劉 凱，馮啟科，劉曉敏，王紅霞，安秀紅，張志華

（1. 河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 園藝學(xué)院，河北 保定 071001；2. 河北省山區(qū)工程創(chuàng)新中心/國(guó)家北方山區(qū)農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，河北 保定 071001）

非生物脅迫可影響果樹生長(zhǎng)發(fā)育，是影響果樹生存的重要因素之一［1］。其中冷害是影響植物生長(zhǎng)發(fā)育的主要環(huán)境因子，是我國(guó)農(nóng)林生產(chǎn)中的主要自然災(zāi)害［2］。輕度冷害脅迫會(huì)導(dǎo)致植物葉片、莖等形態(tài)指標(biāo)以及生物量的變化，主要表現(xiàn)在外部的形態(tài)和內(nèi)部生理代謝等方面，在外部表現(xiàn)為葉片萎蔫、黃化、枯死、結(jié)實(shí)率低等，在內(nèi)部表現(xiàn)為細(xì)胞膜被破壞、葉綠素含量和結(jié)構(gòu)被改變等，而嚴(yán)重冷害會(huì)引起植物新陳代謝紊亂甚至導(dǎo)致植株死亡［1,3-4］。因此，植物抗寒性研究是農(nóng)業(yè)和植物領(lǐng)域研究的熱點(diǎn)之一。

據(jù)研究，植物的組織結(jié)構(gòu)與耐冷脅迫能力密切相關(guān)。葉片是植物主要器官，是進(jìn)行光合作用和蒸騰作用的主要場(chǎng)所，它的形態(tài)結(jié)構(gòu)與周圍環(huán)境有著密切聯(lián)系，具有可塑性，對(duì)環(huán)境變化反應(yīng)明顯，在不同的環(huán)境下會(huì)有不同的結(jié)構(gòu)特征［5］。因此，可以通過植物葉片的顯微結(jié)構(gòu)來(lái)評(píng)判植物抗性強(qiáng)弱［6］?？购詮?qiáng)的植物具有上下表皮厚，葉肉細(xì)胞排列緊密，組織結(jié)構(gòu)緊密度大，柵欄組織厚度大，柵海比值大來(lái)適應(yīng)低溫環(huán)境［7-8］。束際林等研究發(fā)現(xiàn)能抵御更惡劣的低溫環(huán)境的植物葉肉組織發(fā)達(dá)，柵欄組織的厚度大，細(xì)胞排列緊密［9］。抗寒性強(qiáng)的菊花品種葉片和上表皮較厚，柵欄組織發(fā)達(dá)，葉肉細(xì)胞排列緊密，抗寒性差的品種則恰好相反［10］；杏品種的抗寒性與葉片組織的緊密度成正相關(guān)，與疏松海綿組織厚度的指數(shù)成負(fù)相關(guān)［11］；通過對(duì)比低溫脅迫下大葉黃楊和小葉黃楊的葉片結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，柵海比高，組織細(xì)胞排列越緊密都有利于植物提高抗寒能力［12］；曹紅星等［13］解剖低溫處理下椰樹葉片的結(jié)構(gòu)發(fā)現(xiàn)，低溫脅迫時(shí)間越長(zhǎng)，海綿組織和柵欄組織結(jié)構(gòu)變得越不規(guī)則。

植物在長(zhǎng)期進(jìn)化過程中，通過改變自身的結(jié)構(gòu)特點(diǎn)對(duì)一些生理生化活動(dòng)進(jìn)行調(diào)節(jié)，以適應(yīng)脅迫環(huán)境，如葉形變小、葉片增厚、角質(zhì)層厚、表皮毛多、葉肉組織緊密等結(jié)構(gòu)特征均是植物抗性強(qiáng)的表現(xiàn)。在我國(guó)北方農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中存在的主要問題是倒春寒和晚霜等冷害，其影響遠(yuǎn)大于其他環(huán)境因素［14］。因核桃（Juglans regiaL.）其枝條含水量比較高且髓心大，所以冷害會(huì)影響其生長(zhǎng)，甚至?xí)绊懞颂耶a(chǎn)量和經(jīng)濟(jì)效益［15-16］。本研究以‘清香’和‘遼寧8 號(hào)’葉片為試材，通過石蠟切片技術(shù)觀察冷脅迫不同時(shí)間下核桃葉片顯微結(jié)構(gòu)，通過分析葉片表皮厚度、柵欄組織、柵海比、CTR、韌皮部、木質(zhì)部等指標(biāo)，了解冷脅迫對(duì)核桃葉片組織結(jié)構(gòu)的影響，旨在為核桃耐冷脅迫品種選育及耐冷脅迫分子機(jī)制研究提供材料基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 供試材料

