三種方法提取血清外泌體的比較研究

黃德發(fā)，陳 杰，楊 通，李正哲，張文娟，焦志剛，鐘田雨，

（1. 贛南醫(yī)學(xué)院第一臨床醫(yī)學(xué)院，江西贛州 341000；2.贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院檢驗(yàn)科，江西贛州 341000）

外泌體是一種由細(xì)胞分泌的雙層膜結(jié)構(gòu)小囊泡，直徑40～150 nm，它們廣泛存在于血液、尿液、母乳、腹腔積液、羊水、唾液和腦脊液等[1-2]。外泌體通過(guò)攜帶蛋白質(zhì)和核酸等多種生物分子參與細(xì)胞間通訊，從而調(diào)節(jié)機(jī)體的生理、病理過(guò)程[3]。越來(lái)越多的研究表明外泌體可以用于疾病的診斷和治療[4-5]。外泌體的分離和鑒定對(duì)于研究其生物學(xué)及臨床應(yīng)用功能是最基礎(chǔ)也是最關(guān)鍵的步驟。目前，外泌體常用的分離方法包括超速離心法、密度梯度離心法、免疫吸附法、沉淀法及尺寸排阻色譜法等[6-8]。本研究擬選擇超速離心法、沉淀法和尺寸排阻色譜法提取并鑒定血清外泌體，旨在驗(yàn)證采用不同方法提取血清外泌體的得率和純度，為后續(xù)外泌體的研究和應(yīng)用提供參考依據(jù)。

1 材料和方法

1.1 研究對(duì)象 隨機(jī)選取2021年1月～3月贛南醫(yī)學(xué)院第一附屬醫(yī)院健康體檢者8 例，其中男性4 例、女性4 例，年齡20～40 歲，所有體檢者體檢結(jié)果均在參考區(qū)間內(nèi)。使用普通真空采血管采集受試者靜脈血10 ml，室溫靜置30 min 使血液凝集。將采集血液在4℃ 1 500×g 離心20 min，取上清，上清液在4℃ 3 000×g 離心15 min，收集上清（血清）每管1 ml，-80℃保存。所有受試者均簽署知情同意書(shū)。

1.2 儀器與試劑 外泌體提取試劑盒（MA0404）（沉淀法）購(gòu)自大連美侖生物技術(shù)有限公司，尺寸排阻色譜柱（EXOSEC1.0-3）購(gòu)自遼寧潤(rùn)基生物科技有限公司，Millipore 超濾管(UFC810096)購(gòu)自北京華力德科技有限公司，Pierce? BCA 蛋白檢測(cè)試劑盒（23227）購(gòu)自Thermo Fisher Scientific 公司，Triton X-100（T8200）購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司。一抗抗體：CD9，CD63 和HSP70（ab275018）購(gòu)自美國(guó)Abcam 公司；二抗抗體：羊抗兔IgG 抗體（SA00001-2）購(gòu)自武漢Proteintech 公司。貝克曼超速離心機(jī)（Optima-Max-Tl）購(gòu)自美國(guó)貝克曼庫(kù)爾特公司，納米流式檢測(cè)儀（N30E）購(gòu)自廈門(mén)福流生物科技有限公司，透射電子顯微鏡（JEM1200EX）購(gòu)自日本JEOL 公司。

1.3 方法

1.3.1 外泌體提取：超速離心法：將1 ml 血清在4℃ 12 000×g 離心30 min，棄沉淀吸取上清，4℃ 110 000 ×g 離心2 h，吸棄上清，沉淀重懸在PBS中；4℃ 110 000×g 離心2 h，吸棄上清，沉淀重懸在100 μl PBS 中。沉淀法：按照試劑盒說(shuō)明書(shū)，取1 ml 血清加入0.2 ml 提取試劑，上下顛倒混勻，4℃孵育30 min，孵育結(jié)束后，4℃ 10 000×g 離心10 min，吸棄上清，沉淀重懸在100 μl PBS 中。尺寸排阻色譜法：按照說(shuō)明書(shū)，向柱子內(nèi)加入40 ml PBS 沖洗柱子；柱內(nèi)上方加入1 ml 血清，繼續(xù)用PBS 洗脫柱子并在下方收集含有外泌體餾分。將收集的外泌體餾分加入超濾管中，4℃ 2 000×g 離心，將樣品濃縮至100 μl。

