任金瑞，李均同，趙效南，吳香菊，王曦，叢曉燕，戴美學(xué)，杜以軍，劉玉慶，齊靜

（1.山東師范大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，山東 濟南 250014；2.山東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院畜牧獸醫(yī)研究所/山東省畜禽疾病防治與繁育重點實驗室，山東 濟南 250100）

中國肉鴨數(shù)量和肉鴨產(chǎn)業(yè)位居世界第一［1］。鴨疫里默氏桿菌是水禽特別是肉鴨養(yǎng)殖中最重要的細菌性疾病之一，主要引起1～8周齡特別是2～3周齡雛鴨發(fā)病和死亡，并以纖維素性心包炎、肝周炎、氣囊炎、腦膜炎等為病理特征，死亡率達50%左右，與大腸桿菌引起的臨床特征非常相似，且二者的混合感染現(xiàn)象非常嚴(yán)重［2-5］；該菌也會導(dǎo)致5～17周齡鵝感染（感染率9.9%）和12～19周齡火雞發(fā)?。òl(fā)病率0.5%）［6］。大腸桿菌和沙門氏菌對雞、鴨、鵝等家禽的混合感染也非常普遍和嚴(yán)重［7-10］。這3種革蘭氏陰性致病菌血清型眾多且宿主范圍廣，給禽類養(yǎng)殖帶來巨大的危害和經(jīng)濟損失，是禽類感染的常見重要病原菌。由這些病原菌導(dǎo)致相關(guān)食源性感染危及人類公共衛(wèi)生安全，因此建立一套這3種常見病原菌單一或混合感染的快速檢測體系意義重大。

PCR技術(shù)在臨床診斷中的應(yīng)用已較為廣泛［11-13］，多重PCR檢測方法也得到了快速發(fā)展和應(yīng)用［14，15］，該技術(shù)檢測成本低、效率高，可實現(xiàn)核酸水平上疾病的快速檢測和診斷。因此，本試驗通過選擇鴨疫里默氏桿菌的ompA、大腸桿菌的phoA和沙門氏菌的fimW保守基因的特異性引物，構(gòu)建了多重PCR檢測體系，優(yōu)化了引物的退火溫度和使用濃度等反應(yīng)條件，檢測了其特異性和敏感性，并在臨床樣本中進行了吻合性檢測，實現(xiàn)了從臨床病料中直接、快速、準(zhǔn)確診斷這3種病原菌的單一或混合感染，以期防控細菌性疾病感染，減少對養(yǎng)禽業(yè)造成的經(jīng)濟損失。

1 材料與方法

1.1 菌株

1.1.1 標(biāo)準(zhǔn)菌株 大腸桿菌ATCC 25922和沙門氏菌ATCC 13076，購自美國菌種保藏中心；鴨疫里默氏桿菌Ra50，2018年從四川病鵝的肝臟中分離并經(jīng)質(zhì)譜鑒定，由本實驗室保存。

1.1.2 特異性檢測所用菌株 銅綠假單胞菌ATCC 27853、金黃色葡萄球菌ATCC 29213，購自美國菌種保藏中心；肺炎克雷伯氏菌、豬鏈球菌、魏氏梭菌、屎腸球菌、糞腸球菌，均由本研究室分離、質(zhì)譜鑒定并保存。

1.2 試驗方法

1.2.1 引物選擇 檢測鴨疫里默氏桿菌選擇林樹乾等［11］根據(jù)ompA基因序列設(shè)計的引物，檢測大腸桿菌選擇許一平等［14］根據(jù)phoA基因序列設(shè)計的引物，檢測沙門氏菌選擇張富友等［12］根據(jù)fimW基因序列設(shè)計的引物（表1），由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌各自保守基因PCR引物序列

