陳子涵，任建國，王俊麗

（貴州醫(yī)科大學公共衛(wèi)生與健康學院，環(huán)境污染與疾病監(jiān)控教育部重點實驗室，貴陽 550025）

0 引言

DNA 甲基化(DNA methylation)是目前表觀遺傳學研究較為清晰的機制之一，廣泛存在于生物界中，是真核細胞中最為常見的一種基因組修飾方式，它在調(diào)節(jié)基因組功能的同時不改變DNA 的堿基序列。在植物中DNA 甲基化主要包括從頭甲基化和維持甲基化兩類。植物基因組主要通過甲基化酶(CMT)和甲基化轉(zhuǎn)移酶(DRM)來催化和維持DNA 甲基化。研究發(fā)現(xiàn)DNA甲基化水平與部分疾病的發(fā)生、發(fā)展有關(guān)[1]，能夠影響動植物長發(fā)育、改變植物的花期[2-3]，幫助植物抵抗逆境脅迫，有效調(diào)控基因和保證基因組的穩(wěn)定性。

對于植物而言，面對生長環(huán)境的改變，表觀遺傳的變異會改變植物DNA的構(gòu)象，從而改變?nèi)旧|(zhì)和蛋白質(zhì)的結(jié)構(gòu)，達到調(diào)節(jié)基因組的作用。研究發(fā)現(xiàn)，當植物面臨生物脅迫和非生物脅迫時，植物基因組中DNA甲基化會發(fā)生改變，并且這些改變會遺傳給后代。綜上所述，DNA 甲基化的改變能夠豐富植物物種的多樣性，加強植物的環(huán)境適應(yīng)性，為此，本研究整理了近年來植物DNA 甲基化的模式、生物學功能以及研究方法，以期深入了解DNA 甲基化對植物的影響，為植物基因組的深入研究提供一定的理論依據(jù)。

1 植物DNA甲基化模式

植物DNA甲基化是從頭甲基化、維持甲基化和活性去甲基化的動態(tài)調(diào)節(jié)結(jié)果，這些活動由不同的酶催化，通過不同的途徑作用于特定的基因組區(qū)域。植物發(fā)生DNA 甲基化的胞嘧啶序列有：CG，CHG 和CHH（H 代表A，T 或C）[6-7]。目前已知植物DNA 甲基化的方式主要有兩種，一種是從頭甲基化，另一種是維持甲基化。

1.1 從頭甲基化

從頭甲基化(De novomethylation)是通過不同的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶對DNA進行催化，使2條未甲基化的DNA 被甲基化。在擬南芥(Arabidopsis thaliana)中，從頭甲基化是通過RNA 介導(dǎo)的DNA 甲基化(RdDM)途徑實現(xiàn)的，該途徑涉及支架RNA(scaffold RNA)、小干擾RNA(siRNA)和一系列的蛋白質(zhì)，主要內(nèi)容見圖1。在RdDM 途徑中，通過RNA 聚合酶IV(POL IV)的參與募集轉(zhuǎn)座子和相關(guān)結(jié)構(gòu)域元件后形成非編碼RNA(P4 RNA)，在RNA聚合酶2(RDR2)介導(dǎo)下合成雙鏈 RNA(dsRNA)，被 DICER-LIKE PROTEIN 3(DCL3)，DCL2和DCL4切割，產(chǎn)生24個核苷酸的小干擾RNA(siRNAs)[8]。隨后，siRNAs 與ARGONAUTE 4(AGO4)或AGO6 結(jié)合，與RNA 聚合酶V(POL V)轉(zhuǎn)錄的互補支架RNA 配對，AGO4 與DOMAINS REARRANGED METHYLASE 2 (DRM2)相互作用，DRM2能夠使DNA從頭甲基化。

