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      菝葜多糖分離純化工藝研究

      2021-12-13 07:06:40梅明周進(jìn)張毅馬良鵬楊明胡松
      山東科學(xué) 2021年6期
      關(guān)鍵詞:菝葜靜置大孔

      梅明,周進(jìn),張毅,馬良鵬,楊明,胡松*

      (1.武漢市第一醫(yī)院 藥學(xué)部,湖北 武漢 430030;2.江西中醫(yī)藥大學(xué) 現(xiàn)代中藥制劑教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,江西 南昌 330004)

      菝葜為百合科植物菝葜的干燥根莖,具有利濕去濁、祛風(fēng)除痹與解毒散瘀的功效[1-2],始載于《名醫(yī)別錄》,現(xiàn)收載于《中國(guó)藥典》2015版一部[3]。實(shí)驗(yàn)研究表明,菝葜有效成分為皂苷、黃酮、有機(jī)酸及多糖等,其總提取物有鎮(zhèn)痛、抗炎、抗感染、降血糖及增強(qiáng)機(jī)體免疫力等作用,臨床上廣泛用于婦科慢性疾病的治療,如慢性盆腔炎、附件炎等[4]。目前關(guān)于菝葜有效成分的研究主要集中在皂苷類與黃酮類成分,然而近年來(lái)多糖類成分越來(lái)越被人們所重視,且有報(bào)道表明菝葜多糖具有明顯的免疫調(diào)節(jié)等作用[5-6],這為開(kāi)展菝葜多糖類成分的研究提供了依據(jù)。本文對(duì)菝葜多糖進(jìn)行了醇沉工藝與大孔吸附樹(shù)脂純化工藝研究,為其進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用提供了依據(jù)。

      1 儀器與材料

      1.1 實(shí)驗(yàn)儀器

      FA1104型萬(wàn)分之一電子天平(上海天平儀器廠);Mettler AE240型十萬(wàn)分之一電子天平(德國(guó)Mettler公司);UV-1700型紫外-可見(jiàn)分光光度儀(日本島津公司); KQ3200型超聲清洗器(昆山市超聲儀器有限公司);SZ93型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀(上海亞榮生化儀器廠);DZF6020型減壓干燥箱(上海喬躍電子有限公司)。

      1.2 實(shí)驗(yàn)材料

      無(wú)水葡萄糖對(duì)照品(中國(guó)藥品生物制品檢定所,批號(hào)110833-201205,純度≥99%);菝葜(批號(hào)121028)購(gòu)于四川新荷花飲片有限公司,由成都中醫(yī)藥大學(xué)盧先明教授鑒定為百合科植物菝葜的干燥根莖;HPD-100型、D101型大孔吸附樹(shù)脂(成都市科龍化工試劑廠,批號(hào)分別為20130305、20120305),AB-8型大孔吸附樹(shù)脂(南開(kāi)大學(xué)化工廠,批號(hào)030605);甲醇、濃硫酸、苯酚等均為分析純(成都市科龍化工試劑廠);水為超純水。

      2 方法與結(jié)果

      2.1 菝葜多糖的含量測(cè)定

      2.1.1 對(duì)照品溶液的制備

      精密稱取已在105 ℃干燥至恒重的葡萄糖對(duì)照品10.3 mg,置于100 mL棕色容量瓶中,加純水定容,制成含無(wú)水葡萄糖0.103 mg/ mL的對(duì)照品溶液。

      2.1.2 供試品溶液的制備

      稱取菝葜藥材適量,加入10倍量的體積分?jǐn)?shù)80%乙醇,水浴回流3次,每次1.5 h,濾過(guò),殘?jiān)谒∩蠐]干,然后加12倍量的純水,提取3次,每次提取2 h,提取溫度為80 ℃,定容,即得提取液,備用。

      2.1.3 線性關(guān)系考察

      以空白溶劑為隨行對(duì)照,精密量取2.1.1項(xiàng)下對(duì)照品溶液適量,在波長(zhǎng)200~700 nm范圍內(nèi)進(jìn)行掃描,發(fā)現(xiàn)在490 nm處有特征吸收峰,確定檢測(cè)波長(zhǎng)為490 nm。分別精密吸取0.50、0.60、0.70、0.80、0.90與1.00 mL對(duì)照品溶液,分別置于10 mL具塞試管中,精密加水分別補(bǔ)至2.00 mL,各加入質(zhì)量分?jǐn)?shù)為5%的苯酚溶液1 mL,搖勻,迅速精密加入硫酸7 mL,搖勻,放置10 min,置40 ℃水浴中保溫15 min,取出,冰浴5 min,迅速冷卻至室溫,以相應(yīng)的試劑作為空白,在490 nm波長(zhǎng)處測(cè)定,以質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo),吸光度為縱坐標(biāo),制作標(biāo)準(zhǔn)曲線。計(jì)算回歸方程,回歸方程為:y=14.89x-0.029(r=0.999),結(jié)果表明,無(wú)水葡萄糖在0.026~0.052 mg/mL范圍內(nèi)樣品質(zhì)量濃度與吸光度線性關(guān)系良好。