1.2.2 菌株DNA提取及在DNA和菌水平的定量 鴨疫里默氏桿菌Ra50接種于4 mL TSB培養(yǎng)基中（含2%胎牛血清），置5%CO2搖床上，37℃、200 r/min培養(yǎng)16 h；大腸桿菌ATCC 25922和沙門氏菌ATCC 13076分別接種于4 mL LB培養(yǎng)基中，37℃搖床200 r/min培養(yǎng)16 h。培養(yǎng)液10 000 r/min離心5 min，收集沉淀，水煮法提取基因組DNA，Nanodrop 2000分光光度計測定其DNA濃度，微量平板計數(shù)法測定菌落數(shù)量［16］。

1.2.3 單一PCR體系的驗證 將3種細菌基因組DNA用ddH2O稀釋至50 ng/μL作為模板，對表1中的引物分別進行單一PCR體系的驗證。PCR反應(yīng)體系：10×reaction buffer（20 mmol/L Mg2+plus）2.5μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）2.0 μL，上、下游引物（10μmol/L）各1.0μL，rTaq（5 U/μL）0.2μL，細菌DNA模板（50 ng/μL）1.0 μL，ddH2O補足至25μL。PCR反應(yīng)條件：95℃3 min；95℃30 s，55℃30 s，72℃45 s，30個循環(huán)；72℃10 min。PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.4 多重PCR體系的組裝和引物濃度的優(yōu)化將3對引物ompA F/R、phoA F/R、fimWF/R按以下5種終濃度（μmol/L）組合配制三重PCR體系：0.4、0.4、0.4，0.6、0.2、0.2，0.60、0.20、0.28，0.60、0.28、0.28，0.60、0.28、0.20，3種細菌DNA模板（50 ng/μL）各1μL，10×reaction buffer（20 mmol/L Mg2+plus）2.5μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）2.0μL，rTaq（5 U/μL）0.2μL，ddH2O補足至25μL。在55℃退火溫度下進行PCR擴增，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.5 多重PCR體系退火溫度的優(yōu)化 按最佳引物對的終濃度量添加3對上、下游引物（10μmol/L），3種細菌DNA模板（50 ng/μL）各1 μL，10×reaction buffer（20 mmol/L Mg2+plus）2.5 μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）2.0μL，rTaq（5 U/μL）0.2μL，ddH2O補足至25μL。退火溫度為53～63℃，溫度梯度為1℃，按1.2.3中單一PCR反應(yīng)條件進行擴增，PCR產(chǎn)物用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測。

1.2.6 多重PCR體系的特異性檢測 用細菌基因組DNA提取試劑盒（杭州博日科技股份有限公司）說明書分別提取銅綠假單胞菌、金黃色葡萄球菌、肺炎克雷伯氏菌、豬鏈球菌、魏氏梭菌、屎腸球菌、糞腸球菌7種病原菌基因組DNA。以鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌基因組DNA混合物為陽性對照，以生理鹽水為陰性對照，分別以3種致病菌及上述7種病原菌單一基因組DNA、10種病原菌基因組DNA混合物為模板，按最佳優(yōu)化條件進行特異性檢測。

1)預(yù)制式智能控制柜至預(yù)制艙式二次組合設(shè)備及預(yù)制式組合二次設(shè)備的光纜連接，包括各智能終端、合并單元至保護裝置和對時裝置的光纜均采用預(yù)制光纜。

1.2.7 多重PCR體系的敏感性檢測 經(jīng)Nanodrop 2000測定DNA濃度后，用ddH2O分別將鴨疫里默氏桿菌Ra50、大腸桿菌ATCC 25922和沙門氏菌ATCC 13076基因組DNA稀釋至1×103pg/μL，在此基礎(chǔ)上10倍梯度稀釋7個梯度，至1×10-4pg/μL，以系列稀釋后的DNA為模板，按最佳優(yōu)化條件進行敏感性檢測。

將鴨疫里默氏桿菌Ra50、大腸桿菌ATCC 25922和沙門氏菌ATCC 13076菌落計數(shù)后調(diào)整至1×108cfu/mL，用無菌生理鹽水10倍梯度稀釋，同一稀釋度的3種菌各取1 mL混合，水煮法提取總DNA，按最佳優(yōu)化條件進行敏感性檢測。

