賀鵬鵬 馬光皇 劉語涵 張來斌 肖海兵 楊明祿

摘 ? ?要：為了建立棗癭蚊圖爾病毒（DjTV-2a）的 PCR 檢測方法，通過提取棗癭蚊總基因組 DNA 和設(shè)計(jì) DiTV-2a 特異性引物，以DNA模板（80，100，120 ng），引物濃度（0.7，0.8，0.9 μmol·L-1），dNTP（0.2，0.3，0.4 mmol·L-1），Taq酶（1.25，1.35，1.45 U）為變量，采用正交設(shè)計(jì)篩選最佳 PCR 反應(yīng)體系，建立與優(yōu)化 DjTV-2a 的 PCR 檢測方法。結(jié)果表明：正交設(shè)計(jì)的9組 PCR 反應(yīng)體系均能夠擴(kuò)增和檢測該病毒，且DNA模板100 ng，引物0.7 μmol·L-1，dNTPs 0.4 mmol·L-1和Taq酶 1.35U反應(yīng)體系擴(kuò)增效果最佳;對(duì)最佳 PCR 反應(yīng)體系進(jìn)行退火溫度（46，48，50，52，54，56 ℃）優(yōu)化，發(fā)現(xiàn)52 ℃為引物最佳退火溫度。綜上分析，在 50 μL 反應(yīng)體系下，引物退火溫度為52 ℃，模板 DNA 量100 ng，引物0.7 μmol·L-1，dNTPs 0.4 mmol·L-1，Taq酶 1.35 U是 DiTV-2a 的最佳PCR擴(kuò)增體系，可用于該病毒的檢測。

關(guān)鍵詞：棗癭蚊;棗癭蚊圖爾病毒;PCR

中圖分類號(hào)：S476 ? ? ? ? ? ? 文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A ? ? ? ? ? ? DOI 編碼：10.3969/j.issn.1006-6500.2021.11.018

Establishment of PCR Method for Detection of Dasineura jujubifolia Toursvirus 2 （DjTV-2a）

HE Pengpeng1，2， MA Guanghuang1，2， LIU Yuhan1，2， ZHANG Laibing1，2， XIAO Haibing1，2，3， YANG Minglu1，2，3

（1.College of Plant Science， Tarim University， Alar， Xijiang 843300， China; 2.Southern Xinjiang Key Laboratory of IPM of Tarim University， Alar， Xijiang 843300， China; 3.Scientific Observing and Experimental Station of Crop Pests in Alar.Ministry of Agriculture， Alar， Xinjiang 843300， China）

Abstract：To establish a PCR detection method for Dasineura jujubifolia toursvirus 2 （DjTV-2a）， the experiment extracted the total genomic DNA of Dasineura jujubifolia， designed DiTV-2a specific primers， the DNA template （80， 100， 120 ng） and the primer concentration （0.7， 0.8， 0.9 μmol·L-1）， dNTP （0.2， 0.3， 0.4 mmol·L-1） and Taq enzyme （1.25， 1.35， 1.45 U） were as variables， screening the optimum PCR reaction system to establish and optimize the PCR detection method of DjTV-2a by the orthogonal design. The results showed that all the nine group of PCR reaction systems from the orthogonal design could amplify and detect the virus， but the reaction system of 100 ng DNA template， 0.7 μmol·L-1 primers， 0.4 mmol·L-1 dNTPs and 1.35U Taq enzyme had the best amplification effect. For the best PCR reaction system， the optimum annealing temperature of the primers were 52 ℃ in the six treatment including 46， 48， 50， 52， 54， 56 ℃. In summary， in a 50 μL reaction system， 52 ℃ primer annealing temperature， 100 ng DNA template， 0.7 μmol·L-1 primer， 0.4 mmol·L-1 dNTPs and 1.35 U Taq enzyme is the optimum PCR amplification system for DiTV-2a which can be used for the detection of the virus.

