楊豐榕,高建萍,李春燕
(內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院,呼和浩特 010110)
生菜子,菊科植物萵苣(Lactuca satyaL.)的干燥種子,又名黑苣勝,是蒙藥方劑中較常用的藥材之一。蒙醫(yī)理論中認(rèn)為其具有消食、調(diào)理胃火等功效,不僅可用于腹部鼓脹,面部浮腫等肝病,還可以治療嘔吐以及飲食后肝區(qū)疼痛等[1]。現(xiàn)代藥理研究后發(fā)現(xiàn)生菜子具有降血脂[2]、中樞抑制[3]、抗心律失常[4]等功效,但由于對(duì)生菜子的研究較少,其所含化學(xué)成分不明確,相關(guān)藥理活性的作用機(jī)制尚不清楚。
經(jīng)項(xiàng)目前期研究發(fā)現(xiàn)生菜子含有的主要化學(xué)成分之一為多糖,而多糖的多種藥理活性中包括降血脂[5]、降血糖[6-8]、抗氧化[9-11]等,其中多糖降血脂的機(jī)制包括直接降低體內(nèi)膽固醇、減少過氧化物生成等[12],結(jié)合文獻(xiàn)中生菜子的降血脂作用,因此本文將生菜子多糖定為研究對(duì)象。
多糖的提取方法種類較多,有醇水法[13]、超聲法[14]、酶法[15]、微波法[16]等,其中最常用的還是醇水法,通過設(shè)計(jì)合理的正交試驗(yàn)得到最佳工藝。誤差反向傳播神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),簡(jiǎn)稱為BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò),是人工神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)中的機(jī)器學(xué)習(xí)方法[17-18]。本研究旨在將BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法與生菜子多糖提取的正交試驗(yàn)結(jié)合,利用BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法實(shí)現(xiàn)過程模擬,考察細(xì)微變化對(duì)提取結(jié)果的影響,進(jìn)而建立優(yōu)于正交試驗(yàn)的生菜子多糖的最佳提取方法,同時(shí)研究生菜子多糖結(jié)合膽酸鹽能力從而實(shí)現(xiàn)對(duì)生菜子降血脂作用機(jī)制的初步研究,藉此實(shí)現(xiàn)對(duì)生菜子的深入研究并為多糖降血脂功效的研究提供部分理論依據(jù)。
生菜子,購自內(nèi)蒙古天力藥業(yè),由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)生藥學(xué)教研室渠弼教授鑒定為菊科植物萵苣(Lactuca satyaL.)的干燥黑色種子。膽酸鈉、牛黃膽酸鈉、甘氨膽酸鈉(上海源葉試劑公司)、葡萄糖(040510 天津市化學(xué)試劑三廠),其余試劑均為國產(chǎn)分析純。
752-型-紫外分光光度計(jì)(上海光譜儀器有限公司)、電子天平(AB135-S;METTLER TOLEDO,TA5003W,上海菁海儀器有限公司)、FZ-600型酸度計(jì)(成都世紀(jì)方舟科技公司)、旋蒸儀(N-1300D-WB)
1.3.1 生菜子預(yù)處理 生菜子藥材經(jīng)粉碎后,先經(jīng)石油醚脫脂,再以95%乙醇除低聚糖,后將藥材粉末干燥備用。
1.3.2 生菜子多糖提取工藝 采用水醇法:預(yù)處理生菜子粉末+蒸餾水→煎煮→真空抽濾→濃縮→80%醇沉→得生菜子多糖,依據(jù)公式(1)計(jì)算多糖得率。
1.3.3 單因素實(shí)驗(yàn) 實(shí)驗(yàn)采用的提取溫度分別選擇50℃、60℃、70℃、80℃、90℃、100℃,提取時(shí)間選擇0.5、1、1.5、2、2.5、3 h,提取次數(shù)選擇1、2、3、4次,溶劑倍量定為10、20、30、40、50、60倍,將以上4個(gè)因素作為生菜子多糖得率的主要影響因素進(jìn)行單因素考察實(shí)驗(yàn)。
1.3.4 正交試驗(yàn) 以提取溫度(A)、提取時(shí)間(B)、提取次數(shù)(C)、溶劑倍量(D)為影響因素,以多糖得率作為指標(biāo)展開正交設(shè)計(jì)試驗(yàn)。
