苯并(a)芘誘導惡性轉(zhuǎn)化的BEAS-2B細胞中miRNA和mRNA表達譜的改變

栗振凱，李中秋，孟麗雅，張佳彤，張 巧

1)鄭州大學公共衛(wèi)生學院衛(wèi)生毒理學教研室 鄭州 450001 2)鄭州大學醫(yī)院疾病預防控制科 鄭州 450001

肺癌發(fā)病隱匿，易轉(zhuǎn)移，預后差[1-2]，是最危險的惡性腫瘤之一，其發(fā)病率和死亡率居全球之首，每年約有120萬人死于肺癌，5 a生存率仍然很低[3]。苯并(a)芘[benzo(a)pyrene，B(a)P]是一種多環(huán)芳香烴類化合物，其代謝活化產(chǎn)物是毒性最大的強致癌物，是一種持久性的有機污染物，普遍存在于汽車尾氣、煤、石油等產(chǎn)生的煙和化工產(chǎn)品中，目前已有大量實驗[4-5]證明B(a)P與肺癌關系密切，但是其致癌機制尚不明確。miRNA是一類長度約為22nt的非編碼RNA，它通過與mRNA結(jié)合發(fā)揮分子功能，包括促進mRNA的降解或增強其翻譯過程、轉(zhuǎn)錄后調(diào)控編碼基因[6-7]等。研究[8-9]表明，miRNA具有很多生物學功能，并且與腫瘤的發(fā)生發(fā)展有密切的關系。本研究構(gòu)建染毒B(a)P的永生化人支氣管上皮細胞(BEAS-2B細胞)模型，通過芯片技術檢測染毒和未染毒細胞的miRNA和mRNA表達譜，篩選出差異表達miRNA和mRNA，從而為進一步研究miRNA與肺癌之間的關系提供實驗依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 細胞株、主要試劑和儀器BEAS-2B細胞由本課題組留存。B(a)P購自美國Sigma公司，用DMSO溶解制成2.5 g/L的母液待用。RPMI 1640培養(yǎng)基、DMSO和胰蛋白酶均購自北京索萊寶科技有限公司；胎牛血清購自美國Gemini公司；Trizol試劑購自美國Invitrogen公司；4×gDNA wiper Mix、RNA模板，5×HiscriptRⅡRT SuperMix Ⅱ，AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix(Low ROX Premixed)購自南京諾唯贊生物有限公司。mRNA分離試劑盒購自美國Epicentre公司；SureHyb購自美國Agilent公司；miRCRYTMArray Labeling試劑盒、CIP緩沖劑、CIP酶、免疫熒光雙標和酶標記物購自美國Exiqon公司；RNA Flash Labeling 試劑盒購自美國Arraystar公司；7500 Fast實時熒光定量PCR系統(tǒng)購自美國 Applied Biosystems 公司。

1.2 惡性轉(zhuǎn)化BEAS-2B細胞模型的構(gòu)建及鑒定取10 μL的B(a)P母液與5 mL培養(yǎng)基混勻，使B(a)P濃度為5 mg/L[10]。BEAS-2B細胞用含B(a)P培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h后，棄去含B(a)P培養(yǎng)基，胰蛋白酶消化、常規(guī)傳代；當細胞再次融合至約70%時，再次加入含B(a)P培養(yǎng)基培養(yǎng) 24 h、傳代。反復染毒3次的細胞確定為第一代染毒細胞。未染毒細胞用同體積DMSO培養(yǎng)，方法同前。取傳至30代后的細胞檢測克隆形成能力、遷移能力和增殖活性。

①克隆形成能力：采用平板克隆形成實驗。細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，200個/孔接種于6孔板，加入3 mL RPMI 1640培養(yǎng)基培養(yǎng)，5 d換液一次，培養(yǎng)2周。終止培養(yǎng)后棄上清，PBS清洗，甲醇固定20 min，吉薩姆染色10 min，干燥。鏡下計數(shù)多于 50 個細胞的克隆數(shù)，計算克隆形成率?？寺⌒纬陕?(克隆數(shù)/接種細胞數(shù))×100%。

②遷移能力：采用劃痕實驗。用記號筆在6孔板背面畫5條間隔相等的橫線。細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，1×106個/孔接種于6孔板，常規(guī)培養(yǎng)24 h后，使用槍頭垂直于橫線劃痕，PBS清洗，加入無血清培養(yǎng)基培養(yǎng)。于培養(yǎng)6、12、24、48 h后鏡下觀察并拍照，使用Image-Pro Plus 6.0 軟件分析劃痕間距，記錄遷移距離。

③增殖活性：采用MTT實驗。細胞經(jīng)胰蛋白酶消化后，5 000個/孔接種于96孔板，培養(yǎng)12、24、36和48 h后，避光加入5 g/L MTT溶液20 μL，培養(yǎng)箱中孵育4 h,棄上清，加入150 μL DMSO,搖床振蕩10 min,置于酶標儀中檢測490 nm處吸光度值。