Key words： Dasineura jujubifolia; Dasineura jujubifolia toursvirus 2（DjTV-2a） ; PCR

棗癭蚊（Dasineura jujubifolia）又名棗葉癭蚊[1]，廣泛分布于我國棗產(chǎn)區(qū)。該蟲1966年首次于山東地區(qū)發(fā)現(xiàn)并報(bào)道，鑒定為 Contarinia Sp.[2];也有 Contarinia datifolia Jiang和Dasineura datifolia 等名稱被使用[3-6]。隨著新疆紅棗產(chǎn)業(yè)的發(fā)展，棗癭蚊在新疆紅棗產(chǎn)區(qū)為害猖獗[7-8]，連年造成紅棗座果率下降、產(chǎn)果品質(zhì)下跌的嚴(yán)重影響，導(dǎo)致果農(nóng)損失嚴(yán)重[9]。課題組在研究棗癭蚊線粒體基因組時(shí)，發(fā)現(xiàn)了一種雙鏈環(huán)狀昆蟲病毒基因組，經(jīng)進(jìn)一步鑒定為棗癭蚊圖爾病毒2（Dasineura jujubifolia toursvirus 2，DjTV-2a）[10]，這種病毒是是囊泡病毒科圖爾病毒屬的第二位成員和該科唯一寄生雙翅目昆蟲的種類，可能是棗癭蚊的重要天敵之一，對(duì)棗癭蚊為害擴(kuò)散起到抑制作用。一般認(rèn)為它們?cè)谔镩g常由寄生蜂傳播[11]，因此研究其分布范圍及寄主媒介有重要意義，但棗癭蚊幼蟲感染后癥狀不明顯，從表觀上很難進(jìn)行區(qū)分，所以建立分子檢測方法十分必要。

本研究擬通過設(shè)計(jì)特異性引物和優(yōu)化反應(yīng)體系以建立 DjTV-2a 的 PCR 檢測方法，為進(jìn)一步開展 DjTV-2a 相關(guān)研究提供技術(shù)支持。

1 材料和方法

1.1 試蟲

棗癭蚊幼蟲采自塔里木大學(xué)棗園，十二團(tuán)十一連棗園，阿克蘇市新和縣，哈密市，張掖市。

1.2 試劑與儀器

TBE 緩沖液（實(shí)驗(yàn)室配制）;瓊脂糖（BIOWEST）;10×PCR buffer、Taq 酶、DNA Marker（康為世紀(jì)）;柱式 DNA 提取試劑盒（生工生物工程股份有限公司）等。

1.3 儀器

基因擴(kuò)增儀（ BSW-6T-II 上海啟步生物科技有限公司）;紫外凝膠成像儀（ Gel Doc XR+上海旦鼎國際貿(mào)易有限公司）;高速離心機(jī)（ PICO21 Thermo Fisher）;高通量組織研磨器（SCIENTZ-48寧波新芝生物科技股份有限公司）;電泳儀（DYCP-32B北京六一生物科技有限公司）;電熱恒溫水浴鍋（DK-80上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司）等。

1.4 試驗(yàn)方法

1.4.1 DNA提取 鑒于棗癭蚊蟲體較小，本試驗(yàn)采取兩種 DNA 提取方法。PCR 緩沖液提取法[12]：取3頭病蟲分別放入標(biāo)記好的3個(gè)1.5 mL EP 離心管中，加入10 μL PCR緩沖液，放置于 20 ℃ 冷凍2～3 min后，用移液槍槍頭研磨勻漿;研磨結(jié)束后再次加入40 μL PCR緩沖液和3 μL蛋白酶K，以上操作均需在冰上進(jìn)行。渦旋振蕩使樣品混勻后，將離心管置于水浴鍋中，56 ℃ 水浴 2 h 后（水浴期間多次翻轉(zhuǎn)離心管），95 ℃ 水浴5 min，水浴結(jié)束后以5 000 r·min-1離心10 min，-20 ℃保存?zhèn)溆谩Ｔ噭┖刑崛》ǎ喝⊥瑯宇^數(shù)試蟲分別進(jìn)行 DNA 提取，根據(jù)試劑盒說明進(jìn)行。

1.4.2 DNA檢測 使用微量核酸檢測儀分別檢測提取的核酸質(zhì)量和濃度，并進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.4.3 引物設(shè)計(jì) 使用primer 5根據(jù) DjTV-2a 病毒衣殼蛋白（Capsid protein，CP）基因序列設(shè)計(jì)特異性引物，引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成，預(yù)計(jì)擴(kuò)增 DNA 片段長度為 396 bp，引物序列：上游引物（F）5-AGCACTTCCACACACTGAGA-3，下游引物（R）5-AGTACTAGCAAAATGTCCACCA-3。

1.4.4 PCR反應(yīng)體系優(yōu)化 使用提取的棗癭蚊圖爾病毒 DNA 為模板，對(duì) DNA 模板用量、引物濃度、dNTP 濃度、Taq 酶用量4個(gè)因素進(jìn)行正交試驗(yàn)。

PCR反應(yīng)程序：預(yù)變性95 ℃ 3 min;變性95 ℃ 30 s、退火54 ℃ 30 s、延伸72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán);后延伸72 ℃ 3 min。

