錢(qián) 蓉 柴紅梅 趙永昌 陳玉惠 陳衛(wèi)民

（1. 西南林業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，云南 昆明 650233；2. 云南省農(nóng)業(yè)科學(xué)院生物技術(shù)與種質(zhì)資源研究所，云南 昆明 650221；3. 云南省農(nóng)業(yè)生物技術(shù)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650223；4. 農(nóng)業(yè)部西南作物基因資源與種質(zhì)創(chuàng)制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，云南 昆明 650223）

茶樹(shù)菇（Cyclocybe aegerita）是一個(gè)包含多個(gè)形態(tài)學(xué)上相似群體的復(fù)合種群[1]，多生長(zhǎng)于柳樹(shù)或茶樹(shù)腐朽的枝椏部位。茶樹(shù)菇作為一種美味的食用類(lèi)真菌，在東亞地區(qū)被廣泛種植，為我國(guó)的第九大類(lèi)人工培養(yǎng)食用菌，年產(chǎn)量約50萬(wàn)t[2]。利用ITS和線粒體小亞基（mtSSU rDNA）序列，研究者對(duì)我國(guó)西南地區(qū)的茶樹(shù)菇復(fù)合群進(jìn)行了系統(tǒng)研究，發(fā)現(xiàn)這些菌株顯示出高多態(tài)性，同時(shí)還定義了一個(gè)新種C. salicacola[3]。因而，系統(tǒng)分析我國(guó)的茶樹(shù)菇菌株資源非常必要，同時(shí)也為種質(zhì)資源的發(fā)掘與利用奠定基礎(chǔ)。

以往研究中，茶樹(shù)菇復(fù)合群系統(tǒng)研究多使用線粒體小亞基mtSSU序列[4-7]。研究者從茶樹(shù)菇中克隆獲得了完整的mtSSU序列，并構(gòu)建了DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)[8-9]。群體分析顯示，mtSSU的V4?6?9區(qū)序列能夠?qū)⑻镱^菇屬內(nèi)不同種很好的區(qū)分開(kāi)來(lái)，而同一物種來(lái)自于不同菌株中的該區(qū)域序列則一致[10]。依據(jù)該序列特征，從世界各地收集的菌株被分為3個(gè)大的類(lèi)群[11]，而我國(guó)西南地區(qū)的茶樹(shù)菇菌株也被分為3個(gè)類(lèi)群[3]。

在真菌中，ITS序列作為最常用的分子標(biāo)記，常用于物種識(shí)別及系統(tǒng)學(xué)研究[12-15]，然而，ITS序列變異（菌株內(nèi)或菌株間）直接影響了菌株鑒定和系統(tǒng)學(xué)分析[16-30]。對(duì)于一些ITS序列高度分化的物種，子代同核體雜交后產(chǎn)生的菌株存在ITS異源的現(xiàn)象[31]。茶樹(shù)菇復(fù)合群包括多個(gè)群體[32]，本研究中也發(fā)現(xiàn)了一些菌株存在ITS異源現(xiàn)象，分析它們的結(jié)構(gòu)特征及系統(tǒng)關(guān)系有助于深入理解茶樹(shù)菇類(lèi)群的分化特征。

1 材料與方法

1.1 菌株

本實(shí)驗(yàn)收集了15個(gè)茶樹(shù)菇菌株，分別來(lái)自福建（AC0001，AC0021，AC0005 和AC0007），云南（YAASM2135 和 YAASM2136）和江西（AS-1，AS-2，CHA3，CHA5，YSG，C45，C89，YSD1H和BAICHA）。所有的菌株保存在YPD 培養(yǎng)基（0.2% 酵母提取物，0.2% 蛋白胨，2% 葡萄糖和2% 瓊脂）上。另有27個(gè)菌株的ITS和mtSSU序列來(lái)自于Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)（表1）。

表 1 來(lái)源于Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)的序列特征Table 1 Sequence characterization from Genbank database

續(xù)表 1

1.2 單孢分離

分別收集8個(gè)菌株（AC0001，AC0021，AC0005，AC0007，AS1，AS2，YSD1H 和CHA3）子實(shí)體產(chǎn)生的孢子，用無(wú)菌水稀釋后涂布到Y(jié)PD培養(yǎng)基上，置于25 ℃培養(yǎng)箱中，挑取萌發(fā)的菌落進(jìn)行轉(zhuǎn)接，在顯微鏡下觀察菌絲的鎖狀結(jié)構(gòu)，來(lái)判定菌株是否為同核體。