圖1 擬南芥中RNA介導(dǎo)的DNA甲基化途徑的模型

SHH1(SAWADEEHOMEODOMAINHOMO LOGUE1)是POL Ⅳ產(chǎn)生siRNA時所必需的[10]，SHH1在RdDM途徑中發(fā)揮上游作用，募集POLⅣ以促進siRNA的生物合成。同時，SHH1 SWADEE 域能采用獨特的串聯(lián)Tudor-折疊與組蛋白H3K9me2 結(jié)合，SHH1 中的DTF1轉(zhuǎn)錄因子能夠與SNF2 DOMAINCONTAINING PROTEIN CLASSY 1(CLSY)互作用，協(xié)助POL IV參與RdDM途徑中CHH甲基化[9-10]。POLⅡ通過DCL3 切割產(chǎn)生24nt siRNAs[11]，或者通過RDR6識別POLⅡ衍生的TE mRNA轉(zhuǎn)錄物，產(chǎn)生21nt/22nt siRNAs 參與從頭甲基化，觸發(fā)和建立TE 甲基化[12]。POLⅤ生成支架RNA需要DDR復(fù)合物參與，該復(fù)合物是由DEFECTIVE IN RNADIRECTED DNA METHYLATION 1 (DRD1)、DEFECTIVE IN MERISTEM SILENCING 3 (DMS3) 和 RNADIRECTED DNA METHYLATION 1 (RDM1)共同形成，能夠與SUPPRESSOR OF VARIEGATION 3-9 HOMOLOGUEPROTEIN 2 (SUVH2)和SUVH9 結(jié)合，從而募集POL V 發(fā)揮DNA 甲基化作用[13-14]。RNA 結(jié)合蛋白RRP6-LIKE 1 (RRP6L1)和INVOLVED IN DE NOVO 2 (IDN2)-IDN2 PARALOGUE (IDP)復(fù)合物(IDN2-IDP complex)可以幫助將POL V轉(zhuǎn)錄的RNA在保留在染色上，并與SWI/SNF 染色質(zhì)重塑復(fù)合物(SWITCH/SUCROSE NONFERMENTING chromatinremodeling complex，SWI/SNF)相互作用，通過改變核小體的結(jié)構(gòu)來參與POLⅤ介導(dǎo)的DNA甲基化[15-18]。

1.2 維持甲基化

維持DNA甲基化是指DNA雙鏈中一條鏈已發(fā)生甲基化，另一條未甲基化的鏈被甲基化。植物DNA甲基化的維持依賴于胞嘧啶序列，并由不同調(diào)控機制的DNA甲基轉(zhuǎn)移酶催化（見圖2）[27]。

圖2 植物DNA甲基化的動態(tài)調(diào)節(jié)

染色質(zhì)甲基化酶(CMT)是植物特有的DNA 甲基轉(zhuǎn)移酶[9]。它與小鼠Dnmt1、MET1結(jié)構(gòu)相似，與MET1不同之處在于，CMT 能夠修飾異染色質(zhì)DNA。在擬南芥中已經(jīng)識別了3 個CMT 基因[24]，其中CMT1 在擬南芥各器官中表達水平很低，被認為是沒有功能的[19]，CMT3和CMT2主要依賴于組蛋白H3K9去甲基，維持擬南芥CHG 甲基化[20]。與H3K9me2 復(fù)合的玉米CMT3同源物ZMET2晶體結(jié)構(gòu)表明，ZMET2通過BAH 結(jié)構(gòu)域(bromo-adjacent homology，BAH)與組蛋白H3K9me2結(jié)合[21]。擬南芥H3K9特異性甲基轉(zhuǎn)移酶SUVH4(SUPPRESSOR OF VARIEGATION 3-9 HOMOLOGUE PROTEIN 4)及其旁系SUVH5 和SUVH6 的突變消除了H3K9me2 形成，并大大降低了CHG甲基化水平[22]。