1.4.5 PCR反應(yīng)體系設(shè)計(jì) 反應(yīng)體系采用L9（34）正交設(shè)計(jì)（表1），對(duì)dNTP和模板等用量進(jìn)行優(yōu)化，每組重復(fù)3次。

1.4.6 退火溫度優(yōu)化 以期獲得最佳反應(yīng)體系，針對(duì)引物退火溫度進(jìn)行篩選，根據(jù)引物 Tm 值，設(shè)置退火溫度46～56 ℃，設(shè)置梯度為46，48，50，52，54，56 ℃。

1.4.7 靈敏度檢測 將所使用 DNA 模板按梯度稀釋：5，52，53，54，55倍，后進(jìn)行凝膠電泳檢測。

1.4.8 瓊脂糖凝膠電泳及測序 取 PCR 產(chǎn)物、DNA Marker 5 μL混合上樣液 1 μL 加入到點(diǎn)樣孔中，于 2% 瓊脂糖凝膠100 V 30 min進(jìn)行電泳;電泳結(jié)果于凝膠成像系統(tǒng)中觀察并保存。將條帶單一、清晰的 PCR 產(chǎn)物送往上海生工測序。

1.5 數(shù)據(jù)分析

測序序列在 NCBI 進(jìn)行 Blast 分析，根據(jù) PCR 擴(kuò)增產(chǎn)物電泳條帶位置、數(shù)量及彌散情況等進(jìn)行檢測方法分析。

1.6 PCR檢測方法的應(yīng)用

使用上述完善的PCR檢測體系，對(duì)塔里木大學(xué)棗園，十二團(tuán)十一連棗園，阿克蘇市新和縣，哈密市，張掖市蟲樣進(jìn)行PCR檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 DNA提取方法

PCR緩沖液提取法與試劑盒提取法的電泳結(jié)果詳見圖1。PCR 緩沖液提取法所測得的核酸濃度分別是7.5，10.3，8.6 ng·μL-1，A260/A280值在2.0左右;試劑盒提取測得的核酸濃度分別是47.9，60.7，56.3 ng·μL-1，A260/A280值在1.8左右，經(jīng)凝膠電泳檢測條帶清晰。因此，本試驗(yàn)采用試劑盒提取方法。

2.2 PCR擴(kuò)增及序列分析

PCR 擴(kuò)增目標(biāo)產(chǎn)物為396 bp，電泳圖譜顯示位置正確（圖2），經(jīng) NCBI 數(shù)據(jù)庫 Blast分析發(fā)現(xiàn)與 DjTV-2a 病毒衣殼蛋白（Capsid protein，CP）基因相似度100%，引物特異性較好。

2.3 正交設(shè)計(jì)結(jié)果

正交設(shè)計(jì)的9組擴(kuò)增結(jié)果（圖2）差異顯著，不同試驗(yàn)體系中不同組分對(duì)實(shí)驗(yàn)結(jié)果得影響各不相同，試驗(yàn)中引物用量對(duì)結(jié)果影響較大，表現(xiàn)在不同擴(kuò)增條帶的差異;其中第3組結(jié)果所得條帶最為清晰，第7組結(jié)果所得條帶則顯示不明顯;確定最優(yōu)體系為：模板100 ng，10×PCR buffer 5 μL，引物0.70 μmol·L-1，dNTPs 0.40 mmol·L-1，Taq酶 1.35 U。

2.4 退火溫度

由圖3得知，隨著引物退火溫度的改變，PCR產(chǎn)物條帶差異明顯，在退火溫度在46～56 ℃電泳條帶可見，但在52 ℃（10-12泳道）所得條帶最為清晰明亮，穩(wěn)定性最好，沒有出現(xiàn)引物二聚體和條帶彌散的現(xiàn)象，因此在優(yōu)化體系中選擇52 ℃為最佳退火溫度。2.5 靈敏度檢測

對(duì)模板DNA進(jìn)行不同濃度的稀釋，發(fā)現(xiàn)隨著稀釋條帶亮度下降，由圖得知當(dāng)稀釋倍數(shù)達(dá)到54時(shí)，擴(kuò)增條帶呈現(xiàn)不清晰，但仍能看到相應(yīng)條帶（圖4）。2.6 優(yōu)化體系檢驗(yàn)