1.3 DNA提取

實(shí)驗(yàn)菌株接種到Y(jié)PD培養(yǎng)基上，25 ℃培養(yǎng)7～10 d，收集1 g的菌絲置于液氮中研磨后，用DNA提取試劑盒（Qiagen's DNeasy Plant Mini kit）進(jìn)行純化提取。

1.4 PCR擴(kuò)增、克隆及測(cè)序

使用3對(duì)引物V4F（CTTACTATAAGTGTTGTC）和V4B（TATTCTACTTAGTATCTT），V6F（TTAGTCGGTCTCGGAGCA）和V6B（TGACGA CAGCC ATGCAAC），以及V9F（CCGTGATGA ACTAACCGT）和V9B（TTCCAGTACAA GCTA CCT）分別擴(kuò)增mtSSU的V4，V6和V9區(qū)[10]。利用引物對(duì)ITS5（GGAAGTAAAAGTCGTAACAA GG）和ITS4（TCCTCC GCTTATTGATATGC）擴(kuò)增ITS1-5.8S-ITS2區(qū)[33]。反應(yīng)體系為：12.5 μL 2×TaqPCR MasterMix，1 μL DNA，1 μL正/反向引物，9.5 μL無(wú)菌水。擴(kuò)增后的產(chǎn)物膠回收后直接測(cè)序。序列使用Chromas Lite 2.1.1進(jìn)行查看，產(chǎn)生雙峰序列的產(chǎn)物克隆到PGM?T載體中進(jìn)一步測(cè)序。

1.5 依據(jù)ITS和mtSSU序列的系統(tǒng)分析

使用MEGA6軟件包中的MUSCLE對(duì)ITS和mtSSU序列進(jìn)行多序列比對(duì)[34]，去除兩端的模糊序列后，構(gòu)建最大相似性樹(shù)（Maximum Likelihood，ML），最優(yōu)模型分別為HKY+G和T92+I，分支可信值采用1 000次重復(fù)計(jì)算分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 供試菌株的測(cè)序結(jié)果及ITS異源序列

供試茶樹(shù)菇菌株mtSSU和ITS測(cè)序結(jié)果（表2）顯示，15個(gè)菌株的mtSSU中的V4、V6和V9區(qū)長(zhǎng)度分別為193～282、156～165 nt和246 nt。15個(gè)菌株中來(lái)自福建和江西的各4個(gè)菌株的ITS產(chǎn)物直接測(cè)序呈現(xiàn)出套峰（雙峰），表明這些菌株中的區(qū)存在異源序列。

表2 供試菌株的序列特征Table 2 Sequence characterization of tested strains

對(duì)8個(gè)ITS區(qū)存在異源序列的菌株分別挑取10～15個(gè)子代同核體進(jìn)行測(cè)序。結(jié)果顯示，依據(jù)測(cè)序序列，每個(gè)菌株的子代同核體都被分為2種類(lèi)型，type1和type2（表3、圖1），表明這些異核體菌株可能為帶有異源ITS的同核體雜交而成。

比對(duì)分析后發(fā)現(xiàn)，變異位點(diǎn)均位于ITS1和ITS2區(qū)，這些位點(diǎn)有單核苷酸多態(tài)性或插入/缺失等類(lèi)型，數(shù)量3～8個(gè)不等，其中在181位點(diǎn)處，所有的菌株中均存在插入/缺失現(xiàn)象（圖1）。這些菌株中ITS序列的相似性為97.71%～99.50%（表3）。

圖1 異源ITS序列特征Fig. 1 Sequence characterization of heterologous ITS

表3 ITS序列特征Table 3 Sequence characterization of ITS

2.2 ITS序列變異和嵌合特征

為了分析克隆序列的真實(shí)性，從8個(gè)ITS異源菌株的PCR產(chǎn)物中分別挑取8～12個(gè)克隆子進(jìn)行測(cè)序，各獲得2或4種差異序列，去除掉與同核體相同的序列后，在AC0001、AS1和YSD1H菌株中各發(fā)現(xiàn)2種嵌合序列，占克隆子比例的30.00%～41.67%（表4）。序列比對(duì)顯示，3個(gè)菌株的ITS1和ITS2區(qū)發(fā)生了模板轉(zhuǎn)換，其中的415～455區(qū)和555～570區(qū)為轉(zhuǎn)換熱點(diǎn)（圖2）。