1.3.5 基于正交設(shè)計(jì)的BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)優(yōu)化[19-21]以正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)中影響生菜子多糖得率的4 個(gè)主要因素作為4個(gè)輸入節(jié)點(diǎn)建立的B P 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)輸入層,以得率作為輸出節(jié)點(diǎn)建立輸出層,將綜合評(píng)分作為評(píng)價(jià)指標(biāo)。采用MAT LAB 7.0軟件實(shí)施編程,其中隱含層傳遞函數(shù)最終選擇tansig 雙曲正切傳遞函數(shù),而輸出層傳遞函數(shù)則選擇purelin線性傳遞函數(shù)。
1.3.6 生菜子多糖體外結(jié)合膽酸實(shí)驗(yàn)
(1)樣品制備。取生菜子藥材粗粉,44倍蒸餾水,89℃提取1.6 h,提取4次,得生菜子多糖提取液。濃縮后,以60%乙醇、80%乙醇分級(jí)醇沉、90%乙醇直接醇沉,得到3 個(gè)樣品,分別為:60%醇沉生菜子多糖、80%醇沉生菜子多糖、生菜子粗多糖。
(2)膽酸鹽標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制[22]
步驟:(1)以磷酸緩沖溶液(0.1 mol/L、pH 6.3)配制0.3 mmol/L 的?;悄懰徕c(STC)、甘氨膽酸鈉(SGC)和膽酸鈉(SC)溶液,備用;(2)分別取上述膽酸鹽溶液0、0.1、0.5、1.0、1.5、2.0、2.5 mL 于10 mL 具塞試管中,以磷酸緩沖溶液補(bǔ)充至2.5 mL;(3)加入7.5 mL 硫酸溶液(質(zhì)量分?jǐn)?shù)60%);(4)70℃水浴20 min 冰浴5 min;(5)于387 nm處測(cè)定吸光度值;(6)以吸光度值和膽酸鹽濃度繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。
(3)膽酸鹽結(jié)合實(shí)驗(yàn)。取1 mL 的多糖溶液(粗多糖,60%醇沉,80%醇沉,分別配置成0.5、1、1.5、2、2.5、3 mg/mL)于10 mL 具塞試管中,加入1 mL HCl 溶液(0.01 mol/L),37℃恒溫1 h,以NaOH溶液(0.1 mol/L)調(diào)節(jié)pH 6.3,隨后加入4 mL 胰酶(10 mg/mL,pH 6.3 的0.1 mol/L 磷酸緩沖液配制),于37℃恒溫震蕩1 h 后,每個(gè)樣品中分別再加入4 mL 不同的膽酸鹽溶液,于37℃恒溫振蕩1 h后,待膽酸鹽被充分結(jié)合后,4000 r/min,離心20 min。上清液按1.3.6.2項(xiàng)下方法測(cè)定膽酸鹽含量。
單因素考察結(jié)果見圖1~4。當(dāng)生菜子多糖的提取溫度為50℃~70℃時(shí),多糖得率與溫度成正比,高溫促使多糖的溶出加速,但是當(dāng)溫度超過70℃時(shí),高溫可能導(dǎo)致使多糖發(fā)生降解或者一定程度的糊化,從而使多糖的得率下降;當(dāng)提取時(shí)間為0.5~1.0 h 時(shí),時(shí)間與多糖得率成正比,當(dāng)提取時(shí)間超過1.5 h 時(shí),多糖的得率基本趨于穩(wěn)定;提取次數(shù)與多糖得率成正比,次數(shù)越多提取越充分,經(jīng)過提取3次后多糖得率則趨于平穩(wěn);溶劑用量越多,多糖得率越高,但大量提取液需要濃縮,導(dǎo)致時(shí)間和能源的浪費(fèi),因此應(yīng)選擇適當(dāng)?shù)娜軇┍读俊?/p>
圖1 提取溫度對(duì)黑苣勝多糖提取率的影響
依據(jù)單因素考察結(jié)果建立正交設(shè)計(jì)實(shí)驗(yàn),相關(guān)因素和水平及試驗(yàn)結(jié)果見表1~3。由表3可知,提取次數(shù)是生菜子多糖的提取工藝的主要影響因素,其余各個(gè)因素對(duì)生菜子多糖得率無顯著影響。
表1 正交試驗(yàn)因素水平表
表2 正交試驗(yàn)結(jié)果
表3 生菜子多糖提取實(shí)驗(yàn)方差分析表
本實(shí)驗(yàn)所建立的BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)最大學(xué)習(xí)步長(zhǎng)為1000,目標(biāo)精度0.001,訓(xùn)練過程穩(wěn)定迅速,其穩(wěn)定性結(jié)果可見圖5~6。此網(wǎng)絡(luò)以正交試驗(yàn)所得數(shù)據(jù)作為參考數(shù)據(jù),模擬提取實(shí)驗(yàn)中未進(jìn)行的數(shù)據(jù)考察,可以由計(jì)算機(jī)實(shí)現(xiàn)1℃、1 倍水量、1 min 對(duì)生菜子多糖得率的影響,從而得到最優(yōu)結(jié)果。固定3個(gè)影響因素,仿真一個(gè)因素后所得的工藝為:89℃,44倍水,提取4次,1.6 h/次,結(jié)果見圖7~10。
圖2 提取時(shí)間對(duì)黑苣勝多糖提取率的影響