MET 甲基轉(zhuǎn)移酶家族(MET1)由Finnegan 等[24]從擬南芥中分離出，是最早發(fā)現(xiàn)的植物甲基轉(zhuǎn)移酶，它是小鼠Dnmt1 甲基轉(zhuǎn)移酶的同源物，二者結(jié)構(gòu)域有50%的同源性。它的主要作用是在重復(fù)和單拷貝DNA 序列中維持CG二核苷酸胞嘧啶甲基化。具體功能是將酶引向細胞核，識別未甲基化或半甲基化的胞嘧啶，使酶移向復(fù)制叉，并使其在S 期對半甲基化模板具有高度選擇性[25]。Kankel等[26]通過反義轉(zhuǎn)基因或錯義突變使擬南芥MET1 功能受損，發(fā)現(xiàn)其CpG 位點的甲基化水平降低，植物的生長發(fā)育也受到了一定的影響。

植物域重排甲基轉(zhuǎn)移酶(DRM)家族包括Zmet2、DRM1 和DRM2，在玉米和擬南芥中發(fā)現(xiàn)其與哺乳動物從頭甲基轉(zhuǎn)移酶(Dnmt 3)結(jié)構(gòu)相似，只在催化結(jié)構(gòu)域模體排列順序不同[28]。DRM 是在RNA 的指導(dǎo)下，維持非CpG 位點的胞嘧啶甲基化和催化胞嘧啶從頭甲基化[25]。CHH甲基化由具體的基因組區(qū)域所決定，通過RdDM 途徑，DRM2 可以在RdDM 目標區(qū)域維持CHH甲基化，RdDM目標區(qū)域優(yōu)先位于年輕的轉(zhuǎn)座子和短轉(zhuǎn)座子以及長轉(zhuǎn)座子的邊緣，通常位于異染色質(zhì)[29-31]。相比之下，CMT2 則在RdDM 途徑催化CHH甲基化。

2 植物DNA甲基化的生物學功能

DNA甲基化是重要的表觀遺傳修飾之一，廣泛分布于常染色質(zhì)的轉(zhuǎn)座子區(qū)、轉(zhuǎn)錄不活躍基因的啟動子區(qū)以及異染色質(zhì)區(qū)，進而影響遺傳信息的可獲得性。

2.1 DNA甲基化對植物生長發(fā)育的調(diào)控

在生長和發(fā)育期間以及整個植物的生命周期中，不同組織或細胞類型中的DNA 甲基化水平受到嚴格控制，這表明DNA 甲基化在植物生理中發(fā)揮重要作用。

研究發(fā)現(xiàn)，DNA 甲基化表達水平的高低，會影響植物的生長發(fā)育。在對馬哈利櫻桃(Prunus mahaleb)進行研究時發(fā)現(xiàn)其基因組甲基化水平矮化組甲基化水平高于半矮化組[32]。劉瓊瑤等[33]通過對矮生觀賞杉木(Dwarf Ornamental)DNA甲基化的水平進行研究發(fā)現(xiàn)，矮生觀賞杉木DNA甲基化水平和野生杉木葉片DNA甲基化水平差異呈現(xiàn)極顯著水平。李際紅等[34]發(fā)現(xiàn)葉籽銀杏(Ginkgo bilobavar.epiphylla)的甲基化水平高于銀杏，并且二者之間甲基化程度和（或）模式均存在廣泛的變異，提示DNA甲基化水平及模式與植物生長發(fā)育特性有關(guān)。

多個研究證明在植物自主開花和春化作用中，DNA 甲基化起著重要的作用[1,35-37]。DNA 甲基化表達水平的降低能夠促進植物花期提前，通過對小麥進行一定濃度的5-氮雜胞苷的干預(yù)，發(fā)現(xiàn)處理組的小麥抽穗和開花較非處理組早1 天以上，并且其余農(nóng)藝性狀基本保持一致。同時還發(fā)現(xiàn)，適量降低DNA甲基化水平能夠在一定程度上增加小麥的產(chǎn)量[3]。新的研究中發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化不僅在在動物發(fā)育過程中被廣泛的重新編程，且在開花植物中也能夠進行編程，并有助于開花植物的果實成熟[38]。

