苗天姿，趙 款,2，雷白時(shí),2，張武超,2，龐敬紅，梁 飛，袁萬(wàn)哲,2，汪恩強(qiáng)

（1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 動(dòng)物醫(yī)學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北省獸醫(yī)生物技術(shù)工程技術(shù)創(chuàng)新中心,河北 保定 071001；3.河北伯瑞動(dòng)物藥業(yè)有限公司，河北 正定 050800）

目前，中國(guó)養(yǎng)雞規(guī)模在逐漸加大，集約化的程度在不斷提高，但病毒性傳染病仍然是困擾養(yǎng)禽業(yè)健康發(fā)展的重大問(wèn)題。白細(xì)胞介素-2（interleukin-2，IL-2）作為免疫因子網(wǎng)絡(luò)的重要成員，可促進(jìn)和維持T 淋巴細(xì)胞的生長(zhǎng)，促進(jìn)細(xì)胞毒性T 淋巴細(xì)胞和NK細(xì)胞等殺傷細(xì)胞的分化以及其效應(yīng)能力的增強(qiáng)［1］；能夠促進(jìn)CD4+T 細(xì)胞分化為T(mén)h1 和Th2 細(xì)胞，提高機(jī)體的細(xì)胞免疫和體液免疫的應(yīng)答水平。在哺乳動(dòng)物中，IL-2 促進(jìn)多種病毒病原體的清除并降低其致病性。在結(jié)膜中接種單純皰疹病毒（HSV-1）的IL-2 基因敲除小鼠與IL-2 對(duì)照小鼠相比，死亡率更高，眼部病毒復(fù)制程度增加，眼瞼炎更明顯［2］。用重組IL-2 治療BALB/c 小鼠可降低小鼠巨細(xì)胞病毒（CMV）在體內(nèi)的復(fù)制［3］。Susta 等［4］通過(guò)新城疫病毒強(qiáng)毒株共表達(dá)雞IL-2，發(fā)現(xiàn)IL-2 的表達(dá)降低了雞體血液和局部組織的病毒載量，但不足以降低感染雞的死亡率，以上研究表明，具有抗病毒特性的單個(gè)基因的表達(dá)可能不足以顯著提高動(dòng)物抗病毒感染的存活率。

近年來(lái)，雞α干擾素（interferon alpha，IFN-α）因其廣譜的抗病毒活性和免疫增強(qiáng)作用，成為了病毒學(xué)、分子生物學(xué)、免疫學(xué)等眾多相關(guān)領(lǐng)域的研究熱點(diǎn)，為畜牧生產(chǎn)中增強(qiáng)雞免疫力、減少發(fā)病和死亡、提升屠宰率等提供了重要的方向［5-6］。研究表明，重組IFN-α 蛋白對(duì)新城疫病毒［7］、傳染性法氏囊炎病毒［8］及禽腺病毒［9］均具有抑制作用。IFN-α具有巨大的抗病毒潛力，但并不直接作用于病毒，而是經(jīng)誘導(dǎo)細(xì)胞通過(guò)JAK-STAT 通路，啟動(dòng)大量下游干擾素刺激基因（Interferon-stimulated genes，ISGs）轉(zhuǎn)錄和表達(dá)，產(chǎn)生抗病毒蛋白，進(jìn)而實(shí)現(xiàn)抗病毒作用，使宿主細(xì)胞或臨近細(xì)胞建立抗病毒狀態(tài)［10］。迄今為止已經(jīng)篩選鑒定的ISGs 有300 多種，在病毒生命的各個(gè)階段都有ISGs 的參與。ISGs 具有抗病毒及免疫調(diào)節(jié)等多種功能，能夠通過(guò)不同的途徑抵御病毒入侵和復(fù)制，達(dá)到清除體內(nèi)病毒的作用［11］。因此，可以通過(guò)檢測(cè)ISGs 的轉(zhuǎn)錄水平來(lái)驗(yàn)證重組Ⅰ型干擾素的生物學(xué)活性。