試驗(yàn)材料位于河北農(nóng)業(yè)大學(xué)標(biāo)本園，2018 年盆栽播種，2019 年同一砧木嫁接‘遼寧8 號(hào)’和‘清香’。用于后續(xù)研究的試驗(yàn)材料分為正常組（0.5 ℃冷處理0 h）和0.5 ℃冷處理4、8、12、24、36、48 h。選取植株上部東南方向健康復(fù)葉上左起第3 枚小葉備用，3 次重復(fù)。

1.2 試驗(yàn)方法

切取大小一致的核桃葉片經(jīng)過固定、脫水、透明、浸蠟后包埋在石蠟中，進(jìn)行修塊，YD-3 旋轉(zhuǎn)式切片機(jī)進(jìn)行切片，切出蠟帶后粘附在載玻片上，烘干水分后用番紅固綠進(jìn)行染色，再接著進(jìn)行封片，晾干后在H-2 顯微鏡（Olympus）下進(jìn)行觀察，并且測(cè)量數(shù)據(jù)，15 個(gè)重復(fù)，利用Mvlmage vt 進(jìn)行數(shù)據(jù)整理。

1.3 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2017 和 SPSS 20.0 軟件進(jìn)行方差和顯著性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 核桃葉片的橫切結(jié)構(gòu)

‘遼寧8 號(hào)’和‘清香’葉片中（圖1、2）海綿組織和柵欄組織分化明顯，屬于典型的異面葉，兩者組織結(jié)構(gòu)十分相似，包括表皮、葉肉和葉脈。表皮分為上表皮和下表皮，均由單層細(xì)胞組成，橫切面呈扁圓形，排列緊密，表皮外壁有較厚的角質(zhì)層，近上表皮為長(zhǎng)柱狀細(xì)胞組成的柵欄組織，近下表皮處為多層排列疏松的海綿組織細(xì)胞。

圖1 ‘清香’核桃葉片結(jié)構(gòu)(×40)Fig.1 Leaf structure of ‘Qingxiang’walnut (×40)

圖2 ‘遼寧8 號(hào)’核桃葉片結(jié)構(gòu)(×40)Fig.2 Leaf structure of ‘Liaoning No.8’ (×40)

2.2 冷脅迫對(duì)葉片厚度的影響

由圖3 可知，冷脅迫0 h 的‘遼寧8 號(hào)’和‘清香’2 個(gè)品種葉片厚度有所差異，‘遼寧8 號(hào)’的葉片厚度為202.26 μm，‘清香’的葉片厚度為183.86 μm。2 個(gè)品種經(jīng)過低溫處理后，在脅迫24 h前葉片厚度均呈先上升后下降趨勢(shì)，‘清香’在12 h 出現(xiàn)最大值，升高了1.35 倍。24 ～48 h‘清香’出現(xiàn)不規(guī)則變化?！|寧8 號(hào)’的葉片厚度在低溫處理0 ～8 h 時(shí)有所升高，在8 h 處達(dá)到最大值，之后葉片厚度逐漸降低，且差異較顯著，‘清香’的葉片厚度在處理12 h 時(shí)到達(dá)最大值后呈下降趨勢(shì)，且差異顯著。

圖 3 冷脅迫處理對(duì)核桃葉片厚度的影響Fig. 3 Effect of chilling treatment on leaf thickness in walnuts

2.3 冷脅迫處理對(duì)表皮厚度的影響

由圖4 可知，冷脅迫0 h 時(shí)，‘清香’上表皮厚度為14.64 μm，‘遼寧8 號(hào)’為15.88 μm，‘清香’下表皮厚度為12.68 μm，‘遼寧8 號(hào)’為14.87 μm，2 個(gè)品種表皮厚度很接近，但‘遼寧8 號(hào)’表皮厚度大于‘清香’。在冷脅迫下，2 個(gè)品種表皮厚度變化趨勢(shì)相同，‘清香’上表皮與下表皮均在冷脅迫處理12 h 時(shí)達(dá)到最大值，且變化顯著，是0 h 的1.6 倍和1.26 倍；‘遼寧8 號(hào)’上表皮與下表皮均在冷脅迫處理12 h 時(shí)達(dá)到最大值，是0 h 的1.39倍。由此可知，低溫脅迫會(huì)使葉片表皮厚度先增加后下降。

圖 4 冷脅迫處理對(duì)核桃葉片表皮厚度的影響.Fig.4 Effect of cold treatment on epidermal thickness in walnuts.