1.2.8 多重PCR檢測體系的臨床應(yīng)用

（1）臨床鴨場分離獲得的3種病原菌的吻合性檢測：2019年從山東省曹縣、單縣等地養(yǎng)鴨場的病鴨器官組織中分離得到48株鴨疫里默氏桿菌、55株大腸桿菌和48株沙門氏菌，分別經(jīng)16S rDNA測序鑒定并保存。用最佳優(yōu)化條件下的多重PCR體系對3種病原菌進行吻合性檢測。

（2）臨床攻毒雞病料組織中病原菌的檢測：3日齡SPF雛雞隨機分為2組，每組40只，試驗組口服沙門氏菌ATCC 13076菌液，每只雞100μL（109cfu/mL），對照組口服等量無菌PBS緩沖液，隔離器內(nèi)分別飼養(yǎng)至40日齡。試驗組隨機選擇10只存活的雛雞，經(jīng)頸動脈放血處死，每只各取肝臟0.3 g，對照組隨機取1只雞的肝臟組織0.3 g，分別加1 mL PBS緩沖液，研磨取上清，按組織基因組DNA提取試劑盒（杭州博日科技股份有限公司）說明書提取總DNA。以沙門氏菌ATCC 13076的基因組DNA為陽性對照，用最佳優(yōu)化條件的多重PCR體系進行檢測。

2 結(jié)果與分析

2.1 3對引物的PCR反應(yīng)驗證

本試驗選擇的鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌保守基因的引物均能擴增出清晰明亮且符合預(yù)期大小的目的條帶，其中大腸桿菌phoA基因片段622 bp，鴨疫里默氏桿菌ompA基因片段592 bp，沙門氏菌fimW基因片段495 bp（圖1）。

圖1 3對引物的PCR擴增結(jié)果

2.2 多重PCR反應(yīng)體系引物濃度優(yōu)化

對3對引物按照5種不同終濃度配比進行多重PCR反應(yīng)，結(jié)果（圖2）顯示，ompA、phoA、fimW3個引物對終濃度分別為0.60、0.28、0.20μmol/L時擴增效果最佳。優(yōu)化后的PCR反應(yīng)體系為：ompA、phoA、fimW 3個引物對（上、下游引物濃度均為10μmol/L）分別為1.5、0.7、0.5μL，10×reaction buffer 2.5μL，dNTP Mix（2.5 mmol/L）2.0 μL，rTaq（5U/μL）0.2μL，3種細菌DNA模板（50 ng/μL）各1μL，ddH2O 14.6μL。

圖2 不同引物濃度下多重PCR擴增結(jié)果

2.3 多重PCR反應(yīng)體系最佳退火溫度篩選

圖3 不同退火溫度下多重PCR擴增結(jié)果

2.4 多重PCR反應(yīng)特異性檢測

多重PCR擴增結(jié)果（圖4）顯示，只有鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌基因組單一和混合DNA模板、3種致病菌的DNA混合物及包含這3種致病菌的10種菌的DNA混合物可以擴增出對應(yīng)大小的特異目的條帶，其他7種病原菌單一DNA模板和陰性對照均未擴增出目的條帶，說明多重PCR檢測體系特異性良好。

圖4 多重PCR方法特異性檢測結(jié)果

2.5 多重PCR反應(yīng)敏感性檢測

在DNA水平，多重PCR方法的最低檢測限為1 pg/μL（圖5A）。在菌水平上，多重PCR方法的最低檢測限為1×104cfu/mL（圖5B）。

圖5 多重PCR方法敏感性試驗結(jié)果

2.6 多重PCR反應(yīng)的臨床應(yīng)用

利用優(yōu)化的多重PCR反應(yīng)體系對2019年從山東省曹縣、單縣等地分離鑒定獲得的48株鴨疫里默氏桿菌、55株大腸桿菌和48株沙門氏菌進行吻合度檢測，結(jié)果與16S rDNA測序鑒定結(jié)果完全吻合，無漏檢、錯檢情況，說明多重PCR體系應(yīng)用于3種病原菌檢測的準(zhǔn)確性和特異性好。