DNA 甲基化也參與了植物的果實成熟過程。番茄作為呼吸躍變型果實，經(jīng)研究發(fā)現(xiàn)DNA低甲基化和DNA 去甲基化酶的上調(diào)參與調(diào)控了番茄果實的成熟[39]。草莓是非呼吸躍變型果實，Cheng等[40]發(fā)現(xiàn)在草莓成熟期將DNA 甲基化水平下調(diào)能夠明顯誘導(dǎo)草莓提前成熟，并發(fā)現(xiàn)這種下調(diào)是由于RdDM通路活性降低引起。但目前除番茄和草莓外，其他的植物果實發(fā)育過程是否與DNA甲基化表達水平有關(guān)，以及其能否調(diào)控果實成熟的具體機制尚不清楚，還需要進行深入研究。

2.2 DNA甲基化在植物生物脅迫中的作用

生物脅迫是指對植物生存與發(fā)育不利的各種生物因素的總稱。植物為了抵御病原菌的生長，通過改變植物細胞中DNA甲基化的表達水平，以抵御病原體的感染和共生微生物的定殖。

病毒侵襲導(dǎo)致百合DNA 甲基化水平整體下降[41]。煙草被煙草花葉病毒(TMV)感染后，煙草的DNA 甲基化水平下降，脅迫響應(yīng)基因NtAlix1 上調(diào)[42]。蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中的根瘤需要脫甲基酶基因DEMETER(DME)的作用，在結(jié)瘤形成過程中，數(shù)百個基因組區(qū)域被甲基化，包括一小部分結(jié)瘤特異性共生基因[45]，另一個方面結(jié)瘤特異性基因的表達與染色質(zhì)的倍性依賴開放有關(guān)，在一部分被測基因中，H3K27me3水平降低，而H3K9ac水平升高[44]。

在被囊腫線蟲(Heterodera glycine，SCN)感染的大豆和擬南芥根中觀察到DNA甲基化水平降低[45-46]?；野卟【?Cercospora sojina)侵襲大豆，使其感染灰斑病，影響到大豆的品質(zhì)和產(chǎn)量，通過研究灰斑病菌脅迫下大豆基因組的DNA 甲基化水平發(fā)現(xiàn)，其DNA 甲基化表達水平下降明顯，DNA且甲基化模式以去甲基化為主[47]。由此可見，抗病相關(guān)基因的低甲基化，將有利于植物抗病基因的表達，或者得到抗病基因，提高自身抗病性。

丁香假單胞菌番茄致病變種(Pseudomonas syringaepv.tomato，Pst DC3000)侵襲擬南芥葉片會引起輕度但廣泛的差異DNA 甲基化。差異甲基化的胞嘧啶主要存在于CG 和CHH 基因富集區(qū)域，特別是在蛋白質(zhì)編碼基因的5'和3'末端。此外，Pst DC3000 響應(yīng)的擬南芥DNA 甲基化與整個基因組鄰近基因的表達水平呈負相關(guān)[48]。REPRESSOR OF SILENCING1(ROS1)的DNA 脫甲基酶阻遏物及其同系物轉(zhuǎn)錄激活劑樣(DME)-LIKE 2(DML2)和DML3 后通過去除鄰近DNA甲基化，共同調(diào)節(jié)許多生物脅迫響應(yīng)基因[49]。這表明植物可以動態(tài)調(diào)節(jié)DNA甲基化，從而調(diào)節(jié)防御基因的表達。

