發(fā)病等級(jí)，并計(jì)算病情指數(shù)和相對(duì)防治效果。發(fā)病率、發(fā)病等級(jí)、病情指數(shù)和相對(duì)防治效果的計(jì)算參考Luo X和Yu C[13]的方法。取不同處理馬尾松苗，用無(wú)菌水洗凈后，用無(wú)菌濾紙吸干水分，分別收集葉片和根系，并迅速用液氮冷凍后保存于-80 ℃冰箱用于生理指標(biāo)的測(cè)定。POD、SOD及CAT指標(biāo)測(cè)定采用索萊寶生產(chǎn)的BC0090型號(hào)試劑盒進(jìn)行測(cè)定。相對(duì)電導(dǎo)率的測(cè)定采用電導(dǎo)儀法測(cè)定[19]。每個(gè)處理取120株苗用于幼苗病害發(fā)生率、發(fā)病等級(jí)、病情指數(shù)和相對(duì)防治效果的統(tǒng)計(jì)，以上處理均重復(fù)3次。

1.3 統(tǒng)計(jì)及分析

運(yùn)用Microsoft Excel 2019對(duì)得到的原始試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行整理，運(yùn)用IBM SPSS 24統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行方差分析和多重比較。參數(shù)均采用單因素方差分析(One-way ANOVA)，多重比較采用Duncan法進(jìn)行比較(α=0.05)。表中數(shù)據(jù)為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差。

2 結(jié)果與分析

2.1 2種木霉菌肥對(duì)馬尾松幼苗生長(zhǎng)及生物量的影響

2種木霉菌肥對(duì)馬尾松幼苗生長(zhǎng)及生物量指標(biāo)的影響結(jié)果見(jiàn)表1。由表1可知，與CK相比，施用P1、P2幼苗的苗高分別高出17.52%和13.93%；施用P1、P2的幼苗根長(zhǎng)分別長(zhǎng)出82.14%和97.99%；施用P1的幼苗側(cè)根數(shù)最多，比CK處理多出81.86%；同時(shí)，施用P1的幼苗葉片和根系的鮮重比CK處理分別增加97.06%和60.00%；施用P1的幼苗葉片和根系的干重比CK處理分別增加50.00%和100.00%；施用P2的幼苗葉片和根系鮮重比CK處理分別增加61.76%和20.00%；施用P2的幼苗葉片和根系干重比CK處理分別增加40.00%和50.00%。施用P1、P2的苗高、根長(zhǎng)及干鮮重均與CK存在顯著差異(P<0.05)。由圖1也可看出2種木霉菌肥對(duì)馬尾松苗生長(zhǎng)的促進(jìn)作用。

表1 2種木霉菌肥處理下馬尾松幼苗的生長(zhǎng)及生物量指標(biāo)

圖1 2種木霉菌肥處理下馬尾松苗生長(zhǎng)圖

2.2 2種木霉菌肥對(duì)馬尾松苗生理的影響

2種木霉菌肥對(duì)馬尾松苗根系活力、葉綠素的影響見(jiàn)圖2。由圖2A可知，施用P1和P2的幼苗根系活力顯著提高，與CK相比，施用P1、P2的幼苗根系活力分別提高45.69%和35.44%；施用P1、P2的幼苗根系活力與CK均存在顯著差異(P<0.05)。

由圖2B可知，施用木霉菌肥的幼苗葉綠素較CK組有顯著的提高，其中施用P1的幼苗葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素分別比CK處理增加90.41%、34.34%和45.90%；施用P2的幼苗葉綠素a、葉綠素b和總?cè)~綠素分別比CK處理增加93.10%、37.01%和48.39%；同時(shí)，施用P1、P2的幼苗葉綠素與CK均存在顯著差異(P<0.05)。

圖2 2種木霉菌肥處理下馬尾松幼苗生理指標(biāo)

2.3 2種木霉菌肥對(duì)馬尾松苗根際土壤養(yǎng)分的影響

施用2種木霉菌肥后馬尾松苗根際土壤養(yǎng)分的測(cè)定結(jié)果見(jiàn)表2。由表2可知，施用P1、P2的幼苗土壤全氮、全磷、全鉀、水解氮、速效磷和速效鉀與CK均存在差異。與CK相比，施用P1幼苗根際土的全氮、全磷、全鉀、水解氮、速效磷和速效鉀分別提高61.43%、50.68%、47.95%、30.89%、57.92%和29.17%；施用P2的幼苗根際土全氮、全磷、全鉀、水解氮、有效磷和速效鉀分別提高69.39%、60.27%、54.49%、32.52%、80.79%和18.01%。