      2.2 醇沉工藝研究

      2.2.1 醇沉靜置溫度考察

      取菝葜多糖水提液適量,減壓濃縮至每毫升水提液含生藥1.0 g,備用。量取3份濃縮液,加入乙醇,使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%,分別于25、8與2 ℃ 條件下,靜置12 h,抽濾得醇沉物,70 ℃干燥,分別得多糖粗品,計(jì)算多糖出膏率并測(cè)定多糖純度[7-9],結(jié)果見(jiàn)表1。

      表1 靜置溫度考察

      結(jié)果表明,25、8和2 ℃靜置效果沒(méi)有較大差異,故采用室溫25 ℃靜置醇沉即可。

      2.2.2 醇沉靜置時(shí)間考察

      精密量取4份濃縮液,各50 mL,加入乙醇,使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%,于室溫25 ℃條件下,分別靜置6、12、24與48 h,抽濾得醇沉物,70 ℃干燥,分別得多糖粗品,計(jì)算多糖出膏率并測(cè)定多糖純度,結(jié)果見(jiàn)表2。

      表2 靜置時(shí)間考察

      結(jié)果表明,隨著靜置時(shí)間的延長(zhǎng),多糖純度與多糖出膏率逐漸增加,靜置12 h即可達(dá)到較理想效果,結(jié)合工業(yè)擴(kuò)大生產(chǎn)實(shí)際考慮,確定醇沉靜置時(shí)間為12 h。

      2.2.3 藥液質(zhì)量濃度考察

      取4份菝葜多糖水提液,分別稀釋或濃縮至每毫升水提液含生藥0.5、0.8、1.0、1.2 g的藥液,加入乙醇,使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%,室溫靜置12 h,抽濾得醇沉物,70 ℃干燥,分別得多糖粗品,計(jì)算多糖出膏率并測(cè)定多糖純度,結(jié)果見(jiàn)表3。

      表3 提取液生藥質(zhì)量濃度考察

      結(jié)果表明,當(dāng)生藥質(zhì)量濃度為1.0 g/mL時(shí),醇沉效果較好。

      2.2.4 乙醇體積分?jǐn)?shù)考察

      精密量取4份濃縮液各50 mL,加入乙醇,使乙醇體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到60%、70%、80%、90%,室溫靜置12 h,抽濾得醇沉物,70 ℃干燥,分別得多糖粗品,計(jì)算多糖出膏率并測(cè)定多糖純度,結(jié)果見(jiàn)表4。

      表4 乙醇體積分?jǐn)?shù)考察

      結(jié)果表明,乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%時(shí),多糖純度與多糖出膏率均較為理想,因此,確定菝葜多糖的乙醇體積分?jǐn)?shù)為80%。

      2.2.5 醇沉次數(shù)考察

      精密量取3份濃縮液各50 mL,加入乙醇,使乙醇體積分?jǐn)?shù)分別達(dá)到80%,分別醇沉1、2、3次,室溫靜置12 h,抽濾得醇沉物,70 ℃干燥,分別得多糖粗品,計(jì)算多糖出膏率并測(cè)定多糖純度,結(jié)果見(jiàn)表5。

      表5 醇沉次數(shù)考察

      結(jié)果表明,隨著醇沉次數(shù)的增加,多糖純度略有升高,但多糖出膏率呈下降趨勢(shì),綜合考慮多糖純度、多糖得率等,確定最佳醇沉次數(shù)為1次。

      2.2.6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

      綜合前述實(shí)驗(yàn)考察結(jié)果,確定最佳醇沉工藝為將提取液濃縮至每毫升含生藥1.0 g,加入乙醇,使乙醇體積分?jǐn)?shù)達(dá)到80%,醇沉1次,室溫25 ℃靜置12 h,抽濾得醇沉物,70 ℃干燥,即得,3次驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果見(jiàn)表6。