2.3 DNA甲基化在植物非生物脅迫中的作用

隨著溫度的變化，植物通過DNA甲基化和去甲基化的可逆動態(tài)變化維持自身穩(wěn)定性。在秋末低溫條件下，西洋參蘆頭的DNA 甲基化水平升高，春初升溫時DNA 甲基化水平下降，在春初至秋末整個苗期，西洋參毛根中的DNA 甲基化水平呈現(xiàn)上升趨勢。研究后發(fā)現(xiàn)，只有經(jīng)歷足夠的自然低溫，西洋參幼苗在春季氣溫回升時DNA甲基化水平才能顯著下降，同時開花基因PqFT在開花期和皂苷合成基因PqDDS在綠果期才能出現(xiàn)特定的高表達，從而增加皂苷的產(chǎn)量，提高西洋參的藥用質(zhì)量[50]。番茄果實的成熟與DNA 甲基化的改變密切相關(guān)，Zhang等[51]在研究后發(fā)現(xiàn)，在低溫狀態(tài)下，DNA脫甲基酶DML2被抑制，導(dǎo)致DNA甲基化過度，顯著延遲了果實成熟和風味揮發(fā)物的生成，這也解釋了為什么成熟番茄果實冷藏后會大大降低風味品質(zhì)。

中國常用的中藥材半夏(Pinellia ternate)，在高溫脅迫狀態(tài)下，基因組DNA 甲基化水平顯著降低，同時發(fā)現(xiàn)，DNA甲基化水平不會隨脅迫時間增加而明顯改變，這說明半夏對于高溫脅迫能夠迅速適應(yīng)。對甲基化的變異類型進行分析后可以發(fā)現(xiàn)，DNA 甲基化和DNA 去甲基化均被誘導(dǎo)發(fā)生[52]。對棉花進行高溫脅迫，發(fā)現(xiàn)其基因組DNA甲基化和去甲基化能夠同時發(fā)生，但呈現(xiàn)出明顯的品種差異性，甲基化主要發(fā)生在耐高溫品種，去甲基化則發(fā)生在高溫敏感品種[53]。曾子入等[54]利用甲基化敏感擴增多態(tài)性技術(shù)(MSAP)分析發(fā)現(xiàn)，高溫脅迫下蘿卜肉質(zhì)根的DNA甲基化發(fā)生明顯改變，耐熱材料部位主要發(fā)生去甲基化，不耐熱材料部位發(fā)生超甲基化。綜上所述，植物能夠通過DNA甲基化改變來維持基因組穩(wěn)定，從而抵御高溫脅迫，同時提示植物DNA甲基化水平和狀態(tài)與品種的耐熱性有關(guān)，為深入研究植物耐熱品種的進化提供了一定參考。

光照是植物生長必不可少的條件之一，但光照量超過光合系統(tǒng)的需求量時，會出現(xiàn)“光抑制現(xiàn)象”，導(dǎo)致活性氧自由基(ROS)的積累，抑制植物的生長[55]。施江等[56]對半夏進行遮蔭處理后發(fā)現(xiàn)，遮蔭顯著提升半夏基因組DNA甲基化水平，同時在遮蔭條件下，DNA甲基化率高于DNA 去甲基化率(32.51%＞16.25%)，提示遮蔭調(diào)控部分基因的表達可能通過DNA 甲基化修飾實現(xiàn)。

通過對蒙古黃芪(Mongolia Astragalus)進行干旱脅迫后，經(jīng)過MSAP 分析，發(fā)現(xiàn)其DNA 甲基化程度隨著干旱程度的增加呈現(xiàn)下降趨勢，與脅迫呈顯著負相關(guān)[57]，提示了DNA甲基化與植物抗干旱之間存在一定的關(guān)聯(lián)性，但其應(yīng)對干旱的調(diào)控機制尚不清楚，需要進行進一步研究。潘雅姣等[58]研究發(fā)現(xiàn)，水稻基因組在干旱脅迫狀態(tài)下，基因組CCGG位點發(fā)生了DNA甲基化，且表達的平均水平明顯增加，根部增幅最為明顯，認為DNA甲基化有一定時空特異性和品種特異性，與品種抗旱性反應(yīng)密切相關(guān)。Xu[59]在單堿基分辨率水平上繪制了胞嘧啶甲基化的圖譜，并分析了干旱敏感和耐旱品種在干旱脅迫下的基因表達變化，發(fā)現(xiàn)啟動子非甲基化的基因顯示出比啟動子甲基化的基因更高的表達水平。編碼轉(zhuǎn)錄因子(transcription factors，TFs)和轉(zhuǎn)座因子(transposable elements，TEs)基因的甲基化與蘋果抗逆機制有關(guān)。該研究在全基因組上揭示了干旱脅迫導(dǎo)致蘋果甲基化組變化的特點，將有助于研究響應(yīng)非生物脅迫的甲基化調(diào)節(jié)作用。