利用上述所獲得的優(yōu)化體系進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果（圖5）得到清晰穩(wěn)定的擴(kuò)增條帶，說明優(yōu)化體系在 50 μL 反應(yīng)體系下，10×PCR buffer 5 μL，引物最佳退火溫度為52 ℃，模板 DNA 量100 ng，引物0.7 μmol·L-1，dNTPs 0.4 mmol·L-1，Taq酶 1.35U穩(wěn)定，適合作為PCR檢測棗癭蚊圖爾病毒的方法;并將產(chǎn)物送檢測序，序列結(jié)果與該病毒基因序列一致。

2.7 檢測結(jié)果

使用優(yōu)化后的PCR反應(yīng)條件，對(duì)各個(gè)采集地點(diǎn)和塔里木大學(xué)不同采集月份的蟲樣進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)：此病毒在塔里木大學(xué)和十二團(tuán)均有發(fā)現(xiàn)，且塔里木大學(xué)校園內(nèi)檢測陽性率達(dá)到10.15%，其余地域暫時(shí)沒有病毒流行（表2）;此病毒6月份開始發(fā)生，7月份在塔里木大學(xué)棗園內(nèi)大流行，此時(shí)檢測陽性率為10.5%（表3）。

3 結(jié)論與討論

PCR反應(yīng)體系中，模板DNA的質(zhì)量是后續(xù)試驗(yàn)的關(guān)鍵[13]，本研究用PCR緩沖液法和試劑盒提取法進(jìn)行比較，在檢測后發(fā)現(xiàn)試劑盒提取法所得核酸含量較高。PCR緩沖液法提取DNA缺少漂洗和除雜的過程，經(jīng)檢測OD值也不理想，可能雜質(zhì)較高沒考慮作為優(yōu)化體系模板使用，而試劑盒法有蛋白質(zhì)、其他雜質(zhì)的的分離過程，沒有有機(jī)物污染，獲得基因組DNA質(zhì)量較高[14]，通常模板用量過高條帶可能出現(xiàn)拖尾，用量過低，擴(kuò)增條帶則會(huì)不清晰[15-18]，而且模板DNA若是雜質(zhì)過多，則會(huì)影響Taq酶的活性，引物用量過高或設(shè)計(jì)原因會(huì)產(chǎn)生二聚體和非特異性擴(kuò)增，而引物用量過低，則會(huì)產(chǎn)生擴(kuò)增產(chǎn)物減少等現(xiàn)象[19-20]。通過PCR試劑組分正交設(shè)計(jì)與反應(yīng)條件優(yōu)化，引物0.70 μmol·L-1，dNTPs 0.4 mmol·L-1，Taq酶 1.35 U的50 μL反應(yīng)體系和52 ℃退火溫度擴(kuò)增效果較好。

經(jīng)過對(duì)采集地和塔里木大學(xué)內(nèi)不同采集月份的蟲樣進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)塔里木大學(xué)內(nèi)蟲樣陽性率最高，周邊團(tuán)場次之，繼續(xù)對(duì)塔里木大學(xué)內(nèi)不同月份蟲樣進(jìn)行檢測后，發(fā)現(xiàn)6月有病毒流行跡象，7月是此病毒大發(fā)生的時(shí)期，猜測這可能與寄生蜂的出現(xiàn)有關(guān)，6月份伴隨棗癭蚊寄生蜂的出現(xiàn)也加速此病毒的傳播速度與傳播范圍。

此病毒具有棗癭蚊生物防治的應(yīng)用潛力，因此該P(yáng)CR檢測方法用于后續(xù)棗癭蚊圖爾病毒種群分布及媒介寄主鑒定等研究工作，對(duì)揭示其傳播生物學(xué)具有重要意義。

參考文獻(xiàn)：

[1] JIAO K L， HAN P J， YANG M L， et al. A new species of gall midge （Diptera： Cecidomyiidae） attacking jujube， Ziziphus jujuba in China[J]. Zootaxa， 2017， 4247（4）： 487-493.

[2] 章宗江. 棗樹的一種新害蟲——棗癭蚊的研究[J]. 山東農(nóng)業(yè)科學(xué)， 1966（2）： 51-54.

[3] 袁青鋒， 周運(yùn)剛， 鄭新疆， 等. 4種殺蟲劑防控紅棗棗癭蚊效果比較[J]. 中國植保導(dǎo)刊， 2015， 35（12）： 58-59.