      表6 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      結(jié)果表明,多糖醇沉后平均純度為51.77%,平均出膏率為2.12%,結(jié)果較為穩(wěn)定,說(shuō)明該醇沉工藝穩(wěn)定可行。

      2.3 大孔吸附樹(shù)脂純化工藝研究

      2.3.1 大孔吸附樹(shù)脂預(yù)處理

      2.3.2 大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附與解吸考察

      準(zhǔn)確稱取已被預(yù)處理過(guò)的AB-8型、HPD100型、D101型大孔吸附樹(shù)脂各2 g,置錐形瓶中,分別加入2.0 mg/mL的菝葜粗多糖溶液50 mL,于20 ℃恒溫條件下,置磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?4 h,充分吸附后,測(cè)定殘液中多糖質(zhì)量濃度,并計(jì)算吸附量與吸附率。再將上述經(jīng)過(guò)靜態(tài)吸附的大孔吸附樹(shù)脂,置于具塞的錐形瓶中,各加入50 mL蒸餾水,20 ℃恒溫條件下,置磁力攪拌器上充分?jǐn)嚢?4 h,過(guò)濾,測(cè)定解吸殘液中多糖質(zhì)量濃度,并計(jì)算解吸率。計(jì)算公式如下:吸附率=(C0-C1)/C0×100%,解吸率=C2V2/(C0-C1)V1×100%,式中,C0為吸附液初始質(zhì)量濃度,C1為吸附后質(zhì)量濃度,C2為解吸殘液質(zhì)量濃度,V1為加入粗多糖溶液體積,V2為加入蒸餾水體積,結(jié)果見(jiàn)表7。

      表7 大孔吸附樹(shù)脂靜態(tài)吸附率及解吸率結(jié)果

      結(jié)果表明,相比HPD100型與D101型大孔吸附樹(shù)脂,AB-8型對(duì)菝葜多糖的吸附率與解吸率均較高,故選擇AB-8型對(duì)菝葜多糖進(jìn)行純化。

      2.3.3 上樣液質(zhì)量濃度考察

      準(zhǔn)確稱取3份已被預(yù)處理過(guò)的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂,柱體積為30 mL,濕法裝柱,配制1.0、2.0與4.0 mg/mL(以粗多糖計(jì))的上樣液,按2 BV/h的流速,上樣1 BV,以2 BV/h的流速用純水進(jìn)行洗脫,收集洗脫液并定容,按擬定方法測(cè)定洗脫液中多糖質(zhì)量濃度并計(jì)算吸附率,結(jié)果表明上樣液質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL時(shí),多糖吸附率較大,因此確定上樣質(zhì)量濃度為2.0 mg/mL,見(jiàn)圖1。

      圖1 上樣質(zhì)量濃度考察結(jié)果Fig.1 Investigation result of sample concentration

      2.3.4 上樣流速考察

      準(zhǔn)確稱取5份已被預(yù)處理過(guò)的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂,柱體積為30 mL,濕法裝柱。取2.0 mg/mL(以粗多糖計(jì))的上樣液1 BV,分別以1、2、3、4、5 BV/h的流速進(jìn)行上樣,以2 BV/h的流速用純水進(jìn)行洗脫,收集洗脫液并定容,按擬定方法測(cè)定洗脫液中多糖質(zhì)量濃度并計(jì)算吸附率。結(jié)果多糖吸附率分別為65.3%、70.2%、67.1%、61.3%與55.2%,表明過(guò)大或過(guò)小的上樣流速都不利于多糖吸附,綜合考慮確定以2 BV/h的流速進(jìn)行上樣。

      2.3.5 上樣量考察

      準(zhǔn)確稱取5份已被預(yù)處理過(guò)的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂,柱體積為30 mL,濕法裝柱。取2.0 mg/mL(以粗多糖計(jì))的上樣液,以2 BV/h的流速進(jìn)行上樣,分別上樣1、2、3、4、5 BV,再用純水以2 BV/h的流速進(jìn)行洗脫,收集洗脫液并定容,按擬定方法測(cè)定洗脫液中多糖質(zhì)量濃度并計(jì)算吸附率,結(jié)果見(jiàn)表8。

      表8 上樣量考察結(jié)果

      結(jié)果表明,上樣量為1 BV時(shí),多糖吸附率較大,因此確定上樣量為1 BV。

      2.3.6 洗脫溶劑考察

      準(zhǔn)確稱取5份已被預(yù)處理過(guò)的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂,柱體積為30 mL,濕法裝柱。取2.0 mg/mL(以粗多糖計(jì))的上樣液,按2 BV/h的流速,上樣1 BV,再分別用純水、10%乙醇、15%乙醇、30%乙醇與40%乙醇以2 BV/h的流速進(jìn)行洗脫,收集洗脫液并定容,按擬定方法測(cè)定吸光度值,結(jié)果見(jiàn)表9。

