付永利 唐佩娟 崔捷 李文忠 楊婧 孫英峰

摘 ? ?要：為了解天津地區(qū)種公豬精液中細(xì)菌的污染情況及耐藥特征，具有針對(duì)性地添加抗菌藥物，提高常溫保存豬精液品質(zhì)。本研究對(duì)2021年天津地區(qū)部分種豬場(chǎng)送檢的494份精液樣品進(jìn)行了細(xì)菌分離，16S rDNA鑒定及耐藥性分析研究。結(jié)果表明：天津地區(qū)公豬精液細(xì)菌攜帶比例高達(dá)38.87%（192/494），其中變形桿菌屬（Proteus）占26.53%（52/192），葡萄球菌屬（Staphylococcus）占23.96%（46/192），棒狀桿菌屬（Corynebacterium）占22.92%（44/192），腸球菌屬（Enterococcus）占11.46%（22/192），大腸埃希氏菌屬（Escherichia）占11.46%（22/192），未鑒定3.13%（6/192）;耐藥性分析顯示5種細(xì)菌對(duì)四環(huán)素、林可霉素等已產(chǎn)生高度耐藥，僅對(duì)喹諾酮類(lèi)抗生素敏感，這為豬精液抗生素的使用提供參考。

關(guān)鍵詞：公豬精液;細(xì)菌鑒定;耐藥分析

中圖分類(lèi)號(hào)：S859.84 ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ?DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.11.009

Detection and Analysis of Bacterial Pathogens in Boars Semen in Tianjin Area

FU Yongli1， TANG Peijuan1， CUI Jie1， LI Wenzhong2， YANG Jing2， SUN Yingfeng2

（1. Department of Animal Husbandry and Dairy Technology Promotion Service， Tianjin Agricultural Development Service Center， Tianjin 300061， China; 2. College of Animal Science and Animal Medicine， Tianjin Agricultural University， Tianjin 300392， China）

Abstract： In order to understand the contamination and drug resistance of bacteria in boar semen in Tianjin area， the experiment collected 494 semen samples from breeding pig farms in Tianjin area in 2021 for bacterial isolation， identified the isolated bacteria by 16S rDNA， and then analyzed the drug resistance of the identified bacteria. The results showed that the rate of bacterial contamination was as high as 38.87% （192/494）， of which Proteus was 26.53% （52/192）， Staphylococcus was 23.96% （46/192）， Corynebacterium was 22.92% （44/192）， Enterococcus was 11.46% （22/192）， Escherichia was 11.46% （22/192）， and unidentified was 3.13% （6/192）. Drug resistance analysis showed that these five bacteria species had high resistance to tetracycline and lincomycin， and were only sensitive to quinolones， which could use for semen preservation.

Key words： boar semen; bacterial identification; drug resistance analysis

近年來(lái)，豬人工授精技術(shù)在我國(guó)生豬生產(chǎn)中已得到越來(lái)越廣泛應(yīng)用。通過(guò)人工授精技術(shù)，可以最大程度提高優(yōu)良公豬的利用率，改善我國(guó)豬群的生產(chǎn)性能，提高我國(guó)豬群的品質(zhì)，也減少了疾病傳播及克服地域限制，發(fā)揮優(yōu)良基因的最大經(jīng)濟(jì)性能，同時(shí)國(guó)家相關(guān)部門(mén)出臺(tái)扶持政策，更加促進(jìn)此項(xiàng)技術(shù)普及推廣，相關(guān)專(zhuān)業(yè)知識(shí)深得人心，這為促使我國(guó)養(yǎng)豬業(yè)走向集約化、規(guī)?；杆侔l(fā)展提供了技術(shù)支撐。