圖3 提取次數(shù)對(duì)黑苣勝多糖提取率的影響
圖4 溶劑的倍量對(duì)黑苣勝多糖提取率的影響
圖5 誤差收斂曲線
圖6 回歸相關(guān)性擬合曲線
圖7 針對(duì)提取溫度的仿真
圖8 針對(duì)提取時(shí)間的仿真
圖9 針對(duì)溶劑倍量的仿真
圖10 針對(duì)提取次數(shù)的仿真
由表4可知,生菜子粗多糖(粗)、60%醇沉(60%)、80%醇沉多糖(80%)對(duì)?;悄懰徕c(STC)、甘氨膽酸鈉(SGC)和膽酸鈉(SC)都有較好的結(jié)合率,并與多糖濃度在一定范圍內(nèi)呈正比。
表4 不同生菜子多糖對(duì)3種膽酸鹽的結(jié)合率
通過本項(xiàng)目研究補(bǔ)充了目前針對(duì)生菜子這味藥食同源蒙藥的研究,發(fā)現(xiàn)了其所含主要化學(xué)成分是多糖,并對(duì)生菜子多糖的提取分離方法進(jìn)行了研究,填補(bǔ)了此味藥材在化學(xué)成分提取方法上的空白。由項(xiàng)目最終多糖得率可知采用BP 神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)模型所得的生菜子多糖提取工藝優(yōu)于正交試驗(yàn),并且在不增加試驗(yàn)次數(shù)的基礎(chǔ)上就可以考察到更細(xì)微的條件變化,節(jié)約人力物力,僅利用少量數(shù)據(jù)即可通過計(jì)算機(jī)軟件分析各個(gè)影響提取的因素對(duì)生菜子多糖得率的影響規(guī)律,并找到最佳參數(shù)且此結(jié)果優(yōu)于正交試驗(yàn)結(jié)果,說明BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)法值得用于化學(xué)成分提取工藝的改進(jìn)。
本研究通過利用模擬腸胃條件的方法進(jìn)行了生菜子多糖膽酸鹽結(jié)合試驗(yàn),發(fā)現(xiàn)多糖濃度高于2 mg/mL時(shí),對(duì)膽酸鈉的結(jié)合率反而下降,可能是由于多糖分子比較大,當(dāng)濃度過高時(shí),在空間上阻礙了其與膽酸鈉的結(jié)合,尚需結(jié)合體內(nèi)實(shí)驗(yàn)進(jìn)一步研究。
有學(xué)者認(rèn)為藥食同源的植物中功能性成分能夠于腸道結(jié)合內(nèi)膽酸鹽,部分可以通過影響脂類消化和吸收降血脂,還可以通過影響膽酸鹽的腸肝循環(huán),使之排出體外,并促使膽固醇向膽酸鹽轉(zhuǎn)化來降低血脂[25-26],結(jié)合本項(xiàng)目研究結(jié)果,可初步判斷生菜子降低血脂的藥理作用機(jī)制為生菜子多糖對(duì)膽酸鹽的結(jié)合作用,從而表明多糖是生菜子藥材降血脂效果的主要有效成分之一,能夠?yàn)橐院竺伤幧俗铀幚砘钚匝芯看蛳铝嘶A(chǔ)并指明將來的研究方向。
正交試驗(yàn)作為常見的研究設(shè)計(jì)方法,不但經(jīng)濟(jì)、高效、快速,而且可以針對(duì)多因素多水平,局限是只能優(yōu)化研究者提供的多個(gè)水平的組合,而BP神經(jīng)網(wǎng)絡(luò)可以學(xué)習(xí)規(guī)則,并實(shí)現(xiàn)自身訓(xùn)練,不僅能夠給定范圍尋優(yōu),還能預(yù)測(cè)范圍中的最優(yōu)值,得到更加可靠,穩(wěn)定的結(jié)果[23-24]。
根據(jù)本項(xiàng)目?jī)?yōu)化得到的工藝平行進(jìn)行3次生菜子多糖的提取實(shí)驗(yàn),結(jié)果發(fā)現(xiàn)此工藝中多糖得率優(yōu)于正交試驗(yàn)結(jié)果,平均為11.17%,證明此最優(yōu)工藝穩(wěn)定并且可行,同時(shí)具有良好的重復(fù)性。
在生菜子多糖的膽酸鹽結(jié)合實(shí)驗(yàn)中,隨著3 種多糖的濃度增大,對(duì)牛黃膽酸鈉的吸附力增強(qiáng),當(dāng)多糖濃度高于2 mg/mL 時(shí),對(duì)其結(jié)合率基本穩(wěn)定。多糖濃度增加,對(duì)甘氨膽酸鈉的吸附能力呈正比,在多糖濃度為3 mg/mL 時(shí)達(dá)到吸附最大值,表明生菜子多糖可以重點(diǎn)吸附此類膽酸鹽。而3種多糖對(duì)膽酸鈉的吸附在多糖濃度為0.5~2 mg/mL時(shí),逐步增加,但是當(dāng)多糖濃度高于2 mg/mL 時(shí),對(duì)膽酸鈉的結(jié)合率反而下降。在3種多糖中,生菜子粗多糖對(duì)不同膽酸鹽的結(jié)合率最佳,其次是60%醇沉多糖,80%醇沉多糖。
本項(xiàng)目?jī)H從體外對(duì)生菜子多糖的降血脂作用進(jìn)行了研究,后期實(shí)驗(yàn)將進(jìn)一步對(duì)生菜子多糖在高血脂動(dòng)物模型中的降血脂能力進(jìn)行研究。