      表9 洗脫溶劑考察結(jié)果

      結(jié)果表明,隨著乙醇體積分?jǐn)?shù)的增加,洗脫效率反而降低,因此,確定洗脫溶劑為純水。

      2.3.7 洗脫速率考察

      準(zhǔn)確稱取5份已被預(yù)處理過(guò)的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂,柱體積為30 mL,濕法裝柱。取2.0 mg/mL(以粗多糖計(jì))的上樣液,按2 BV/h的流速,上樣1 BV,再分別以1、2、3、4、5 BV/h的流速,用純水進(jìn)行洗脫,收集洗脫液并定容,按擬定方法測(cè)定洗脫液中多糖質(zhì)量濃度并計(jì)算解吸率,結(jié)果表明洗脫速率對(duì)多糖解吸率有一定影響,當(dāng)洗脫速率為3 BV/h時(shí),解吸率大,因此,確定洗脫速率為3 BV/h,見(jiàn)圖2。

      圖2 洗脫速率考察結(jié)果Fig.2 Investigation result of elution rate

      2.3.8 洗脫溶劑用量考察

      準(zhǔn)確稱取5份已被預(yù)處理過(guò)的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂,柱體積為30 mL,濕法裝柱。取2.0 mg/mL(以粗多糖計(jì))的上樣液,按2 BV/h的流速,上樣1 BV,以3 BV/h的流速用純水進(jìn)行洗脫,每1 BV收集洗脫液并定容,按擬定方法測(cè)定洗脫液中多糖質(zhì)量濃度并計(jì)算解吸率,結(jié)果表明洗脫劑用量為3 BV時(shí),多糖已能充分洗脫,因此綜合考慮時(shí)間等因素,確定洗脫劑用量為3 BV,見(jiàn)圖3。

      圖3 洗脫溶劑用量考察結(jié)果Fig.3 Investigation result of elution amount

      2.3.9 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)

      準(zhǔn)確稱取3份已被預(yù)處理過(guò)的AB-8型大孔吸附樹(shù)脂,柱體積為30 mL,濕法裝柱。取2.0 mg/mL(以粗多糖計(jì))的上樣液,按2 BV/h的流速,上樣1 BV,以3 BV/h的流速用3 BV的純水進(jìn)行洗脫,收集洗脫液并定容,按擬定方法測(cè)定洗脫液中多糖質(zhì)量濃度。再精密吸取一定體積的洗脫液置恒重后的蒸發(fā)皿中,減壓濃縮至一定體積,70 ℃干燥,在干燥器中冷卻0.5 h,迅速稱重,計(jì)算多糖純度,結(jié)果見(jiàn)表10。

      表10 驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)結(jié)果

      結(jié)果表明,大孔吸附樹(shù)脂純化后,多糖平均純度為60.48%,平均得率為1.03%,工藝穩(wěn)定可行,可用于菝葜多糖的分離純化。

      3 討論與結(jié)論

      大孔吸附樹(shù)脂分離技術(shù)能從中藥及其復(fù)方提取液中通過(guò)物理吸附有選擇性地吸附有效成分,從而對(duì)中藥中有效部位或有效成分實(shí)現(xiàn)分離、純化和富集[17-18]。多糖作為菝葜中的主要活性成分之一,對(duì)其分離純化工藝的研究具有一定的現(xiàn)實(shí)意義。本實(shí)驗(yàn)通過(guò)對(duì)菝葜多糖醇沉工藝與大孔吸附樹(shù)脂純化工藝的研究,確定了菝葜多糖的最佳純化工藝。通過(guò)對(duì)醇沉靜置溫度、醇沉靜置時(shí)間與藥液質(zhì)量濃度等因素的考察,優(yōu)化醇沉工藝,使菝葜多糖的純度達(dá)到了51.77%;通過(guò)大孔吸樹(shù)脂種類、上樣液濃度與洗脫溶劑等因素的考察,優(yōu)化大孔樹(shù)脂純化工藝,將菝葜多糖的純度提高到了60.48%。以上研究使純化后的菝葜多糖符合《藥品注冊(cè)管理辦法》[19]中關(guān)于中藥注冊(cè)申報(bào)的相關(guān)要求,為菝葜藥材的進(jìn)一步開(kāi)發(fā)利用奠定了基礎(chǔ)。

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