目前，盡管豬場(chǎng)人員在收集和處理精液過(guò)程中采取了嚴(yán)格的衛(wèi)生措施，但在收集和處理精液過(guò)程中常發(fā)現(xiàn)大量的細(xì)菌，造成精液污染，從而直接影響到母豬的受胎率，導(dǎo)致豬場(chǎng)發(fā)生流產(chǎn)或死胎等臨床疾病[1]。來(lái)自不同地區(qū)或不同規(guī)模豬場(chǎng)的公豬精液中仍存在細(xì)菌污染[2]，通?？梢?jiàn)革蘭氏陰性菌，主要來(lái)自糞便、包皮、皮膚和毛發(fā)中的微生物，這些細(xì)菌可以導(dǎo)致精子活力受損、頂體破壞或膜活力喪失，對(duì)精子的質(zhì)量和壽命產(chǎn)生負(fù)面影響[3-4]。為最大限度地減少細(xì)菌污染常規(guī)保存精液的風(fēng)險(xiǎn)，本研究對(duì)不同天津地區(qū)部分豬場(chǎng)的公豬精液進(jìn)行了細(xì)菌性病原檢測(cè)及耐藥性分析，確定公豬精液中主要細(xì)菌性病原微生物及篩選出抑菌效果較好抗生素，為實(shí)施有效的細(xì)菌控制策略提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)時(shí)間與地點(diǎn)

試驗(yàn)于2021年4月到10月在天津農(nóng)學(xué)院動(dòng)物科學(xué)與動(dòng)物醫(yī)學(xué)學(xué)院預(yù)防獸醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)室進(jìn)行。

1.2 試驗(yàn)材料

1.2.1 精液 2021年4—9月天津市部分地區(qū)（薊州、寶坻、武清、寧河、靜海、濱海新區(qū)）規(guī)?；i養(yǎng)殖場(chǎng)的公豬精液。

1.2.2 試劑 分子生物學(xué)相關(guān)試劑（Buffer、dNTPs、Mgcl2、Taq酶）購(gòu)置于大連寶生物試劑有限公司;細(xì)菌鑒定用引物由上海生物工程有限公司合成;常規(guī)藥敏片購(gòu)置于杭州微生物試劑有限公司;血瓊脂培養(yǎng)基及巧克力培養(yǎng)基為本實(shí)驗(yàn)室配制。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 精液細(xì)菌分離與生化鑒定 將精液樣品接種于鮮血或巧克力瓊脂培養(yǎng)基，置于37 ℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24～48 h后，觀察有無(wú)細(xì)菌生長(zhǎng);如有細(xì)菌生長(zhǎng)，則觀察細(xì)菌生長(zhǎng)的狀況和菌落形態(tài)，挑取單個(gè)菌落，然后再次接種鮮血或巧克力平板進(jìn)行細(xì)菌純培養(yǎng)，待純培養(yǎng)后革蘭氏染色，同時(shí)記錄精液細(xì)菌分離培養(yǎng)結(jié)果。

1.3.2 精液菌群分子鑒定 采用煮沸法裂解細(xì)菌制備DNA，具體步驟：將試驗(yàn)中分離獲得細(xì)菌接種平板培養(yǎng)基，37 ℃培養(yǎng)18～24 h，然后刮取1～2菌落加入150 μL三蒸水中，混勻，100 ℃煮沸10 min;然后-20 ℃凍30 min， 5 000 r·min-1 離心10 min，取上清液作為模板。16S rDNA細(xì)菌鑒定通用引物27F（5'-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3'）和1492R（5'-GGTTACCTTGTTACGACTT-3'），預(yù)期片段大小為1 500 bp。PCR反應(yīng)體系：10×Buffer 2.5 μL、dNTPs2 μL、Taq酶0.5 μL、DNA模板5 μL、上游引物0.5 μL、下游引物0.5 μL、補(bǔ)雙蒸水至25 μL。PCR反應(yīng)程序：95 ℃ 5 min，95 ℃ 30 s，55 ℃ 45 s，72 ℃延伸10 min，16 ℃ 1 min。按照瓊脂糖凝膠電泳標(biāo)準(zhǔn)操作流程對(duì)結(jié)果進(jìn)行判定，然后送上海生物工程有限公司進(jìn)行基因測(cè)序，將測(cè)序結(jié)果在Genebank數(shù)據(jù)庫(kù)BLAST對(duì)比分析。