2.4 冷脅迫處理對(duì)柵欄組織的影響

如圖5 所示，冷脅迫0 h 時(shí)‘清香’柵欄組織厚度為81.70 μm，‘遼寧8 號(hào)’柵欄組織厚度為84.90 μm。發(fā)生冷脅迫后，0 ～24 h 2 個(gè)品種柵欄組織厚度均呈先上升后下降趨勢(shì)，‘清香’在低溫脅迫12 h 時(shí)達(dá)到最大值，是0 h 的1.14 倍；‘遼寧8 號(hào)’在低溫脅迫8 h 時(shí)達(dá)到最大值，是0 h 的1.09 倍，且變化顯著；在24 h 時(shí)最小，下降了31%。2 個(gè)品種柵欄組織變化趨勢(shì)與葉片厚度變化趨勢(shì)一致。

圖 5 冷脅迫處理下對(duì)核桃葉片柵欄組織厚度的影響Fig.5 Effect of chilling treatment on palisade tissue thickness in walnuts

2.5 冷脅迫處理對(duì)海綿組織厚度的影響

如圖6 所示，冷脅迫0 h 時(shí)‘清香’葉片海綿組織厚度為72.59 μm，‘遼寧8 號(hào)’葉片海綿組織厚度為54.53 μm。冷脅迫發(fā)生后，2 個(gè)品種均呈先上升后下降趨勢(shì)，‘清香’在低溫脅迫12 h 時(shí)達(dá)到最大值，‘遼寧8 號(hào)’在低溫脅迫8 h 時(shí)達(dá)到最大值，且變化顯著，與柵欄組織、葉片厚度變化趨勢(shì)一致。

圖 6 冷脅迫處理對(duì)核桃葉片海綿組織厚度的影響Fig.6 Influence of chilling treatment on tissue thickness of sponge in walnuts

2.6 不同低溫處理對(duì)柵海比值的影響

柵海比在抗性分析中經(jīng)常作為重要指標(biāo)。由圖7 所示，冷脅迫0 h‘清香’的柵海比低于‘遼寧8 號(hào)’，冷脅迫開始后2 個(gè)品種的柵海比均呈現(xiàn)先下降再上升的趨勢(shì)，而且‘清香’的柵海比低于‘遼寧8 號(hào)’。‘清香’在冷脅迫24 h 時(shí)比值最低，下降至0 h 的54%。‘遼寧8 號(hào)’在冷脅迫8 ～12 h 時(shí)比值最低，下降至0 h 的61%。

圖7 冷脅迫處理核桃葉片柵海比值的影響Fig.7 Influence of chilling treatment on the ratio of palisade tissue to spongy tissue in walnuts

2.7 不同低溫處理對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度（ST）的影響

細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度也經(jīng)常作為抗性指標(biāo)。如圖8所示，冷脅迫后，‘清香’與‘遼寧8 號(hào)’的細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度均呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢(shì)，均在12 h達(dá)到最大值，是0 h 的1.52 倍和1.55 倍,‘清香’的ST 始終高于‘遼寧8 號(hào)’。

圖8 冷脅迫處理對(duì)核桃葉片細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊疏松度（ST）的影響Fig.8 Effect of chilling treatment on ST in walnuts

2.8 不同低溫處理對(duì)細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）的影響

細(xì)胞結(jié)構(gòu)緊密度也經(jīng)常作為抗性指標(biāo)。如圖9所示，低溫脅迫前后，‘清香’的CTR 均低于‘遼寧8 號(hào)’，且2 個(gè)品種在低溫處理后葉片葉肉組織排列變得緊密，均呈現(xiàn)先下降后上升的趨勢(shì)，‘清香’在冷脅迫24 h 出現(xiàn)最低值，下降至0 h 的72.80%；‘遼寧8 號(hào)’在12 h 出現(xiàn)最低值，下降至0 h 的76%。由此看出，‘遼寧8 號(hào)’能夠提前對(duì)冷脅迫進(jìn)行響應(yīng)。

圖9 冷脅迫處理對(duì)核桃葉片結(jié)構(gòu)緊密度（CTR）的影響Fig.9 Effect of chilling treatment on CTR in walnuts