用腸炎沙門氏菌對SPF雛雞進行攻毒感染，并用優(yōu)化后的多重PCR體系進行檢測，結(jié)果（圖6）表明，試驗組的10只雞都能檢測到與陽性對照一致的沙門氏菌的特異性目的條帶，特異性達100%，說明多重PCR體系能夠?qū)崿F(xiàn)從臨床病料中直接檢測病原菌的感染。

圖6 臨床分離株多重PCR檢測結(jié)果

3 討論與結(jié)論

由于禽類感染鴨疫里默氏桿菌的臨床癥狀與其他革蘭氏陰性致病菌如大腸桿菌、沙門氏菌、巴氏桿菌等的臨床癥狀非常類似，因此僅憑臨床的病理特征難以準(zhǔn)確診斷。傳統(tǒng)的分離培養(yǎng)鑒定和免疫學(xué)檢測方法費時費力，靈敏度較低，如膠體金法在鴨疫里默氏桿菌檢測中靈敏度僅為106cfu/mL［17］。臨床病例中多種細菌混合感染的現(xiàn)象非常嚴(yán)重，分子檢測方法如單一PCR，能達到較高的靈敏度，但一次只能檢測一種病原菌，不能盡快對臨床中混合感染的情況明確病原?；诖?，本試驗建立了針對鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌和沙門氏菌的多重PCR檢測方法，以實現(xiàn)3種重要病原菌單一或混合感染的快速檢測。

在多重PCR檢測體系中，基因的選擇非常關(guān)鍵。用分子方法診斷鴨疫里默氏桿菌的基因有16SrRNA［13，18］、gyrB［19］、dnaB［20］、GroEL［21］和ompA［11］，其中ompA基因編碼的外膜蛋白包含C端保守區(qū)，存在于鴨疫里默氏桿菌標(biāo)準(zhǔn)株和所有血清型的參考株中［21-24］，因此最適合用于鴨疫里默氏桿菌的檢測。沙門氏菌檢測常用的基因有invA［14，18，20，25］、fimY［26］、ssaQ［27］、fimW［28］，其中fimW是Ⅰ型鞭毛負(fù)調(diào)控蛋白基因，與invA相比，fimW廣泛存在于各種不同血清型的沙門氏菌中，在Salmonella enterica中的同源性超過98%［28］，漏檢或假陽性的概率較低。堿性磷酸酶（alkaline phosphatase）基因phoA作為大腸桿菌的管家基因，存在于各種大腸桿菌菌株中，適合于大腸桿菌的PCR檢測［18，20，29，30］。本試驗 分別選擇了鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌的高度保守基因ompA、fimW和phoA，建立了特異的多重PCR檢測方法。

本試驗對退火溫度、引物濃度等條件進行優(yōu)化，建立了快速、準(zhǔn)確的多重PCR體系，能夠同時檢測鴨疫里默氏桿菌、大腸桿菌、沙門氏菌3種致病菌，與金黃色葡萄球菌、銅綠假單胞菌等7種其他常見病原菌無交叉反應(yīng)，具有很好的特異性。在敏感性檢測中，細菌水平上最低檢出限為1×104cfu/mL，DNA水平上最低檢出限為1 pg/μL。Wei［18］、Hu［20］等建立的多重PCR方法，選擇了invA檢測沙門氏菌，靈敏度分別為104cfu/mL和10 pg/μL。本檢測方法在菌水平上的靈敏度與他們的達到同一數(shù)量級水平，但在DNA水平上比Wei等［18］的方法提高了10倍，且檢測宿主從單一的鴨擴展到了雞、鵝、火雞等不同的禽類，進一步提高了現(xiàn)有的檢測水平和能力。

本研究建立的多重PCR檢測體系操作簡單、快速，高效且成本較低，具有良好的特異性和較高的敏感性，適用于禽類3種常見重要致病菌單一或混合感染的臨床和實驗室快速診斷、流行病學(xué)調(diào)查以及對應(yīng)治療藥物的快速篩選等，為疾病的快速預(yù)警和防控提供了重要的參考依據(jù)。