1.3.3 精液菌群藥敏試驗(yàn) 將本試驗(yàn)分離獲得的純培養(yǎng)的細(xì)菌，按照不同分類(lèi)分別將菌落調(diào)至標(biāo)準(zhǔn)比濁度，然后取少量菌液均勻涂布于整個(gè)鮮血或巧克力瓊脂平板表面，依次貼上不同種類(lèi)的藥敏紙片，然后置于37 ℃恒溫箱中培養(yǎng)24 h，用卡尺測(cè)量每個(gè)藥敏紙片的抑菌圈直徑，然后根據(jù)每種藥敏紙片的藥物敏感試驗(yàn)判定標(biāo)準(zhǔn)判定細(xì)菌對(duì)藥物的敏感性。本次試驗(yàn)選用β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素（氨芐西林、阿莫西林、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟），氨基糖苷類(lèi)抗生素（慶大霉素、丁胺卡那），喹諾酮類(lèi)藥物（恩諾沙星、左氧沙星、諾氟沙星），四環(huán)素類(lèi)（四環(huán)素、多西環(huán)素），氯霉素類(lèi)（氟苯尼考）和林可霉素類(lèi)（林可霉素）13種藥物依次對(duì)分離鑒定的不同種屬細(xì)菌進(jìn)行藥敏試驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 細(xì)菌分離培養(yǎng)與分子鑒定

對(duì)2021年天津地區(qū)部分種豬場(chǎng)送檢的494份精液樣品進(jìn)行了細(xì)菌分離，結(jié)果顯示38.87% （192/494）樣品分離獲得細(xì)菌，其中29.17%（56/192）陽(yáng)性樣品存在2種及以上均屬多類(lèi)型細(xì)菌感染。結(jié)合染色鏡檢（圖1）及16S rDNA測(cè)序鑒定（圖2），確定變形桿菌屬（Proteus）占26.53%（52/192），葡萄球菌屬（Staphylococcus）占23.96%（46/192），棒狀桿菌屬（Corynebacterium）占22.92%（44/192），腸球菌屬（Enterococcus）占11.46%（22/192），大腸埃希氏菌屬（Escherichia）占11.46%（22/192），未鑒定占3.13%（6/192）。

2.2 藥敏試驗(yàn)結(jié)果

藥敏試驗(yàn)結(jié)果（表1）表明，不同種類(lèi)細(xì)菌對(duì)藥物敏感性差異較大，總體上喹諾酮類(lèi)藥物抑菌效果優(yōu)于其他抗生素，其詳細(xì)的抑菌圈直徑結(jié)果分析如下。

變形桿菌：對(duì)喹諾酮類(lèi)藥物（恩諾沙星、左氧沙星、諾氟沙星）及氨基糖苷類(lèi)抗生素（慶大霉素、丁胺卡那）極度敏感，而對(duì)四環(huán)素類(lèi)（四環(huán)素、多西環(huán)素）、β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素（氨芐西林、阿莫西林、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟）和林可霉素類(lèi)（林可霉素）抗生素具有完全耐受性。

葡萄球菌：對(duì)部分β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素（頭孢曲松鈉、頭孢噻肟）和喹諾酮類(lèi)藥物（恩諾沙星、左氧沙星、諾氟沙星）極度敏感，而對(duì)四環(huán)素類(lèi)（四環(huán)素、多西環(huán)素）及林可霉素類(lèi)（林可霉素）抗生素具有一定耐受性。

棒狀桿菌：對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)（氨芐西林、阿莫西林、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟）、氨基糖苷類(lèi)（慶大霉素、丁胺卡那）、喹諾酮類(lèi)（恩諾沙星、左氧沙星）和氯霉素類(lèi)（氟苯尼考）等多數(shù)抗生素較為敏感，而對(duì)四環(huán)素類(lèi)抗生素（四環(huán)素、多西環(huán)素）和林可霉素類(lèi)（林可霉素）具有耐藥性。

糞腸球菌：對(duì)β-內(nèi)酰胺類(lèi)抗生素（氨芐西林、阿莫西林、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟）及部分喹諾酮類(lèi)抗生素（恩諾沙星、左氧沙星）具有敏感性，而對(duì)四環(huán)素類(lèi)（四環(huán)素、多西環(huán)素）、氨基糖苷類(lèi)抗生素（慶大霉素、丁胺卡那）、氯霉素類(lèi)（氟苯尼考）及林可霉素類(lèi)（林可霉素）抗生素具有較強(qiáng)的耐受性。