目前，人醫(yī)臨床上已廣泛應(yīng)用人基因工程rIFN-α 和rIL-2 制劑治療病毒性疾病和腫瘤性疾病，但在獸醫(yī)臨床中尚沒(méi)有基因工程rChIFN-α和rChIL-2 制劑可用。已有多項(xiàng)研究證實(shí)，IL-2 與IFN-α 在體外具有協(xié)同作用，基于目前獸醫(yī)臨床中對(duì)抗病毒制劑的迫切需求，本試驗(yàn)設(shè)計(jì)了重組雞IL-2-IFN-α 嵌合基因，并且表達(dá)了rChIL-2-IFN-α 融合蛋白，在此基礎(chǔ)上對(duì)rChIL-2-IFN-α 融合蛋白在體外的生物學(xué)活性進(jìn)行檢測(cè)，驗(yàn)證融合蛋白對(duì)淋巴細(xì)胞的增殖活性和抗病毒活性，為進(jìn)一步探索融合蛋白在體內(nèi)、外活性的相關(guān)性奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 細(xì)胞、病毒及主要試劑

BL21（DE3）感受態(tài)細(xì)胞購(gòu)自北京全式金生物技術(shù)有限公司；9 日齡SPF 雞胚購(gòu)自瑞普生物藥業(yè)；DMEM 培養(yǎng)基、RPMI-1640 完全培養(yǎng)基、胎牛血清（FBS）購(gòu)于美國(guó)Gibco 公司；雞淋巴細(xì)胞分離液購(gòu)自北京索來(lái)寶科技有限公司；水皰性口炎病毒（VSV）由本實(shí)驗(yàn)室保存；重組雞干擾素α（rChIFN-α）、重組雞白介素2（rChIL-2）均由本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建并保存，濃度為1.6 mg/mL。

1.2 重組IL-2-IFN-α基因的合成

參照GenBank 登錄的ChIL-2 序列（ 登錄號(hào)：AF000631） 和ChIFN-α 基因序列( 登錄號(hào)：EU937528），將信號(hào)肽序列去除，使用柔性linker 連接ChIL-2 和ChIFN-α。在嵌合基因兩段加入酶切位點(diǎn)BamH I 和XhoⅠ，送至生工生物工程（上海）股份有限公司，進(jìn)行密碼子優(yōu)化并合成重組質(zhì)粒pET-32a-ChIL-2-IFN-α。對(duì)表達(dá)載體多克隆位點(diǎn)的限制性內(nèi)切酶設(shè)計(jì)特異性引物ChII-F 和ChII-R，引物序列見(jiàn)表1, 下劃線部分為BamH I 和XhoⅠ酶切位點(diǎn)。linker 序列：5’-GGTGGTGGTTCTGGTGGTGGT-3’

1.3 重組融合蛋白的表達(dá)及表達(dá)形式的鑒定

將重組質(zhì)粒pET-32a-ChIL-2-IFN-α 轉(zhuǎn)入感受態(tài)細(xì)胞BL21（DE3），使用引物ChII-F 和ChII-R對(duì)單菌落進(jìn)行鑒定。將鑒定為陽(yáng)性的轉(zhuǎn)化菌進(jìn)行擴(kuò)大培養(yǎng)，按體積比1∶100 接種到新的LB 中（含Amp），37 ℃ 200 r/min 振蕩培養(yǎng)， 待OD600為0.4 ～0.6 時(shí)，加入終濃度1.0 mmol/L 的IPTG，誘導(dǎo)4 h，離心收集菌體，超聲波破碎（360 W、30%、10 min）2 次后，分離上清液和沉淀，制備樣品，進(jìn)行SGS-PAGE 檢測(cè)。

1.4 重組融合蛋白的純化和復(fù)性

參照Ni-Agatose Resin 純化說(shuō)明書(shū)進(jìn)行蛋白純化，將純化后的蛋白按下列方法進(jìn)行透析復(fù)性：基礎(chǔ)復(fù)性液為PBS，尿素透析梯度為6、4、2、0 mol/L，每個(gè)梯度透析2 h，最后在PBS 中透析24 h，吸出透析袋中的液體，NanoDrop2000 測(cè)定濃度，置于-20 ℃ 保存。

1.5 雞外周血T淋巴細(xì)胞的分離與培養(yǎng)