在逆境脅迫狀態(tài)下，植物的DNA去甲基化主要依靠去甲基化酶基因介導(dǎo)的Ros1(Repressor of Silencing 1)切除5-meC 的游離堿基實現(xiàn)的[60]。Ros1 具有DNA糖苷酶活性和AP 核酸內(nèi)切酶活性，能夠切斷N-糖苷鍵和裂解脫堿基位點，之后通過堿基切除修復(fù)機制(Base excision repair，BER)以及DNA 聚合酶、DNA 連接酶一同修復(fù)完成DNA 去甲基化進程。在鹽脅迫狀態(tài)，觀察鹽穗木(Halostachys caspica)的DNA 甲基化水平和Ros1 的表達程度，發(fā)現(xiàn)DNA 甲基化水平與Ros1的表達量呈明顯負相關(guān)，鹽脅迫狀態(tài)下Ros1的表達增加，DNA 甲基化水平降低，從而提高了鹽穗木的耐鹽性[61]。在前期研究中，董蔚等[62-63]首次從蒺藜苜蓿(Medicago truncatula)中分離了MYB 家族轉(zhuǎn)錄因子基因MtMYBS1，證實其是參與植物鹽脅迫的重要功能基因，鹽脅迫下MtMYBS1 的表達與DNA 甲基化水平呈負相關(guān)，與蛋白H3K9ac 修飾水平呈正相關(guān)。由此可見，植物能夠通過調(diào)控DNA甲基化水平以及相關(guān)基因的表達程度，提高植物的抗鹽能力。

不同濃度的Cd、Cu 脅迫會導(dǎo)致擬南芥幼苗基因組DNA甲基化水平整體提高[64]。蘿卜基因組在Pb脅迫下DNA全甲基化率上升，主要是重新甲基化[65]。不同濃度Cd 脅迫下，孔雀草(Tagetes patula)基因組DNA全甲基化率隨著Cd濃度的增加逐漸上升，其主要的甲基化模式為重新甲基化[66]。中華水韭重金屬Pb 和Cd的脅迫下，基因組DNA 甲基化的總體水平變化不大，但全甲基化水平略有降低，半甲基化水平略有上升[67]。研究發(fā)現(xiàn)，大豆在鎘脅迫下基因組DNA甲基化的整體水平升高，同時甲基化多態(tài)性也有所提升，且與鎘處理濃度呈正相關(guān)，其中甲基化模式的改變主要以去甲基化為主[68]。相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)，重金屬脅迫下，植物DNA甲基化水平與重金屬的濃度有關(guān)，小麥幼苗根系的DNA甲基化水平隨著Cd的濃度的增加呈現(xiàn)出先上升后下降的趨勢[69]。上述研究報道提示重金屬脅迫對植物甲基化水平的影響存在著多種反應(yīng)機制，但是針對重金屬脅迫的研究主要是針對植物DNA 甲基化水平，而對特定基因位點參與DNA甲基化的研究較少。

3 植物DNA甲基化的研究方法

DNA 甲基化的檢測最早開始于1980 年，Kuo[70]采用高效液相色譜柱(HPLC)對基因組DNA甲基化進行了測定。近年來，DNA甲基化研究在模式植物和作物中取得了重要發(fā)展，檢測方法也不斷更新。一般來說，植物DNA 甲基化的檢測過程分為待檢測樣品的前期處理、特定位點定位和甲基化狀態(tài)的檢測?，F(xiàn)將用于植物DNA甲基化檢測方法歸納（表1）如下。

表1 常用植物DNA甲基化檢測技術(shù)