大腸桿菌：對(duì)四環(huán)素類(lèi)（四環(huán)素、多西環(huán)素）、林克霉素類(lèi)（林可霉素）、β-內(nèi)酰胺類(lèi)（氨芐西林、阿莫西林、頭孢曲松鈉、頭孢噻肟）及氨基糖苷類(lèi)（慶大霉素、丁胺卡那）抗生素具有較強(qiáng)的耐受性，而僅對(duì)喹諾酮類(lèi)抗生素（恩諾沙星、左氧沙星、諾氟沙星）極度敏感。

3 結(jié)論與討論

目前，精液常溫保存技術(shù)在國(guó)內(nèi)外規(guī)?；i場(chǎng)中已廣泛應(yīng)用，但是在人工操作工程中出現(xiàn)的精液污染問(wèn)題也越來(lái)越多，病原微生物在精液中大量繁殖，影響精子壽命及受孕能力，造成母豬繁殖性能低下[5-7]。張家慶等[8]研究發(fā)現(xiàn)，公豬精液中病原菌主要為變形桿菌、葡萄球菌、大腸桿菌、沙門(mén)氏菌、鏈球菌、棒狀桿菌以及克雷伯菌。王永等[9]從豬精液中分離出細(xì)菌主要包括：葡萄球菌、鏈球菌、銅綠假單胞菌、克雷伯氏菌等。本試驗(yàn)中，天津部分豬場(chǎng)公豬精液細(xì)菌攜帶比例高達(dá)38.87%（192/494），其中29.17%（56/192）陽(yáng)性樣品存在2種及以上均屬多類(lèi)型細(xì)菌感染，主要為變形桿菌屬（Proteus）、葡萄球菌屬（Staphylococcus）、棒狀桿菌屬（Corynebacterium）、糞腸球菌屬（Enterococcus）及大腸埃希氏菌屬（Escherichia）。這些類(lèi)型細(xì)菌均為條件性致病菌，且廣泛存在于生豬生殖道、土壤等環(huán)境中，操作不規(guī)范極易造成精液污染。由此判斷，在很大程度上，精液的污染與人為操作過(guò)程有關(guān)。

在生豬疾病防控過(guò)程中，可選用藥敏試驗(yàn)進(jìn)行藥物敏感度的測(cè)定，以便準(zhǔn)確有效的利用藥物進(jìn)行治療[10-11]。本試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同種屬細(xì)菌體外藥敏試驗(yàn)結(jié)果差異較大，如豬場(chǎng)公豬精液分離的大腸桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)抗生素、潔霉素類(lèi)以及氟苯尼考有較強(qiáng)的耐受性，而對(duì)其他抗生素敏感，特別是對(duì)喹諾酮類(lèi)極度敏感;克雷伯菌除對(duì)克林霉素具有耐藥性外，對(duì)其他抗生素都具有敏感性;變形桿菌對(duì)喹諾酮類(lèi)極度敏感;棒狀桿菌對(duì)大環(huán)內(nèi)酯類(lèi)與喹諾酮類(lèi)抗生素敏感[5];根據(jù)本試驗(yàn)結(jié)果與數(shù)據(jù)分析，可以得出天津地區(qū)公豬精液常見(jiàn)5個(gè)菌屬，即變形桿菌屬、葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬、糞腸球菌屬及大腸埃希氏菌屬，喹諾酮類(lèi)藥物總體抑菌效果優(yōu)于其他抗生素。

研究證實(shí)，生豬精液污染病原微生物病毒性微生物，細(xì)菌污染是臨床較常見(jiàn)微生物，同時(shí)可能出現(xiàn)污染環(huán)節(jié)也較多[12]。因此，為降低公豬精液污染情況，筆者建議對(duì)公豬定期保健，提高種豬體質(zhì);嚴(yán)格執(zhí)行采精標(biāo)準(zhǔn)操作程序，盡量減少精液過(guò)程污染;選用較好的稀釋液，提升精液在常溫保存效果;在條件允許情況下，可根據(jù)藥敏試驗(yàn)結(jié)果選用高敏感性抗生素，提高抑菌效果與儲(chǔ)存時(shí)間，以此提高優(yōu)秀種公豬的利用率。