表2 2種木霉菌肥處理下馬尾松幼苗土壤養(yǎng)分含量

2.4 2種木霉菌肥對(duì)馬尾松幼苗立枯病的防治效果

2種木霉菌肥對(duì)馬尾松幼苗立枯病的防治效果見(jiàn)圖3。由圖3可知，與Fo處理相比，P1+Fo、P2+Fo處理的幼苗發(fā)病率分別降低49.09%和54.48%；P1+Fo、P2+Fo處理的幼苗病情指數(shù)分別降低43.75%和58.33%；P1+Fo、P2+Fo處理對(duì)幼苗立枯病的相對(duì)防治效果分別為49.09%和54.48%。

圖3 2種木霉菌肥處理下馬尾松幼苗抗立枯病的防治效果圖

2.5 2種木霉菌肥對(duì)馬尾松幼苗抗病生理指標(biāo)的影響

2種木霉菌肥對(duì)馬尾松苗保護(hù)性酶活性和相對(duì)電導(dǎo)率的影響的結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖4A可知，P1+Fo、P2+Fo處理的幼苗葉片和根系的SOD活性與Fo均存在顯著差異。與Fo相比，P1+Fo處理的幼苗葉片和根系中SOD活性含量分別提高66.67%和61.04%；P2+Fo處理的幼苗葉片和根系中SOD活性含量分別提高43.06%和42.86%。

圖4 2種木霉菌肥處理下馬尾松幼苗抗立枯病生理指標(biāo)

由圖4B可知，P1+Fo、P2+Fo處理的幼苗葉片和根系的POD活性與Fo均存在顯著差異。與Fo相比，P1+Fo處理的幼苗葉片和根系中POD活性含量分別提高113.02%和52.40%；P2+Fo處理的幼苗葉片和根系中POD活性含量分別提高98.07%和43.24%。

由圖4C可知，P1+Fo、P2+Fo處理的幼苗葉片和根系的CAT活性與Fo均存在顯著差異。與Fo相比，P1+Fo處理的幼苗葉片和根系中CAT活性含量分別提高50.00%和41.73%；P2+Fo處理的幼苗葉片和根系中CAT活性含量分別提高41.94%和35.97%。

由圖4D可知，P1+Fo、P2+Fo處理的幼苗相對(duì)電導(dǎo)率與Fo均存在顯著差異。施用P1處理的幼苗相對(duì)電導(dǎo)率最低，其中，與Fo相比，P1+Fo、P2+Fo處理的幼苗相對(duì)電導(dǎo)率分別降低34.21%和26.32%。

3 討論與結(jié)論

將功能微生物制作為菌肥可有效提高菌株在植物中的作用效果，進(jìn)而更好的發(fā)揮促生和防治病害的功能[20-21]。木霉對(duì)植物的促生作用主要體現(xiàn)在植物根系的各項(xiàng)形態(tài)學(xué)指標(biāo)、植株的總根長(zhǎng)、根尖數(shù)以及株高等方面[22]。本研究中，長(zhǎng)枝木霉菌肥和擬康寧木霉菌肥均可不同程度地促進(jìn)馬尾松幼苗的高度和生物量，同時(shí)2種木霉菌肥還可以促進(jìn)馬尾松根系的長(zhǎng)度、分枝和根系活力，表明2種木霉菌肥均具有培育壯苗的效果。這與擬康寧木霉Hailin菌株可以促進(jìn)馬尾松生長(zhǎng)的研究結(jié)果相近，但本研究中2種木霉菌肥對(duì)馬尾松的促生效果顯著高于擬康寧木霉Hailin菌株對(duì)馬尾松苗的促進(jìn)作用[5]。分析這個(gè)差異的原因可能是將木霉制作為菌肥發(fā)揮了比木霉菌液更明顯的促生作用[20]。以往報(bào)道顯示，木霉在促進(jìn)植物生長(zhǎng)的同時(shí)還可以影響植物的生理生化[23]。本研究中，2種木霉菌肥可以提高馬尾松苗的根系活力和葉綠素的含量，同時(shí)還可提升苗的保護(hù)性酶活性，由此判斷2種木霉菌肥對(duì)馬尾松生長(zhǎng)和抗病相關(guān)生理都起到了積極的作用，通過(guò)本研究可以為未來(lái)木霉菌肥在馬尾松促生上的施用提供借鑒。這與綠木霉處理可以提升樟子松(Pinussylvetrisvar.mongolica)苗抗氧化酶系統(tǒng)活性的結(jié)論相似[24]。本試驗(yàn)還處于盆栽實(shí)驗(yàn)階段，對(duì)于野外大田的應(yīng)用效果目前還不清楚，還需進(jìn)一步進(jìn)行野外應(yīng)用研究。