HPLC是一種出現(xiàn)較早的DNA甲基化檢測技術(shù)，廣泛用于檢測植物的全基因組DNA甲基化水平，包括棉花、茶樹、相思樹、紅豆杉等[76-79]。Gao[80]等通過優(yōu)化的HPLC技術(shù)對茶樹(Camellia sinensisL.)組織，品種和生長期進行了DNA 甲基化水平的測定，發(fā)現(xiàn)DNA 甲基化水平在各個組織各有不同，在不同的生長期甲基化水平的模式則形成了一個鞍形曲線。該方法的優(yōu)點是在不需要參考基因組的條件下，就能對植物進行全基因組DNA甲基化水平的測定，缺點是操作體系較為復(fù)雜[81]。

甲基化敏感擴增多態(tài)性法(MSAP)是一種以AFLP技術(shù)為原理檢測DNA 甲基化的PCR 技術(shù)，通過限制性內(nèi)切酶MspⅠ和HpaⅡ識別CCGG序列上胞嘧啶甲基化，這兩種酶對特定的胞嘧啶甲基化具有不同的敏感性，其中HpaⅡ只能識別mCCGG 即單鏈DNA 外側(cè)甲基化位點；MspⅠ能夠識別CmCGG即雙鏈或者單鏈DNA的內(nèi)側(cè)甲基化位點。將相同的DNA序列擴增出不同的譜帶以判斷5’-CCGG 位點的胞嘧啶甲基化水平[82-83]。目前該技術(shù)大量使用于紫羅蘭、擬南芥、馬鈴薯、丹參等植物的甲基化模式和水平檢測上[84-87]。MSAP技術(shù)的優(yōu)勢[88]在于經(jīng)濟效益高，成本低，能夠研究缺少基因組測序的非模式生物，還能夠批量篩選所研究基因組中的突變和分化。同時該技術(shù)也有一定的局限性，因限制性內(nèi)切酶具有一定的選擇性，所以可能會遺漏一些甲基化狀態(tài)。

全基因組亞硫酸鹽測序(WGBS)技術(shù)是將新興的高通量測序技術(shù)與亞硫酸鹽轉(zhuǎn)化方法相結(jié)合，能夠?qū)又参锏腄NA 甲基化進行單堿基解析和全基因組分布分析，可以識別可能受到DNA甲基化和脫甲基化動態(tài)變化控制的基因，是目前甲基化測序的金標準[89]。Sun 等[90]利用WGBS 技術(shù)構(gòu)建了西瓜(Citrullus lanatus)的全基因組DNA 甲基化譜，結(jié)合RdDM 通路基因的下調(diào)表明，被黃瓜綠斑駁花葉病毒(Cucumber Green Mottle Mosaic Virus，CGMMV)感染的西瓜，RdDM 導(dǎo)向的CHH 甲基化降低在西瓜抗病毒防御中發(fā)揮重要作用。這與之前對挪威云杉(Norway pruce)的檢測結(jié)果相符合[91]。WGBS 也有一定的局限性，由于其價格昂貴，目前多用于具有高質(zhì)量參考基因組的物種應(yīng)用，不能夠廣泛應(yīng)用于大型實驗設(shè)計，特別是中型至大型植物基因組。

簡并代表性亞硫酸氫鹽測序技術(shù)(RRBS)作為一種經(jīng)濟有效的體外方法，可用于沒有參考基因組的生物，并且比以前的基于標記的方法具有更高的分辨率，通過使用限制性內(nèi)切酶對基因組進行酶切，用高通量進行測序，對基因組甲基化水平進行測序。該技術(shù)最初是為哺乳動物研究開發(fā)的，所以主要集中于富含GC的區(qū)域（CpG島）的甲基化。Matin等[92]使用優(yōu)化的雙限制性核酸內(nèi)切酶消化，片段末端修復(fù)，銜接子連接，亞硫酸氫鹽轉(zhuǎn)化，PCR 擴增和新一代測序(NGS)，建立了一種有效的植物甲基化基因組分析方法(Plant-RRBS)，該方法主要檢測水稻中假定的啟動子區(qū)域和未注釋區(qū)域的胞嘧啶甲基化。Plant-RRBS 通過使用優(yōu)化的核酸內(nèi)切酶組合從可重復(fù)覆蓋的基因組片段中獲得有效讀取數(shù)來提供高通量、廣泛的、基因組分散的甲基化檢測，從而促進了多樣本研究的比較分析，以分析實驗材料和植物中的胞嘧啶甲基化和跨代穩(wěn)定性繁殖種群。