參照雞淋巴細(xì)胞分離液說(shuō)明書(shū)分離37 日齡SPF雞外周血T淋巴細(xì)胞（PBLC），調(diào)整每毫升培養(yǎng)液約含PBLC 細(xì)胞數(shù)1×106個(gè)并加入到96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板，每孔100 μL。采用RPMI-1640 完全培養(yǎng)基將rChIFN-α 蛋白、rChIL-2 蛋白和rChIL-2-IFN-α融合蛋白進(jìn)行2 倍倍比稀釋至1∶28，每個(gè)稀釋度重復(fù)3 孔，100 μL/孔，同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照組和PBS 對(duì)照組，置于5% CO2，37 ℃培養(yǎng)72 h；使用MTT 法經(jīng)酶聯(lián)免疫檢測(cè)儀在570 nm 波長(zhǎng)下測(cè)OD值，取每個(gè)稀釋度所有OD570值的平均值代表該組的數(shù)值。

1.6 重組融合蛋白抗病毒活性的測(cè)定

制備9 日齡SPF 雞胚成纖維細(xì)胞（CEF），采用50% 細(xì)胞病變抑制法測(cè)定rChIFN-α 蛋白和rChIL-2-IFN-α 融合蛋白在CEF 細(xì)胞上抗水皰性口炎病毒（VSV）增殖活性。CEF 細(xì)胞在96 孔細(xì)胞培養(yǎng)板生長(zhǎng)至單層后，每孔分別加入100 μL 經(jīng)過(guò)4 倍倍比稀釋的rChIFN-α 蛋白和rChIL-2-IFN-α 融合蛋白，每一稀釋度設(shè)8 個(gè)重復(fù)孔。同時(shí)設(shè)立細(xì)胞對(duì)照組、重組蛋白對(duì)照組和VSV 對(duì)照組，觀察并記錄結(jié)果，按照Reed-Muench 法計(jì)算rChIFN-α 蛋白和rChIL-2-IFN-α 融合蛋白的抗病毒活性。

1.7 干擾素刺激基因轉(zhuǎn)錄水平的測(cè)定

使用能夠完全抑制VSV 感染且劑量較低的rChIFN-α 蛋白和rChIL-2-IFN-α 融合蛋白分別對(duì)CEF 進(jìn)行孵育，于不同時(shí)間收集細(xì)胞，采用Trizol 法抽提細(xì)胞總RNA，將總RNA 樣品反轉(zhuǎn)錄得到cDNA。根據(jù)NCBI 中的基因序列信息，設(shè)計(jì)OAS、IFIT5、Mx特異性引物，其余引物參考文獻(xiàn)，選用GAPDH 作為內(nèi)參基因。引物均由生工生物工程有限公司合成，引物序列見(jiàn)表1。RT-qPCR 反應(yīng)體系20 μL：2×AgueGreen qPCR Master Mix 10 μL，上、下游引物各1 μL，cDNA模板1 μL，ddH2O 7 μL。反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min；95 ℃變性20 s，58 ℃退火20 s，72 ℃延伸20 s，45 個(gè)循環(huán)；進(jìn)行熔解曲線分析，95 ℃ 10 s，65 ℃ 60 s，97 ℃ 1 s。

表1 引物序列信息Table 1 Primer sequences information

續(xù)表：

1.8 數(shù)據(jù)的統(tǒng)計(jì)與分析

通過(guò)RT-qPCR 檢測(cè)后，數(shù)據(jù)處理采用2-△△Ct法計(jì)算。通過(guò)IBM SPSS Statistics 26 軟件，采用t檢驗(yàn)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，以P＜0.05 為差異顯著性判斷標(biāo)準(zhǔn)，采用GraphPad Prism 8 軟件作圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 重組融合蛋白的表達(dá)及表達(dá)形式的鑒定

如圖1 所示，SDS-PAGE 結(jié)果表明，含有陽(yáng)性質(zhì)粒pET-32a-ChIL-2-IFN-α 的重組菌經(jīng)IPTG 誘導(dǎo)表達(dá)后，在55 kD 出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，與rChIL-2-IFN-α 融合蛋白預(yù)期大小一致。rChIL-2-IFN-α融合蛋白以包涵體形式表達(dá)。