氮、磷、鉀元素是植物生長(zhǎng)過(guò)程中必需的營(yíng)養(yǎng)元素，其含量的高低是直觀反應(yīng)植物吸收土壤養(yǎng)分的重要指標(biāo)[25]。以往已有多個(gè)利用微生物提高植物根際土壤養(yǎng)分含量的報(bào)道[26]，其主要作用機(jī)理是調(diào)節(jié)微生物的固氮、溶磷、解鉀和分泌生長(zhǎng)激素等能力[27]。本研究中，2種木霉菌肥可以顯著改善馬尾松苗根際土壤養(yǎng)分含量。其中，根際土全氮、全磷和全鉀的增加可能與木霉菌肥基質(zhì)加入后，被木霉作用而釋放出了更多的氮、磷和鉀有關(guān)。根際土有效磷、速效鉀和水解氮的增加可能與木霉菌具有溶磷能力、固氮能力和降低土壤pH進(jìn)而活化土壤中的養(yǎng)分有關(guān)[28-29]。

通過(guò)在植物根部施入生防菌株可以有效地防治土傳病害[30]。本研究中，2種木霉菌肥在對(duì)馬尾松立枯病的防治效果為49.1%和54.5%，要低于劉福平等[31]利用綠粘帚霉對(duì)馬尾松苗的防治效果61.2%。分析病害防治效果的差異，可能與不同菌株對(duì)病原菌的抑制機(jī)理不同，進(jìn)而使其抑菌能力存在差異，也可能和試驗(yàn)所處的外部環(huán)境條件如溫度、濕度、土壤類(lèi)型、苗木的大小等有關(guān)。以往關(guān)于2種木霉對(duì)病原菌的直接抑菌機(jī)制的報(bào)道已經(jīng)很多[32]。前期研究中發(fā)現(xiàn)擬康寧木霉可以通過(guò)菌絲纏繞、產(chǎn)生代謝產(chǎn)物與幾丁質(zhì)酶等方式抑制病原菌的生長(zhǎng)[5,33]。本研究中發(fā)現(xiàn)，2種木霉菌肥均可提高馬尾松苗保護(hù)性酶的活性，同時(shí)，2種木霉菌肥可降低馬尾松苗相對(duì)電導(dǎo)率，進(jìn)而減少病原菌對(duì)苗木的傷害。結(jié)合本研究2種木霉菌肥對(duì)馬尾松苗的促生作用，可推斷2種木霉菌肥可以通過(guò)抑制病原菌生長(zhǎng)、促進(jìn)植物生長(zhǎng)和提高馬尾松自身的免疫能力進(jìn)而降低尖孢鐮孢菌對(duì)馬尾松苗木的傷害。這與祁金玉等[34]報(bào)道的木霉可以通過(guò)對(duì)病原菌的直接抑制作用、誘導(dǎo)植物系統(tǒng)抗性等直接和間接的作用發(fā)揮樟子松對(duì)立枯病的抗病功能的結(jié)論相近。

綜上所述，2種木霉菌肥對(duì)馬尾松苗的生長(zhǎng)、生理和養(yǎng)分吸收均表現(xiàn)出積極的作用；同時(shí)，添加2種木霉菌肥還能增強(qiáng)馬尾松對(duì)立枯病的抗性。但是生物菌肥的施用方式、施用量、施肥時(shí)間與肥效的持效期關(guān)系還需要進(jìn)一步研究，以期使生物菌肥能被大范圍、大幅度地推廣使用。