1.3 差異表達miRNA的篩選用Trizol法提取染毒和未染毒細胞中的總RNA，用miRCRYTMArray Labeling試劑盒標記miRNA：將1 μg總RNA 樣品和1 μL CIP緩沖劑和CIP酶加入到 2 μL水中，混合均勻后，37 ℃放置30 min，95 ℃放置5 min。再加入3 μL標記緩沖液、1.5 μL免疫熒光雙標和2.0 μL的酶標記物，混合均勻后16 ℃孵育1 h，65 ℃孵育15 min。取25 μL樣品和25 μL雜交緩沖液混勻并于95 ℃變性2 min，冰上靜置2 min。將樣品置于芯片上，56 ℃反應16～20 h。用清洗液洗滌芯片，用生物芯片掃描儀掃描，對芯片進行標準化分析。以變化倍數(shù)(FC)≥2.0且P<0.05 為差異表達miRNA。

1.4 差異表達mRNA的篩選用Trizol法分別提取染毒和未染毒細胞中的總RNA。采用mRNA分離試劑盒去除tRNA，用RNA Flash Labeling試劑盒標記mRNA，使用SureHyb進行雜交。芯片洗滌固定后，再進行掃描雜交。使用GeneSpring軟件對芯片進行標準化處理，以FC≥2.0且P<0.05 為差異表達mRNA。對差異表達mRNA進行GO和KEGG分析。

1.5 細胞中hsa-miR-2115-3p和hsa-miR-4521表達的檢測染毒和未染毒細胞融合至90%時，分別提取總RNA，加入2 μL的4×gDNA wiper Mix，2 μL的RNA模板混勻，42 ℃孵育2 min。加5×HiscriptRⅡRT SuperMix Ⅱ混勻；25 ℃孵育10 min，50 ℃孵育30 min，85 ℃孵育5 min；反轉(zhuǎn)錄成cDNA。取2 μL cDNA加入10 μL的AceQ?qPCR SYBR?Green Master Mix(Low ROX Premixed)、10 μmol/L上下游引物各0.4 μL和7.2 μL無酶水。擴增過程：95 ℃5 min預變性；95 ℃10 s,60 ℃30 s,40個循環(huán)；融解95 ℃15 s,60 ℃60 s,95 ℃15 s。用2-ΔΔCt法計算目的基因相對表達量。重復3次。引物由南京諾唯贊基因組研究中心有限公司合成，序列見表1。

表1 實驗用引物序列

1.6 統(tǒng)計學處理采用SPSS 21.0對數(shù)據(jù)進行分析，染毒和未染毒細胞各指標的比較采用兩獨立樣本t檢驗，檢驗水準α=0.05。

2 結(jié)果

2.1 惡性轉(zhuǎn)化BEAS-2B細胞模型的鑒定染毒、未染毒組平板克隆形成實驗結(jié)果見圖1，克隆形成率分別為(23.444±0.727)%、(0.889±0.601)%，染毒組大于未染毒組(t=41.420,P<0.001)。染毒組細胞增殖活性、遷移能力均強于未染毒組(圖2、3)，提示染毒組細胞發(fā)生惡性轉(zhuǎn)化。

圖1 未染毒(A)和染毒(B)組細胞克隆形成情況

圖2 未染毒和染毒組細胞增殖活性比較(*：P<0.05)

圖3 未染毒和染毒組細胞遷移距離比較(*：P<0.05)

2.2 差異表達mRNA與miRNA的篩選芯片表達譜見圖4。聚類分析結(jié)果顯示，染毒組和未染毒組細胞在不同的簇中，說明B(a)P染毒改變了細胞功能。共篩選出127種差異表達miRNA，其中29種表達上調(diào)，98種表達下調(diào)，前20位表達差異的miRNA見表2。共篩選出159種差異表達mRNA,其中99種表達上調(diào)，60種表達下調(diào)，前20位表達差異的mRNA見表3。

圖4 染毒和未染毒組細胞miRNA(左)和mRNA(右)的芯片表達譜

表2 前20位差異表達miRNA

表3 前20位差異表達mRNA

2.3 差異表達mRNA的GO和KEGG分析結(jié)果GO分析結(jié)果顯示，表達上調(diào)的差異表達mRNA主要涉及的生物學過程有組織器官生長發(fā)育、維持細胞金屬離子穩(wěn)態(tài)和免疫應答等，涉及的細胞組分主要有反式高爾基體管網(wǎng)狀膜結(jié)構(gòu)對蛋白質(zhì)進行分選和轉(zhuǎn)運、MHC蛋白復合體、MHC 基因家族Ⅰ蛋白等，涉及的分子功能主要有抗原結(jié)合、細胞因子受體結(jié)合、受體活化等。表達下調(diào)的差異表達mRNA主要涉及的生物學過程有P38MAPK 級聯(lián)反應、正向調(diào)控細胞凋亡、負調(diào)控轉(zhuǎn)錄等，涉及的細胞組分主要有胞內(nèi)膜結(jié)合細胞器構(gòu)成細胞獨立的結(jié)構(gòu)及功能、轉(zhuǎn)錄抑制復合物、通過膜結(jié)構(gòu)相互協(xié)作等，涉及的分子功能主要有跨膜受體蛋白酶活性、雙鏈DNA結(jié)合及轉(zhuǎn)錄因子等。

