秦海鵬，王 博，廖栩崢，胡世康，孫成波

（廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院，廣東湛江 524088）

0 引言

日本囊對(duì)蝦(Marsupenaeus Japonicus)是中國(guó)重要的蝦類養(yǎng)殖品種[1-2]。目前日本囊對(duì)蝦的養(yǎng)殖主要以池塘養(yǎng)殖為主，養(yǎng)殖密度偏低，同時(shí)，又受底質(zhì)選擇[3]、病害頻發(fā)[4]、同類相殘[5]等因素的影響，養(yǎng)殖難度加大。生物絮凝技術(shù)(Bio-flocs technology,BFT)是一項(xiàng)有效降低飼料系數(shù)、提高養(yǎng)殖成活率并減少養(yǎng)殖尾水排放，解決當(dāng)前水產(chǎn)養(yǎng)殖業(yè)飼料成本高昂和環(huán)境污染嚴(yán)重等問題的有效替代技術(shù)[6]。隨著生物絮團(tuán)技術(shù)成為了中國(guó)水產(chǎn)養(yǎng)殖技術(shù)研究的熱點(diǎn)，生物絮團(tuán)相關(guān)的研究逐漸廣泛開展。環(huán)境微生物群落對(duì)水生動(dòng)物腸道菌群結(jié)構(gòu)的形成有重要的影響[7-8]。環(huán)境微生物對(duì)蝦腸道內(nèi)存在演替規(guī)律[9-10]。目前的研究表明，長(zhǎng)毛對(duì)蝦(Fenneropenaeus penicillatus)、凡 納 濱 對(duì) 蝦(Litopenaeus vannamei)腸道菌群的結(jié)構(gòu)受到水環(huán)境微生物群落的影響[11-13]。外界環(huán)境影響了生物絮團(tuán)菌群的分類學(xué)特征及其功能[14]，水生環(huán)境可以影響微生物群落的組成和豐度[15]，溫度是影響活性污泥系統(tǒng)脫氮除磷效果的關(guān)鍵因素之一，環(huán)境溫度對(duì)于氮磷的去除效果有重要影響[16-17]。硝化、反硝化細(xì)菌對(duì)環(huán)境的適宜溫度存在差異[18-19]。微生物有其最適宜的生長(zhǎng)溫度，當(dāng)溫度高于或低于該溫度均會(huì)影響其活性，從而影響脫氮除磷效果及其穩(wěn)定性。本實(shí)驗(yàn)針對(duì)溫度突變條件下水質(zhì)和微生物多樣性的變化情況，探索生物絮團(tuán)協(xié)同面臨溫度突變脅迫時(shí)的生物絮團(tuán)系統(tǒng)的功能和結(jié)構(gòu)的變化，以期為日本囊對(duì)蝦的生物絮團(tuán)系統(tǒng)養(yǎng)殖提供一定的數(shù)據(jù)參考。

1 材料與方法

1.1 實(shí)驗(yàn)材料

實(shí)驗(yàn)在水體體積250 L的藍(lán)色塑料桶中進(jìn)行，生物絮團(tuán)用15 μm的篩絹網(wǎng)從鹽度(28.0±0.7)‰水體的養(yǎng)殖池中撈取。日本囊對(duì)蝦取自廣東海洋大學(xué)水產(chǎn)學(xué)院東海島海洋生物研究基地，為同一批蝦苗培養(yǎng)而成，蝦體色正常，表觀健康無(wú)病，體長(zhǎng)為9.20±0.04 cm、體質(zhì)量為9.53±0.71 g，實(shí)驗(yàn)前暫養(yǎng)1周。

1.2 實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)

實(shí)驗(yàn)將日本囊對(duì)蝦隨機(jī)分為2個(gè)處理組，每組3個(gè)平行，實(shí)驗(yàn)對(duì)蝦密度為250尾/m3，對(duì)照組為經(jīng)過消毒的潔凈海水，日換水量20%（半封閉養(yǎng)殖系統(tǒng)），實(shí)驗(yàn)組為初始量20 mL/L的生物絮團(tuán)海水（生物絮團(tuán)系統(tǒng)），實(shí)驗(yàn)周期35天。在第30天（實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組水質(zhì)保持1周的穩(wěn)定后）實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組進(jìn)行溫度突變脅迫，溫度驟升10℃。實(shí)驗(yàn)過程中24 h連續(xù)充氣。本實(shí)驗(yàn)選取實(shí)驗(yàn)第26天至35天之間的情況進(jìn)行分析（設(shè)定為第1天至第10天）。投喂人工配合飼料（粵海牌對(duì)蝦飼料3＃料），每天定時(shí)投喂（4餐/天），日投喂量為體質(zhì)量的5%～7%。