天津部分地區(qū)公豬精液細(xì)菌污染嚴(yán)重，主要包括變形桿菌屬、葡萄球菌屬、棒狀桿菌屬、糞腸球菌屬及大腸埃希氏菌屬;耐藥性分析顯示已對(duì)四環(huán)素、林可霉素等已產(chǎn)生高度耐藥，僅對(duì)喹諾酮類(lèi)抗生素敏感，這為豬精液抗生素的使用提供參考。

參考文獻(xiàn)：

[1] WABERSKI D， RIESENBECK A， SCHULZE M， et al. Application of preserved boar semen for artificial insemination： Past， present and future challenges[J]. Theriogenology， 2019， 137： 2-7.

[2] ALTHOUSE G C， LU K G. Bacteriospermia in extended porcine semen[J]. Theriogenology， 2005， 63（2）： 573-584.

[3] UBEDA J L， AUSEJO R， DAHMANI Y， et al. Adverse effects of members of the Enterobacteriaceae family on boar sperm quality[J]. Theriogenology， 2013， 80（6）： 565-570.

[4] MARCO-JIM?NEZ F， BORRS S， GARCIA-DOMINGUEZ X， et al. Roles of host genetics and sperm microbiota in reproductive success in healthy rabbit[J]. Theriogenology， 2020， 158： 416-423.

[5] MAROTO M L， MU?OZ E C， DE C F， et al. Bacterial contamination of boar semen affects the litter size[J]. Animal Reproduction Science， 2010， 120（1/4）： 95-104.

[6] SEP?LVEDA L， BUSSALLEU E， YESTE M， et al. Effects of different concentrations of Pseudomonas aeruginosa on boar sperm quality[J]. Animal Reproduction Science， 2014， 150（3/4）： 96-106.

[7] SEP?LVEDA L， BUSSALLEU E， YESTE M， et al. How do different concentrations of Clostridium perfringens affect the quality of extended boar spermatozoa？[J]. Animal Reproduction Science， 2013， 140（1/2）： 83-91.

[8] 張家慶， 伏彭輝， 毛獻(xiàn)寶， 等. 公豬精液中細(xì)菌的分離鑒定及藥敏試驗(yàn)[J]. 養(yǎng)豬， 2009（6）： 55-56.

[9] 王永， 黃漢良， 陳清森， 等. 豬精液中細(xì)菌分離與鑒定試驗(yàn)[J]. 廣東畜牧獸醫(yī)科技， 2006， 31（6）： 42-43.

[10] 金穗華，劉源遠(yuǎn)， 許國(guó)林， 等. 公豬精液中細(xì)菌種類(lèi)及藥敏試驗(yàn)[J]. 養(yǎng)豬， 1994（1）： 19-20.

[11] VARNER D D， SCANLAN C M， THOMPSON J A， et al. Bacteriology of preserved stallion semen and antibiotics in semen extenders[J]. Theriogenology， 1998， 50（4）： 559-573.

[12] SCHULZE M， AMMON C， RUDIGER K， et al. Analysis of hygienic critical control points in boar semen production[J]. Theriogenology， 2015， 83（3）： 430-437.

收稿日期：2021-09-24

基金項(xiàng)目：天津市生豬產(chǎn)業(yè)技術(shù)體系創(chuàng)新團(tuán)隊(duì)項(xiàng)目——精細(xì)化養(yǎng)殖崗位（ITTPRS2021008）

作者簡(jiǎn)介：付永利（1964—），男，天津人，高級(jí)畜牧師，主要從事生豬高效生產(chǎn)技術(shù)方面研究。

通訊作者簡(jiǎn)介：孫英峰（1979—），男，山東人，教授，博士，主要從事生豬疫病診斷與防控方面研究。