KEGG分析結(jié)果顯示，表達上調(diào)的差異表達mRNA可能參與了細胞活素-受體相互作用介導的信號通路和Jas-STAT介導的信號通路，并且參與Toll樣受體介導的信號通路，通過TLR9來活化NF-κB和轉(zhuǎn)錄激活因子AP-1，釋放TNF-α因子從而發(fā)揮免疫監(jiān)視功能；表達下調(diào)的mRNA可能參與了p53信號通路介導的細胞凋亡、周期阻滯和腫瘤血管抑制，TGF-β介導的抑制細胞分裂和Gadd45介導的DNA損傷修復等。

2.4 兩組細胞中hsa-miR-2115-3p 和hsa-miR-4521表達的比較針對miRNA芯片檢測結(jié)果，選取hsa-miR-2115-3p和hsa-miR-4521進行驗證。PCR檢測結(jié)果顯示，染毒組細胞hsa-miR-2115-3p和hsa-miR-4521表達水平均低于未染毒組。

表6 兩組細胞中兩種miRNA表達水平的比較

3 討論

B(a)P常常存在于汽車尾氣及化學制品中，是主要的大氣污染物之一，被國際癌癥研究機構(gòu)IARC評為一級致癌物[11-12]。細胞模型是研究癌癥的重要手段。本研究用B(a)P對BEAS-2B染毒后，細胞克隆形成能力、遷移能力和增殖活性均明顯增強，提示成功構(gòu)建了B(a)P誘導的惡性轉(zhuǎn)化細胞模型。

miRNA是非編碼蛋白的小RNA，通過堿基互補抑制翻譯或降解靶mRNA,調(diào)節(jié)mRNA的穩(wěn)定性[13]。miRNA通過影響不同的mRNA參與細胞癌變的生物學過程[14]。研究[15]發(fā)現(xiàn)抑制miR-223-3p表達可以抑制JAK2、STAT3蛋白的表達，從而抑制胃癌細胞周期進展。Giordano等[16]以50歲為界限將88名肺腺癌患者分為兩組，發(fā)現(xiàn)7種差異表達miRNA。本研究發(fā)現(xiàn)，B(a)P染毒和未染毒的BEAS-2B有159種差異表達mRNA,其中99種表達上調(diào)，60種表達下調(diào)；有127種差異表達miRNA，其中29種表達上調(diào)，98種表達下調(diào)。對差異表達mRNA的GO分析結(jié)果顯示：表達上調(diào)的mRNA分子功能主要富集于受體活化、抗原結(jié)合和細胞因子受體結(jié)合等；細胞組分主要富集于蛋白質(zhì)分類轉(zhuǎn)運、MHC蛋白復合體與抗原呈遞過程等；生物學過程主要富集于促進器官生長、免疫應答和維持金屬離子在細胞內(nèi)的穩(wěn)態(tài)等。表達下調(diào)的mRNA分子功能主要富集于影響跨膜受體蛋白酶活性、轉(zhuǎn)錄因子和雙鏈DNA結(jié)合等；細胞組分主要富集于胞內(nèi)膜結(jié)合細胞器構(gòu)成細胞獨立的結(jié)構(gòu)及功能；生物學過程主要富集于調(diào)控P38MAPK級聯(lián)反應、調(diào)控逆轉(zhuǎn)錄和細胞凋亡。KEGG分析結(jié)果顯示：表達上調(diào)的mRNA可能參與了細胞活素-受體相互作用介導的信號通路等；表達下調(diào)的mRNA可能參與了p53信號通路介導的細胞凋亡、周期阻滯和腫瘤血管抑制等。本研究對染毒和未染毒細胞中hsa-miR-2115-3p和hsa-miR-4521的表達水平進行檢測，結(jié)果染毒組均低于未染毒組，與芯片分析結(jié)果一致。

基因組不穩(wěn)定性和突變是正常細胞轉(zhuǎn)變?yōu)榘┘毎幕A[17]。有研究[18]發(fā)現(xiàn)上調(diào)反式-7,8-二羥-9,10-環(huán)氧苯并芘誘導的惡性轉(zhuǎn)化的人支氣管上皮細胞中miR-542-3p表達水平，可降低細胞的增殖能力和惡性程度。生物信息學分析發(fā)現(xiàn)差異表達mRNA參與了脂肪積聚肝細胞的惡性轉(zhuǎn)化過程[19]。本研究發(fā)現(xiàn)B(a)P誘導惡性轉(zhuǎn)化的BEAS-2B中miRNA及mRNA表達譜發(fā)生顯著改變,差異表達miRNA及mRNA可能參與了細胞的惡變過程；發(fā)現(xiàn)的與惡性轉(zhuǎn)化相關的mRNA和miRNA將有助于發(fā)現(xiàn)新型分子標志或靶點，為B(a)P誘導肺癌的診斷和治療提供實驗基礎。