1.3 水樣收集

在實(shí)驗(yàn)期間，每天測(cè)定氨氮，亞硝酸氮和硝酸氮等水體指標(biāo)，水質(zhì)分析的水樣利用真空壓力通過0.45 μm GF/C濾紙過濾得到。

1.4 微生物樣品采集

在實(shí)驗(yàn)溫度突變點(diǎn)（第5天）和突變后（第10天）喂食后，從3個(gè)平行組分別隨機(jī)選擇5只蝦。在解剖之前，用無(wú)菌水和75%乙醇洗滌蝦的體表，將腸分離并置于干冰上的1.5 mL離心管中，并在DNA提取前立即儲(chǔ)存在-80℃冰箱中。通過0.45 μm膜濾器收集生物絮團(tuán)樣品，并立即儲(chǔ)存在-80℃冰箱中，然后進(jìn)行分析，水體微生物樣品分別編號(hào)為Qa（突變前對(duì)照組）、Qb（突變前實(shí)驗(yàn)組）、Ha（突變后對(duì)照組）和Hb（突變后實(shí)驗(yàn)組）腸道樣本分別編號(hào)為a（突變前對(duì)照組）、b（突變前實(shí)驗(yàn)組）、A（突變后對(duì)照組）和B（突變后實(shí)驗(yàn)組）。

總基因組DNA從取得的微生物樣品中提取。通過使用特異性引物擴(kuò)增16S rRNA基因的V4區(qū)：515F(5′-GTGCCAGCMGCCGCGGTAA-3′) 和 806R(5′-GGACTACH VGGGTWTCTAAT-3′)。 將 320～350 bp的PCR產(chǎn)物進(jìn)行再循環(huán)以構(gòu)建擴(kuò)增子文庫(kù)，然后在Illumina Miseq平臺(tái)測(cè)序。

1.5 序列數(shù)據(jù)分析

根據(jù)Barcode序列和PCR擴(kuò)增序列從得到的數(shù)據(jù)中進(jìn)行分析，對(duì)樣品的reads進(jìn)行拼接和過濾操作，得到高質(zhì)量的Clean Tags。基于Clean Tags進(jìn)行操作分類 單 元 (Operational Taxonomic Units,OTUs)聚 類[20]。由OTUs的聚類結(jié)果，對(duì)每個(gè)OTU的特征序列進(jìn)行物種注釋，從而得到相應(yīng)的物種注釋信息和豐度情況。同時(shí)，對(duì)OTUs進(jìn)行豐度、Alpha多樣性分析等，用來(lái)獲取樣品的物種豐富度和均勻度信息、不同的樣品、分組之間的相同和獨(dú)有的OTUs信息等[21-22]。

1.6 水質(zhì)測(cè)定方法與數(shù)據(jù)分析

氨氮，亞硝酸氮和硝酸氮的質(zhì)量濃度由《養(yǎng)殖水環(huán)境化學(xué)實(shí)驗(yàn)》中的方法測(cè)定[23]。實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)使用Graphpad Prism 8.0軟件進(jìn)行作圖和分析，SPSS 19.0進(jìn)行顯著性差異分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 生物絮團(tuán)系統(tǒng)養(yǎng)殖過程中的氮轉(zhuǎn)化

氨氮、亞硝酸氮和硝酸氮在溫度突變前后的轉(zhuǎn)化過程如圖所示。實(shí)驗(yàn)第1天至第5天溫度為20.80±0.53℃，第6天至第10天溫度為30.02±0.71℃。溫度突變對(duì)水體中氮轉(zhuǎn)化通路無(wú)顯著影響。對(duì)照組與實(shí)驗(yàn)組的氨氮濃度在溫度突變前后均維持在極低水平，突變前后氨氮水平無(wú)差異，亞硝酸氮濃度在實(shí)驗(yàn)組和對(duì)照組突變前后無(wú)差異，在實(shí)驗(yàn)組保持極低水平。實(shí)驗(yàn)組的硝酸氮在溫度突變后有上升的趨勢(shì)，溫度突變實(shí)驗(yàn)第5天（突變前）為19.65 mg/L到實(shí)驗(yàn)第10天（突變后）升高到31.54 mg/L，實(shí)驗(yàn)組的累計(jì)速率大于對(duì)照組。

2.2 水體菌群豐度和多樣性

利用16S rRNA基因V3+V4區(qū)域進(jìn)行Illumina測(cè)序，在水體微生物中獲得了4219個(gè)OTU，腸道微生物中獲得了3698個(gè)OTU，突變前水體和腸道微生物中得到4431個(gè)OTU，其中從水體微生物中獲得2953個(gè)OTU，突變后水體和腸道微生物中得到4406個(gè)OTU，其中從水體微生物中獲得3273個(gè)OTU。實(shí)驗(yàn)采用Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)和Observed OTUs計(jì)算了基于OTU的菌群豐度指數(shù)信息，并采用Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)來(lái)評(píng)估菌群多樣性指數(shù)，實(shí)驗(yàn)組的Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、Observed OTUs、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)的豐度與多樣性均大于對(duì)照組，溫度突變前水體和腸道的Ace指數(shù)、Chao1指數(shù)、Observed OTUs、Shannon指數(shù)和Simpson指數(shù)的豐度與多樣性大于突變后。