圖1 rChIL-2-IFN-α融合蛋白表達(dá)方式的SDS-PAGE 分析Fig.1 The SDS-PAGE analysis of rChIL-2-IFN-α fusion protein expression

2.2 重組融合蛋白的純化和復(fù)性

如圖2 所示，SDS-PAGE 結(jié)果表明，純化和復(fù)性后的重組融合蛋白均在55 kD 處出現(xiàn)單一條帶，無(wú)雜帶出現(xiàn)，說(shuō)明純化和復(fù)性效果良好，使用微量分光光度計(jì)測(cè)得重組融合蛋白在復(fù)性后濃度達(dá)到1.6 mg/mL。

圖 2 rChIL-2-IFN-α 融合蛋白純化、復(fù)性后的SDS-PAGE 分析Fig.2 The SDS-PAGE analysis of rChIL-2-IFN-α fusion protein after purification and refold

2.3 重組融合蛋白促雞外周淋巴細(xì)胞（PBLC）增殖活性

如表2 所示，rChIFN-α 蛋白、rChIL-2 蛋白和rChIL-2-IFN-α 融合蛋白對(duì)PBLC 均有增殖活性。rChIFN-α 蛋白、rChIL-2 蛋白和rChIL-2-IFN-α 融合蛋白對(duì)PBLC 起增殖作用的稀釋比例范圍分別為1∶21～25、1∶21～27和1∶21～27。3 種重組蛋白對(duì)PBLC 起最大增殖作用的稀釋比例均為1∶24，在此稀釋度下，rChIL-2-IFN-α 融合蛋白對(duì)PBLC的增殖作用高于rChIFN-α 蛋白和rChIL-2 蛋白，與不同蛋白組之間均呈現(xiàn)極顯著差異（P＜0.01）。

表2 不同稀釋比例重組蛋白刺激PBLC 后的OD570Table 2 OD570 after stimulation of PBLC with recombinant proteins at different dilution ratio

2.4 重組融合蛋白抗病毒活性

通過(guò)CEF-VSV 系統(tǒng)檢測(cè)rChIL-2-IFN-α 融合蛋白和rChIFN-α 蛋白的抗病毒活性，結(jié)果顯示，rChIL-2-IFN-α 稀釋到4-5時(shí)，累計(jì)細(xì)胞無(wú)病變百分比為77.0%；稀釋到4-6時(shí)，累計(jì)細(xì)胞無(wú)病變百分比為6.70%。參照Reed-Muench 法，計(jì)算距離比例為（高于50%細(xì)胞無(wú)病變百分比－50%）/（高于50%細(xì)胞無(wú)病變百分比－低于50%細(xì)胞無(wú)病變百分比）=（77.0%-50%）/（77.0%-6.70%）=0.76，可得重組融合蛋白的活性效價(jià)為45+0.76U/0.1 mL 即2.94×104U/mL。同理rChIFN-α 蛋白的抗病毒效價(jià)為3.42×104U/mL。

2.5 干擾素刺激基因的轉(zhuǎn)錄水平

以0.2 mg/mL 的rChIFN-α 蛋白和rChIL-2-IFN-α 融合蛋白刺激CEF 細(xì)胞，ISGs 在轉(zhuǎn)錄水平的動(dòng)態(tài)變化如圖3 所示。相比于對(duì)照組，rChIFN-α蛋白和rChIL-2-IFN-α 融合蛋白顯著增加了5 種ISGs 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平。以rChIFN-α 蛋白刺激CEF，IFIT5、Viperin 和OAS 的轉(zhuǎn)錄水平分別在36、48 和24 h 后回落到與PBS 對(duì)照組無(wú)顯著差異的水平（P＞0.05）；而以rChIL-2-IFN-α 融合蛋白刺激CEF 細(xì)胞，5 種ISGs 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在48 h 內(nèi)持續(xù)保持在較高水平，均能夠與PBS 對(duì)照組保持極顯著差異（P＜0.01）。

圖 3 rChIFN-α 蛋白和 rChIL-2-IFN-α 融合蛋白刺激CEF細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)ISGs 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平Fig. 3 ISGs mRNA transcription levels at different time points of CEF cells after protein rChIFN-α and fusion protein rChIL-2-IFN-α stimulation