表4 ITS片段克隆子序列特征Table 4 Sequence characterization of ITS clones

圖2 ITS序列模板轉(zhuǎn)換Fig. 2 Template switching regions of ITS sequences

2.3 mtSSU序列系統(tǒng)樹(shù)特征

利用15個(gè)供試菌株的mtSSU序列和來(lái)自Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)的26個(gè)菌株mtSSU序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。結(jié)果顯示，它們被分為2個(gè)類(lèi)群：類(lèi)群1）包括C. wrightii和C. salicacola兩個(gè)種；類(lèi)群2）包括3個(gè)分支mtI，mtII和mtIII。3個(gè)C. salic-acola菌株和來(lái)自歐洲的菌株WT10/12聚在一起，而來(lái)自我國(guó)東南地區(qū)的一些菌株（除去AC0021）和來(lái)自南美的菌株WT44聚在mtI分支上。分支mtII上聚著CHA5、AC0001、BAICHA、YSG和來(lái)自東亞的Ac2，而剩余的菌株聚在mtIII分支上（圖3）。

圖3 依據(jù)mtSSU V4?V6?V9區(qū)序列構(gòu)建的聚類(lèi)樹(shù)Fig. 3 Phylogenetic tree constructed by mitochondrial small subunit(mtSSU) rDNA V4-V6-V9 sequences

2.4 ITS序列系統(tǒng)樹(shù)特征

利用供試15個(gè)菌株的ITS序列和來(lái)自Genbank數(shù)據(jù)庫(kù)的10株云南菌株的ITS序列構(gòu)建的ML樹(shù)，其結(jié)果與mtSSU系統(tǒng)樹(shù)的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)不同。15個(gè)實(shí)驗(yàn)菌株被分為3個(gè)群體，RI，RII，和RIII，其中RI又分為4個(gè)分支：Ria，RIb，RIc和RId。云南地區(qū)的菌株被分到了2個(gè)大的群體RI和RII中。此外，同1個(gè)菌株的異源ITS被分到不同類(lèi)群中，如AC0001菌株的type2位于RIc分支上，而type1型位于RIII群體（圖4）。

圖4 依據(jù)ITS序列構(gòu)建的聚類(lèi)樹(shù)Fig. 4 Phylogenetic tree constructed by ITS rDNA sequences

3 結(jié)論與討論

ITS序列是真菌系統(tǒng)學(xué)研究中最常用的分子標(biāo)記。然而，研究發(fā)現(xiàn)一些真菌物種中存在的基因組內(nèi)ITS異源可能會(huì)給物種鑒定和系統(tǒng)學(xué)研究帶來(lái)干擾[23,28-29,35]。

本研究在8個(gè)茶樹(shù)菇菌株中發(fā)現(xiàn)了ITS異源特征，子代同核體測(cè)序分析表明了它們可能是攜帶異源ITS序列的同核體雜交形成的，這與前期自然環(huán)境中其它物種（Gymnopus dichrous和Hygrocybe flavescens/chlorophana）存在的現(xiàn)象類(lèi)似[31]。然而攜帶不同異源ITS的菌株為何能夠在傳代過(guò)程中穩(wěn)定保持該序列，而不是如大多數(shù)菌株一樣最終演變成一致的序列，其潛在的遺傳特征值得后期深入研究。

在使用DNA混合模板時(shí)，PCR擴(kuò)增能夠產(chǎn)生嵌合序列[36-37]，從而產(chǎn)生不正確的序列信息。在本研究的8個(gè)ITS異源菌株中，也發(fā)現(xiàn)了ITS嵌合序列。有研究者也曾對(duì)Gymnopus dichrou菌株ITS區(qū)域的復(fù)制模板轉(zhuǎn)換進(jìn)行了研究[31]，發(fā)現(xiàn)一些區(qū)域是交換的熱點(diǎn)，這與本研究中發(fā)現(xiàn)的結(jié)果相似。然而，目前還不清楚造成模板轉(zhuǎn)換的原因是否與DNA二級(jí)結(jié)構(gòu)相關(guān)。這些結(jié)果也提示ITS雜合的菌株中提取該序列信息時(shí)，獲取同核體ITS序列非常必要，而直接獲得的克隆子可能包含錯(cuò)誤的序列信息。

依據(jù)ITS和mtSSU V4?6?9序列構(gòu)建的聚類(lèi)樹(shù)在拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)上存在差異，如從云南收集的8個(gè)菌株在ITS樹(shù)上被非為2個(gè)大的類(lèi)群，而在mtSSU樹(shù)上則聚在一起。另外，來(lái)自同一菌株的異源ITS序列分布到不同的類(lèi)群中，如AC0001，AC0021，AC0007和YSD1H菌株。以上結(jié)果表明，茶樹(shù)菇ITS多樣性較高，異源現(xiàn)象普遍存在，因此，在菌株鑒定和系統(tǒng)構(gòu)建時(shí)，需要充分考慮異源ITS序列的差異對(duì)菌株鑒定的影響。