[4] 張仁福， 于江南， 斯迪克·米吉提， 等. 棗癭蚊幼蟲空間分布型及抽樣技術(shù)研究[J]. 新疆農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)， 2010， 33（1）： 23-26.

[5] 卜文俊. 中國癭蚊科（雙翅目）昆蟲分類研究[D]. 天津： 南開大學(xué)， 1990.

[6] 江興培. 中國癭蚊科分類初步研究[D]. 重慶： 西南農(nóng)業(yè)大學(xué)， 1990.

[7] 訾莉莉. 阿拉爾墾區(qū)棗樹“兩蟲一病”的防治研究[D]. 阿拉爾： 塔里木大學(xué)， 2018.

[8] 許瑛. 阿拉爾市棗園4種病蟲害發(fā)生動(dòng)態(tài)及黑斑病對(duì)果實(shí)品質(zhì)的影響[D]. 石河子： 石河子大學(xué)， 2017.

[9] 畢海燕， 朱曉鋒， 阿布都克尤木·卡德爾， 等. 不同藥劑對(duì)棗癭蚊的防治效果評(píng)價(jià)[J]. 新疆農(nóng)業(yè)科學(xué)， 2014， 51（5）： 915-919.

[10] WANG J， YANG M， XIAO H， et al. Genome analysis of Dasineura jujubifolia toursvirus 2， a novel ascovirus[J]. Virologica Sinica， 2020， 35（2）： 134-142.

[11] ARAI E， ISHII K， ISHII H， et al. An ascovirus isolated from Spodoptera litura （Noctuidae： Lepidoptera） transmitted by the generalist endoparasitoid Meteorus pulchricornis （Braconidae： Hymenoptera）[J]. The Journal of General Virology， 2018， 99（4）： 574-584.

[12] 宋月， 樊永亮， 武麗娟， 等. 蚜蟲內(nèi)共生菌基因組DNA提取方法的比較和優(yōu)化[J]. 植物保護(hù)學(xué)報(bào)， 2014， 41（6）： 643-648.

[13] 高麗云， 陳杰， 胡小龍， 等. 金鐵鎖SSR-PCR反應(yīng)體系的建立與優(yōu)化[J]. 云南農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)：自然科學(xué)， 2019， 34（6）： 1024-1032.

[14] 薩姆布魯克 J， 拉塞爾 DW. 分子克隆實(shí)驗(yàn)指南[M]. 黃培堂， 譯. 3版. 北京： 科學(xué)出版社， 2002.

[15] 王梅， 趙晨迪， 胡忠良， 等. CYP2C19基因多態(tài)性PCR擴(kuò)增體系的正交優(yōu)化與驗(yàn)證[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)， 2019， 38（5）： 1990-1996.

[16] 謝家楠， 郭建軍， 金道超. 白背飛虱ISSR-PCR反應(yīng)體系構(gòu)建的正交設(shè)計(jì)優(yōu)化[J]. 植物保護(hù)， 2014， 40（2）： 109-112.

[17] 劉永剛， 漆永紅， 趙麗娟， 等. 桃蚜基因組DNA提取及SSR反應(yīng)體系優(yōu)化和應(yīng)用[J]. 植物保護(hù)， 2009， 35（4）： 96-100.

[18] 張敏哲， 龐保平， 周曉榕， 等. 寬翅曲背蝗SSR反應(yīng)體系的優(yōu)化[J]. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)學(xué)報(bào)（自然科學(xué)版）， 2013， 34（3）： 26-31.

[19] 徐顯異， 陸婷， 田嘉， 等. 橡膠草及其近緣種ISSR反應(yīng)體系及擴(kuò)增程序的優(yōu)化[J]. 分子植物育種， 2019， 17（12）： 4007-4015.

[20] 賈新平， 孫曉波， 梁麗建， 等. 二月蘭SSR-PCR反應(yīng)體系的優(yōu)化及引物篩選[J]. 中國農(nóng)學(xué)通報(bào)， 2017， 33（5）： 40-46.

收稿日期：2021-08-04

基金項(xiàng)目：兵團(tuán)財(cái)政科技計(jì)劃資助（2020DA003，2019DA001））;塔里木大學(xué)研究生科研創(chuàng)新項(xiàng)目（TDGRI202019）

作者簡介：賀鵬鵬（1995—），男，河南商丘人，在讀碩士生，主要從事農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治方面研究。

通訊作者簡介：楊明祿（1976—），男，山東夏津人，教授，主要從事農(nóng)業(yè)昆蟲與害蟲防治方面研究。