2.6 內(nèi)源性Ⅰ型干擾素的轉(zhuǎn)錄水平

如圖4 所示，以0.2 mg/mL 的rChIFN-α 蛋白和rChIL-2-IFN-α 融合蛋白刺激CEF 細(xì)胞，二者均引起了內(nèi)源性IFN-α 和IFN-β 轉(zhuǎn)錄水平的上調(diào)，且呈現(xiàn)了相似的變化規(guī)律。在2 種重組蛋白的刺激下，內(nèi)源性IFN-α 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在9 h 開(kāi)始上調(diào)并呈現(xiàn)峰值，與PBS 對(duì)照組出現(xiàn)極顯著差異（P＜0.01）；內(nèi)源性IFN-β 的mRNA 轉(zhuǎn)錄水平在6 h 開(kāi)始上調(diào)，在9 h 達(dá)到峰值，與PBS 對(duì)照組出現(xiàn)極顯著差異（P＜0.01）。

圖 4 rChIFN-α 蛋白和rChIL-2-IFN-α 融合蛋白刺激CEF 細(xì)胞后不同時(shí)間內(nèi)源性IFN-α 和IFN-β 的 mRNA 轉(zhuǎn)錄水平Fig.4 Endogenous IFN-α and IFN-β mRNA transcription levels at different time points of CEF cells after protein rChIFN-α and fusion protein rChIL-2-IFN-α stimulation

3 討論與結(jié)論

本試驗(yàn)表達(dá)的rChIL2-IFN-α 融合蛋白具有抗病毒和促淋巴細(xì)胞增殖的雙重活性。就rChIL2-IFN-α融合蛋白的抗病毒活性來(lái)看，其抗病毒效價(jià)低于單一的rChIFN-α 蛋白，而促PBLC 增殖活性卻高于單一的rChIL-2 蛋白，推測(cè)這是由于融合蛋白中使用了較短的linker 造成的結(jié)果。linker 的長(zhǎng)度是融合蛋白活性的重要影響因素，研究發(fā)現(xiàn)以（Gly4Ser）3為linker 的融合蛋白能夠在復(fù)性時(shí)降低融合蛋白的兩組份之間的空間位阻，從而有利于融合蛋白各個(gè)結(jié)構(gòu)域的正確折疊［15］。然而linker 的長(zhǎng)度過(guò)長(zhǎng)，也會(huì)使融合蛋白對(duì)蛋白酶更敏感，導(dǎo)致融合蛋白在生產(chǎn)過(guò)程中的產(chǎn)量下降?？紤]到未來(lái)針對(duì)融合蛋白在產(chǎn)業(yè)化上的開(kāi)發(fā)和生產(chǎn)，為了克服融合蛋白被酶分解的問(wèn)題，以及降低融合蛋白在機(jī)體內(nèi)的抗原性，本試驗(yàn)選取了較短的linker 即GGGSGGG 對(duì)2 個(gè)蛋白組分進(jìn)行連接，以期增加融合蛋白的產(chǎn)量。