1.3.2 透射電子顯微鏡成像：取20 μl 外泌體樣本置于銅網(wǎng)上靜置1 min，濾紙將銅網(wǎng)上的液體吸干；吸取20 μl 2g/dl 醋酸雙氧鈾染色液室溫染色1 min，濾紙將銅網(wǎng)上的染液吸干，置于60 W 白熾燈下烤3 min，鏡下觀察拍照。

1.3.3 外泌體的顆粒與直徑：將已知濃度的二氧化硅納米顆粒質(zhì)控球與粒徑標(biāo)準(zhǔn)品混合硅球，在納米流式檢測(cè)儀上檢測(cè)，PBS 作為空白對(duì)照，將外泌體樣本混勻后進(jìn)行檢測(cè)，得到外泌體的顆粒數(shù)與直徑。

1.3.4 蛋白印跡實(shí)驗(yàn)：采用Pierce BCA 蛋白定量試劑盒進(jìn)行外泌體蛋白定量，向外泌體懸液中添加蛋白上樣緩沖液，100℃加熱10 min 變性；隨后進(jìn)行12g/dl 丙烯酰胺凝膠電泳2 h，電泳后用電轉(zhuǎn)移將蛋白轉(zhuǎn)移至PVDF 膜上，5g/dl 脫脂奶粉搖床封閉1 h，4℃條件下一抗孵育過(guò)夜，第二天加入二抗室溫孵育1 h，在蛋白成像系統(tǒng)中曝光成像。

1.3.5 Triton X-100 破膜實(shí)驗(yàn)：外泌體具有雙層膜結(jié)構(gòu)囊泡，容易被去污劑破膜溶解，而脂質(zhì)、雜蛋白不易破壞，通過(guò)檢測(cè)經(jīng)去污劑處理與未經(jīng)去污劑處理外泌體顆粒數(shù)來(lái)評(píng)估其純度。取外泌體10 μl加入10 μl 2g/dl Triton X-100，另一管10 μl 外泌體中加入10 μl PBS 作為對(duì)照組，冰上孵育1 h，納米流式檢測(cè)儀檢測(cè)1min 內(nèi)外泌體顆粒數(shù)。外泌體破膜純度百分比定義為（1-對(duì)照組外泌體顆粒數(shù)/Triton X-100 處理組外泌體顆粒數(shù)）×100%[9]。

1.4 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析 采用GraphPad Prism 8.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析, 各處理組數(shù)據(jù)采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差（±s）表示,多組間比較采用單因素方差分析。當(dāng)P<0.05，認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 外泌體粒徑分析 見(jiàn)圖1。采用納米流式檢測(cè)儀檢測(cè)外泌體的直徑。超速離心法、沉淀法和尺寸排阻色譜法提取的外泌體顆粒直徑分別為70.26±0.27，73.09±0.24，69.97±0.75nm。兩兩比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。

2.2 外泌體電鏡分析 見(jiàn)圖2。透射電鏡結(jié)果顯示，三種方法所提取的外泌體在電鏡下均呈一側(cè)凹陷半球形雙層膜囊泡，囊泡直徑在 30～200 nm 之間，但沉淀法提取的外泌體混有聚乙二醇聚合物及蛋白顆粒。

2.3 外泌體蛋白標(biāo)志物的鑒定 免疫印跡法檢測(cè)結(jié)果表明，超速離心法、沉淀法和尺寸排阻色譜法提取的血清外泌體均表達(dá)外泌體蛋白標(biāo)志物CD9，CD63 和HSP70（見(jiàn)圖3）。