2.9 冷脅迫下核桃葉片組織變化相關(guān)性分析

利用SPSS 18.0 對(duì)冷脅迫下核桃葉片組織變化相關(guān)性分析（表1、2）。

表1 冷脅迫下‘清香’核桃葉片組織變化相關(guān)性分析Table 1 Correlation analysis of leaf tissue changes of ‘Qingxiang’ under chilling stress

表2 冷脅迫下‘遼寧8 號(hào)’核桃葉片組織變化相關(guān)性分析Table 2 Correlation analysis of leaf tissue changes of ‘Liaoning NO.8’ under chilling stress

在冷脅迫下，‘清香’柵欄組織與葉片厚度呈極顯著正相關(guān)，與CTR 呈顯著相關(guān)；海綿組織厚度與葉片厚度呈顯著正相關(guān)；下表皮厚度與柵海比呈顯著負(fù)相關(guān)，與ST 呈顯著正相關(guān)。在冷脅迫下，‘遼寧8 號(hào)’柵欄組織厚度與海綿組織厚度呈現(xiàn)顯著相關(guān)，與葉片厚度呈現(xiàn)極顯著正相關(guān)，與CTR 呈現(xiàn)顯著負(fù)相關(guān)；海綿組織厚度與葉片厚度和ST 呈顯著正相關(guān)，與柵海比呈極顯著負(fù)相關(guān)，與CTR 呈顯著負(fù)相關(guān)；葉片厚度與CTE 呈顯著負(fù)相關(guān)；上表皮厚度與下表皮厚度呈極顯著正相關(guān)；下表皮與CTR 呈顯著負(fù)相關(guān)；ST 與柵海比呈極顯著負(fù)相關(guān)。

3 討論與結(jié)論

葉片植物暴露在環(huán)境中重要的器官，其中冷害是影響其生長(zhǎng)發(fā)育最重要的生態(tài)因子［17］。葉片是進(jìn)行光合作用和蒸騰作用的主要器官，葉片通過組織結(jié)構(gòu)變化來(lái)響應(yīng)環(huán)境變化［18］。因此葉片結(jié)構(gòu)指標(biāo)的變化常被用來(lái)作為植物抗寒鑒定的依據(jù)之一。

大量研究表明，觀察葉片顯微結(jié)構(gòu)變化是反應(yīng)植物響應(yīng)非生物脅迫的重要方法。云琳穎等［17］采用石蠟制片法對(duì)5 種不同品種的核桃品種葉片結(jié)構(gòu)進(jìn)行分析，并篩選出抗性強(qiáng)的品種海綿組織厚度要小于抗性差的品種，并且柵欄組織也小于抗性差的品種。曹紅星等［19］研究指出葉片受傷害情況與溫度呈正相關(guān)。其中油棕葉片組織疏松度（SR）在不同低溫處理下變化明顯，可作為抗性的結(jié)構(gòu)指標(biāo)。馬婷［20］等對(duì)12 個(gè)云南核桃品種葉片顯微結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察綜合評(píng)價(jià)，認(rèn)為葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度、海綿組織厚度是影響核桃抗寒性能的重要指標(biāo)。于龍鳳等［21］認(rèn)為低溫弱光處理使西葫蘆表皮細(xì)胞厚度、柵欄組織厚度、葉片厚度、海綿組織減小。李琦瑤等［22］認(rèn)為低溫脅迫下，烤煙幼苗葉片組織結(jié)構(gòu)緊密度降低，葉片組織結(jié)構(gòu)疏松度增加，證明低溫脅迫破壞了葉片的組織結(jié)構(gòu)。在本研究中，通過分析冷脅迫不同時(shí)間下葉片表皮厚度、柵欄組織、柵海比、CTR 等結(jié)構(gòu)，冷脅迫使葉片厚度先增加后降低；會(huì)使表皮厚度增加，細(xì)胞緊密度先下降后增加，細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度先增加后下降，均體現(xiàn)了冷脅迫對(duì)核桃葉片組織的破壞，與柵欄組織相比，海綿組織受到的迫害更為嚴(yán)重。以細(xì)胞結(jié)構(gòu)疏松度和細(xì)胞緊密度為標(biāo)準(zhǔn)評(píng)價(jià)‘遼寧8 號(hào)’和‘清香’，‘遼寧8 號(hào)’的耐冷脅迫能力要強(qiáng)于‘清香’。