2.3 溫度突變前后的水體菌群組成差異

圖1 生物絮團(tuán)系統(tǒng)中氨氮、亞硝酸氮和硝酸氮的變化

圖2 溫度突變前的水體(Ⅰ)和腸道(Ⅱ)菌群與突變后水體(Ⅲ)和腸道(Ⅳ)菌群韋恩圖

表1 溫度突變前后的腸道和水體菌群多樣性指數(shù)

共鑒定出相對(duì)豐度在1%以上的6個(gè)門11個(gè)屬，在門水平上，變形菌門(Proteobacteria)、擬桿菌門(Bacteroidetes)、放線菌門(Actinobacteria)、綠彎菌門(Chloroflexi)、酸桿菌門(Acidobacteria)和TM7門是主要的細(xì)菌，在實(shí)驗(yàn)周期中實(shí)驗(yàn)組溫度突變前后水體微生物Qb與Hb的菌群結(jié)構(gòu)無(wú)差異，對(duì)照組Qa的菌群結(jié)構(gòu)中 Proteobacteria(57.36%)與Bacteroidetes(36.45%)分別增加或減少到Ha的Proteobacteria(79.66%)與Bacteroidetes(13.53%)，腸道微生物對(duì)照組a的菌群結(jié)構(gòu)中 Proteobacteria(84.42%)與 Bacteroidetes(5.66%)分別增加或減少到A的Proteobacteria(82.10%)與Bacteroidetes(15.20%)，實(shí)驗(yàn)組b的菌群結(jié)構(gòu)中Proteobacteria(82.50%)與Bacteroidetes(10.02%)分別減少到B的Proteobacteria(78.17%)與Bacteroidetes(7.77%)。在屬水平上，極桿菌屬(Polaribacter)、小紅卵菌屬(Roseivivax)和海命菌屬(Marivita)在對(duì)照組的水體微生物Qa與Ha中顯著，在實(shí)驗(yàn)組中豐度極低，三價(jià)鐵和硝酸鹽還原細(xì)菌(Ardenscatena)、冷蛇菌屬(Psychroserpens)在實(shí)驗(yàn)組豐度高于對(duì)照組。實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組的腸道微生物發(fā)光桿菌屬(Photobacterium)、Vibrio與Marivita在溫度突變后均有所減少，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組的豐度波動(dòng)相對(duì)穩(wěn)定。

2.4 溫度突變前后菌群種類和豐度差異及距離矩陣PCoA

根據(jù)加權(quán)和未加權(quán)UniFrac距離矩陣PCoA圖分析，可以得到同組的樣本之間圖中物種可以很好的聚在一起，不同組之間可以明確的區(qū)分開。實(shí)驗(yàn)組Qb與Hb的距離比對(duì)照組Qa與Ha的距離近，實(shí)驗(yàn)組b與B的距離比對(duì)照組a與A的距離近，通過LDA值分布柱狀圖的結(jié)果分析，得到了不同組間微生物分類相對(duì)豐富的差異。LEfSe的LDA值結(jié)果表明具有顯著差異的微生物群落在溫度突變前的水體菌群Qa與Qb中最多。根據(jù)LDA值分布柱狀圖的結(jié)果，突變前的水體菌群在多樣性更為豐富，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組細(xì)菌群落溫度突變前后變化差異小。

3 討論

3.1 溫度突變過程中的氮轉(zhuǎn)化

在溫度突變實(shí)驗(yàn)前的30天，待水體理化因子變化穩(wěn)定后，對(duì)照組水體菌群不能有效轉(zhuǎn)化水體中產(chǎn)生的的殘餌糞便，無(wú)機(jī)氮的濃度和總量逐漸增加累積[24-25]。實(shí)驗(yàn)組水體中的氨氮、亞硝酸氮和硝酸氮的產(chǎn)生和去除速率均快于對(duì)照組，表明生物絮團(tuán)能促進(jìn)水體中的氮轉(zhuǎn)化進(jìn)程[26]。在溫度突變實(shí)驗(yàn)過程中，溫度突變對(duì)水體中氮轉(zhuǎn)化通路無(wú)顯著影響，實(shí)驗(yàn)組的硝酸氮在溫度突變后有上升的趨勢(shì)。這與畢冬[27]、吳鵬等[28]的研究結(jié)果不盡相同，分析原因是溫度對(duì)水質(zhì)影響的相關(guān)研究都是通過長(zhǎng)周期的調(diào)控不同溫度來(lái)進(jìn)行的，而在水體理化因子穩(wěn)定后進(jìn)行溫度突變實(shí)驗(yàn)尚屬首次。本實(shí)驗(yàn)的結(jié)果也證明在水質(zhì)穩(wěn)定的條件下，溫度突變并不會(huì)對(duì)生物絮團(tuán)系統(tǒng)和半封閉養(yǎng)殖系統(tǒng)的水體氮轉(zhuǎn)化產(chǎn)生明顯的影響。