圖3 免疫印跡法鑒定外泌體蛋白標(biāo)志物

2.4 外泌體提取得率及純度評(píng)估 外泌體顆粒數(shù)是評(píng)價(jià)外泌體提取得率的重要指標(biāo)，顆粒數(shù)越多表明得率越高，沉淀法提取血清外泌體顆粒數(shù)為（1.11±0.07）×1011particles/ml，高于超速離心 法（2.54±0.04）×1010particles/ml（t=20.79，P<0.001）和尺寸排阻色譜法（7.51±0.89）×1010particles/ml（t=5.39，P= 0.014），尺寸排阻色譜法提取血清外泌體顆粒數(shù)高于超速離心法（t=9.62，P< 0.001），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以外泌體顆粒數(shù)與蛋白總量比值表示外泌體的提取純度，比值越高表明外泌體純度越高。尺寸排阻色譜法提取外泌體顆粒數(shù)與蛋白總量比值為（5.66±0.45）×107particles/μg，高于超速離心法（7.65±0.42）×106particles/μg（t=18.79，P<0.001）和沉淀法（3.18±0.45）×106particles/μg（t=20.40，P<0.001），超速離心法提取外泌體顆粒數(shù)與蛋白總量比值高于沉淀法（t=4.45，P=0.046），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。以Triton X-100 處理外泌體前后顆粒數(shù)變化表示外泌體破膜純度百分比，百分比越高表明外泌體純度越高。尺寸排阻色譜法提取外泌體破膜純度百分比為（87.06±2.20）%，高于超速離心法（42.13±2.21）%（t=24.92，P<0.001）和沉淀法（26.46±5.37）%（t=18.09，P< 0.001），超速離心法提取外泌體破膜純度高于沉淀法（t=4.67，P=0.042），差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 討論

外泌體作為一種新型診斷標(biāo)志物，具有快速、高效和經(jīng)濟(jì)等多方面優(yōu)點(diǎn)，在臨床診斷和治療中具有重要的潛在應(yīng)用價(jià)值。但是由于其形成環(huán)境復(fù)雜，直徑小等原因，理想的分離技術(shù)一直是限制外泌體研究和應(yīng)用的關(guān)鍵。

超速離心法是第一種用于外泌體分離的技術(shù)，并且仍然是文獻(xiàn)中最常見(jiàn)的技術(shù)[10]。盡管它已被認(rèn)為是外泌體分離的“金標(biāo)準(zhǔn)”，但該方法仍然存在一些缺點(diǎn)[11-12]。它費(fèi)時(shí)、費(fèi)力，并且需要專用的超速離心機(jī)，此外，過(guò)高的離心速度可能會(huì)對(duì)外泌體完整性產(chǎn)生影響[13-14]。沉淀法是一種廣泛用于外泌體分離的方法，這種方法大多數(shù)都應(yīng)用了基于聚乙二醇通過(guò)離心沉淀獲得外泌體。由于其得率高、操作簡(jiǎn)單、成本低廉等優(yōu)點(diǎn)而廣受歡迎。盡管沉淀法得率高，但分離的外泌體純度通常很低，因?yàn)閹缀跛锌扇苄灶w粒也會(huì)被沉淀下來(lái)[15-16]。近年來(lái)，尺寸排阻色譜法被越來(lái)越廣泛地用作外泌體分離的第二常規(guī)選擇，它高效、操作簡(jiǎn)單且耗時(shí)短。此外，尺寸排阻色譜法使用重力流原理對(duì)外泌體結(jié)構(gòu)及功能損害最小[17]。本研究通過(guò)超速離心法、沉淀法和尺寸排阻色譜法提取血清外泌體，并比較其得率與純度。實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，三種方法均能提取出外泌體，超速離心法步驟繁瑣,耗時(shí)較長(zhǎng)，提取外泌體得率與純度較低；沉淀法操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，提取外泌體得率最高，但外泌體純度最低；尺寸排阻色譜法操作簡(jiǎn)單，耗時(shí)短，提取外泌體得率與純度最高；相比而言，尺寸排阻色譜法優(yōu)于超速離心法和沉淀法。

隨著對(duì)外泌體研究的深入，外泌體分離方法也越來(lái)越多，不同的分離方法各有特點(diǎn)。本文從得率和純度兩個(gè)方面比較了目前常用的超速離心法，沉淀法和尺寸排阻色譜法提取血清外泌體的優(yōu)缺點(diǎn)，希望能為后續(xù)外泌體的研究和應(yīng)用提供參考依據(jù)。研究人員應(yīng)該根據(jù)樣本類型、實(shí)驗(yàn)條件等選擇合理的分離方法，盡可能地在外泌體得率和純度之間找到平衡。