甲基化DNA免疫共沉淀測序技術(shù)(MeDIP-seq)是通過免疫共沉淀法預(yù)處理DNA，使用抗甲基胞嘧啶核苷抗體富集甲基化的DNA 片段，通過對CpG 密集的甲基化區(qū)域進行高通量測序，快速準確的檢測全基因組的甲基化狀態(tài)和分布特征[93-94]。相較于MeDIPchip，該方法靈敏度更高，更適合用于大樣本量的研究，Vining[95]對毛果楊(Populus trichocarpa)7 種不同組織類型進行了DNA 甲基化變異性及其與基因表達關(guān)系的研究中就使用了該方法。

目前新興的第三代測序技術(shù)是分子測序，主要包括單分子實時測序技術(shù)(SMRT)和牛津納米孔測序技術(shù)(Oxford Nanopore Nechnologies)，能夠直接檢測甲基化的DNA序列，如PacBio SMRT技術(shù)是利用在測序過程中堿基修飾時DNA聚合酶的合成速度減慢，出現(xiàn)信號延遲的時間來檢測甲基修飾情況[96]，但這一代技術(shù)價格較為昂貴，目前較難進行廣泛的應(yīng)用。

PaciMeDIP-chip 利用5-甲基胞嘧啶的單克隆抗體，通過免疫沉淀法富集甲基化片段，經(jīng)熒光探針標記，與CG 島芯片進行雜交，對雜交信號進行分析，每個點信號的強度對應(yīng)甲基化狀態(tài)。該方法以在擬南芥[97]和水稻[98]的DNA甲基化檢測上得到應(yīng)用。

隨著對植物表觀遺傳修飾的深入研究和高通量測序技術(shù)的進一步發(fā)展，DNA甲基化的檢測技術(shù)將會不斷完善，應(yīng)用于難以測序的區(qū)域，能夠有效提高植物DNA 甲基化數(shù)據(jù)的挖掘和處理，獲得更多的生物信息。

4 展望

DNA 甲基化是一種表觀遺傳方式，具有可逆性。DNA 甲基化在高等真核生物中的主要作用是在逆境狀態(tài)下保護基因組內(nèi)源DNA，在植物的生長發(fā)育、作物產(chǎn)量以及逆境脅迫等方面發(fā)揮了重要作用，特定區(qū)域的DNA甲基化能夠穩(wěn)定遺傳給后代，起到抗逆保護的作用，幫助植物有效抵御外界威脅。近年來人們雖然已經(jīng)對植物DNA甲基化的研究有了一定進展，但針對植物DNA甲基化的作用機制還不明確，亟待解決的問題有以下幾點：（1）植物DNA 甲基化所涉及的信號傳遞與轉(zhuǎn)導(dǎo)機制尚不明確?，F(xiàn)有的研究多以植物DNA甲基化表達水平作為研究目標，對其具體的機制研究較少，因此有必要對其如何控制復(fù)制起始進行進一步的研究；（2）DNA 甲基化調(diào)控植物生長發(fā)育的機制尚不明確，植物面對逆境脅迫時DNA甲基化的特定位點和具體響應(yīng)機制也不夠深入；（3）已有大部分針對5-mC 的研究，但對N6-mA 在植物中的作用功能的研究國內(nèi)較為少見。因此，今后的研究可從分子和細胞水平闡明DNA甲基化的分子調(diào)控機制，探尋基因?qū)用娴闹参锟鼓鏅C制，為植物新品種的培育和改良提供一定的理論依據(jù)。