表2 在門水平的菌群相對(duì)豐度

表3 在屬水平的菌群相對(duì)豐度

圖3 溫度突變前后菌群的加權(quán)(Ⅰ)與非加權(quán)(Ⅱ)UniFrac距離矩陣PCoA圖

圖4 溫度突變前后菌群的LDA值分布柱狀圖

3.2 溫度突變過程中的微生物豐度和多樣性

本研究利用使用高通量測(cè)序分析生物絮團(tuán)系統(tǒng)中的微生物多樣性變化情況。溫度突變前水體和腸道的豐度與多樣性大于突變后，LEfSe的LDA值計(jì)算結(jié)果顯示顯示具有顯著差異的細(xì)菌群落在溫度突變前的水體菌群Qa與Qb中最多。溫度突變對(duì)水體和腸道的微生物群落一定的影響，溫度突變后的水體和腸道的微生物群落在豐度與多樣性均低于突變前[29]。Alpha多樣性的結(jié)果表明實(shí)驗(yàn)組的豐度與多樣性大于對(duì)照組，實(shí)驗(yàn)組比對(duì)照組細(xì)菌群落溫度突變前后變化差異小，表明生物絮團(tuán)的微生物豐度和多樣性具有更高的穩(wěn)定性[28,30]。

3.3 溫度突變過程中的微生物菌群結(jié)構(gòu)差異

在門水平上Proteobacteria和Bacteroidetes是主要的細(xì)菌，在所有水體和腸道樣本中中占很大比例，這與相關(guān)的研究結(jié)果相類似[31-33]。實(shí)驗(yàn)組溫度突變前后水體微生物的菌群結(jié)構(gòu)無(wú)差異，對(duì)照組菌群結(jié)構(gòu)中Proteobacteria比例增加，Bacteroidetes減少。水體中大多數(shù)的Proteobacteria是養(yǎng)殖系統(tǒng)中的共生細(xì)菌[34]，在生物絮團(tuán)系統(tǒng)的尾水處理中，Proteobacteria用于去除水體中的有機(jī)物質(zhì)[35-36]。Proteobacteria在生物絮團(tuán)的微生物群落組成中有重要的作用[37-38]。因此，在利用生物絮團(tuán)的養(yǎng)殖模式下，Proteobacteria可以有效地調(diào)節(jié)養(yǎng)殖水體的水質(zhì)。Actinobacteria是一種較為常見的益生菌，在特定的環(huán)境下可以產(chǎn)生有益的物質(zhì)[39]。Actinobacteria在實(shí)驗(yàn)組的水體和腸道細(xì)菌群落中比例菌高于對(duì)照組，且在溫度突變中的波動(dòng)小于對(duì)照組。在屬水平上，Photobacterium與Vibrio在實(shí)驗(yàn)組水體和腸道微生物樣本中比例均低于對(duì)照組，且在溫度突變后實(shí)驗(yàn)組與對(duì)照組中的含量均有所減少，表明生物絮團(tuán)可以控制弧菌的數(shù)量[40-41]。結(jié)果表明生物絮團(tuán)系統(tǒng)能夠抑制有害細(xì)菌的繁殖。對(duì)照組高氨氮的環(huán)境會(huì)破壞對(duì)蝦機(jī)體免疫系統(tǒng)，導(dǎo)致病原體增加，在腸道中的表現(xiàn)證實(shí)了這一結(jié)果[42]。

4 結(jié)論

經(jīng)過長(zhǎng)期培養(yǎng)后氮轉(zhuǎn)化通路穩(wěn)定的生物絮團(tuán)系統(tǒng)和半封閉養(yǎng)殖系統(tǒng)，溫度突變并不會(huì)對(duì)水體氮轉(zhuǎn)化產(chǎn)生明顯的影響。溫度突變對(duì)水體和腸道的微生物群落一定的影響，溫度突變后的水體和腸道的微生物群落在豐度與多樣性均低于突變前。生物絮團(tuán)系統(tǒng)在應(yīng)對(duì)溫度突變中的表現(xiàn)要優(yōu)于半封閉養(yǎng)殖系統(tǒng)，在微生物群落的豐度與多樣性上均具有更高的穩(wěn)定性。