干擾素是抵抗病毒感染的第一道防線，也是先天免疫反應(yīng)的關(guān)鍵組成部分。Ⅰ型IFN 通過(guò)JAKSTAT 信號(hào)通路發(fā)出信號(hào)，以刺激ISGs 等抗病毒效應(yīng)物的產(chǎn)生。通過(guò)檢測(cè)IFN 信號(hào)通路下游ISGs 的轉(zhuǎn)錄水平，能夠更直觀地證實(shí)重組融合蛋白的抗病毒潛力。Mx主要在病毒入侵機(jī)體后阻礙病毒的核酸進(jìn)入細(xì)胞的早期轉(zhuǎn)錄，能夠抑制流感病毒、水皰性口炎等多種病毒的復(fù)制［16-18］；OAS 經(jīng)雙鏈RNA（dsRNA）激活后通過(guò)內(nèi)源性的RNase L 降解病毒和宿主的RNA，進(jìn)而發(fā)揮抗病毒作用；IFIT5 廣譜抑制宿主細(xì)胞的翻譯過(guò)程，進(jìn)而降低細(xì)胞內(nèi)病毒的滴度［19］；Viperin主要定位在線粒體上，可調(diào)節(jié)膽固醇、類異戊二烯生物合成、脂筏以及脂肪滴的組成，從而對(duì)多種DNA 和RNA 病毒的復(fù)制、成熟、釋放等過(guò)程產(chǎn)生抑制作用［20］。ISG12 是近年來(lái)受到關(guān)注的干擾素刺激基因，它能夠調(diào)節(jié)JAK-STAT通路來(lái)發(fā)揮抗病毒作用。在王盛等［21］研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)ARV 感染的DF-1 細(xì)胞，其OAS、ISG12、IFIT5在36 h 前的轉(zhuǎn)錄水平始終處于下調(diào)，在36 ～96 h內(nèi)才有小幅度上調(diào)，直至96 h 才出現(xiàn)了與對(duì)照組顯著的差異，而Viperin、Mx的轉(zhuǎn)錄水平均在96 h 內(nèi)表現(xiàn)為下調(diào)。在本研究中，使用外源重組的rChIL-2-IFN-α 融合蛋白刺激CEF，顯著增加了CEF 中OAS、ISG12、IFIT5、Mx和Viperin的mRNA 水平，能夠在3 h 內(nèi)快速激起各ISG 的轉(zhuǎn)錄并且在48 h 內(nèi)維持了較高的轉(zhuǎn)錄水平，說(shuō)明本研究表達(dá)的rChIL-2-IFN-α 融合蛋白存在一定的的抗病毒潛力。另外，本試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，由rChIFN-α 蛋白所刺激的IFIT5、Viperin和OAS 的轉(zhuǎn)錄水平在較短時(shí)間內(nèi)就下降到與對(duì)照組無(wú)差異的水平，而經(jīng)rChIL-2-IFN-α 融合蛋白刺激的5 種ISGs 均能在48 h 內(nèi)保持高水平的轉(zhuǎn)錄，推測(cè)rChIL-2-IFN-α 融合蛋白通過(guò)融合表達(dá)的構(gòu)建，延長(zhǎng)了IFN 所介導(dǎo)信號(hào)通路的活躍時(shí)間，使得各種具有抗病毒作用的ISGs 保持了高水平的轉(zhuǎn)錄。

為了避免CEF 細(xì)胞內(nèi)源性IFN-α 和IFN-β 對(duì)所檢測(cè)的ISGs 造成的干擾，本試驗(yàn)同樣檢測(cè)了內(nèi)源性干擾素的轉(zhuǎn)錄水平。試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，在不施加重組干擾素刺激時(shí)，內(nèi)源性干擾素的轉(zhuǎn)錄水平基本保持穩(wěn)定，而通過(guò)外源rChIL-2-IFN-α 融合蛋白刺激后，內(nèi)源性IFN-α 和IFN-β 的轉(zhuǎn)錄水平在6 ～9 h 開(kāi)始上調(diào)，說(shuō)明在6 h 之前，本實(shí)驗(yàn)室制備的rChIL-2-IFN-α 融合蛋白是能夠獨(dú)立激起ISGs 轉(zhuǎn)錄水平快速提高的信號(hào)分子。朱安靜等［22］報(bào)道，ISG12 能夠形成正反饋機(jī)制，通過(guò)調(diào)節(jié)IFN 上游的關(guān)鍵信號(hào)分子促進(jìn)內(nèi)源性IFN 的產(chǎn)生，這一結(jié)果與本試驗(yàn)的發(fā)現(xiàn)相符。

綜上所述，rChIL-2-IFN-α 融合蛋白在體外具有良好的促PBLC 增殖活性和抗病毒活性，能夠快速提高CEF 細(xì)胞中多種ISGs 的轉(zhuǎn)錄水平，并在長(zhǎng)時(shí)間內(nèi)維持了ISGs 的高水平轉(zhuǎn)錄，暗示了rChIL-2-IFN-α 融合蛋白在IFN 信號(hào)通路中的長(zhǎng)效作用。在集約化養(yǎng)殖的需求下，長(zhǎng)效、多重活性作用的蛋白具有重要的研究?jī)r(jià)值，將成為生物制品領(lǐng)域的重點(diǎn)研究目標(biāo)之一。