張氏消腫定痛膏透皮吸收物質(zhì)基礎(chǔ)研究

徐長瓊 ，李然 ，任秋蕓 ，梅君 ，黎珊 ，黃會保，夏麗瓊

（1.岳陽市婦幼保健院科研所，湖南岳陽 414000；2.汕頭大學(xué)醫(yī)學(xué)院，廣東汕頭 515000；3.岳陽市中醫(yī)醫(yī)院藥劑科，湖南岳陽 414000）

“岳陽張氏正骨術(shù)”由張瑞林創(chuàng)立，歷經(jīng)百余年理論發(fā)展及實(shí)踐驗(yàn)證，成為湖湘中醫(yī)正骨的主流學(xué)派，2012 年被國家中醫(yī)藥管理局確定為第一批全國十三大骨傷學(xué)術(shù)流派傳承工作室建設(shè)項目，2017 年獲評“湖南省非物質(zhì)文化遺產(chǎn)代表性項目”[1-4]。

“岳陽張氏正骨術(shù)”提倡內(nèi)外相合用藥，百余年來積累了多種有效秘方，自擬自制過張氏消腫定痛膏、接骨止痛膠囊等10 余種院內(nèi)制劑，用于治療急慢性軟組織損傷，臨床療效顯著，安全性良好。然而，張氏消腫定痛膏治療骨傷科疾病的物質(zhì)基礎(chǔ)研究及其外用透皮吸收物質(zhì)基礎(chǔ)研究均未見文獻(xiàn)報道，本項目擬使用大鼠離體皮膚，制備張氏消腫定痛膏透皮滲透液，通過UPLC-MS/MS和自建數(shù)據(jù)庫等廣泛靶向代謝組學(xué)研究平臺，研究張氏消腫定痛膏透皮吸收物質(zhì)基礎(chǔ)，了解藥物透皮吸收成分及相對含量，明確張氏消腫定痛膏發(fā)揮藥效作用的物質(zhì)基礎(chǔ)。

1 儀器與試劑

超高效液相色譜（Shim-pack UFLC SHIMADZU CBM30A）；串聯(lián)質(zhì)譜（Applied Biosystems 6500 QTRAP）；BSA224S-CW 型電子分析天平[（賽多利斯科學(xué)儀器（北京）有限公司]；ⅩMTD-7000 磁力攪拌器（天津賽得利斯實(shí)驗(yàn)分析儀器制造廠）；甲醇、乙腈、乙醇為Merck 色譜純試劑；標(biāo)準(zhǔn)品（BioBio-Pha/Sigma-Aldrich）；張氏消腫定痛膏由岳陽市中醫(yī)院骨傷科提供。

2 方法

2.1 供試品的制備

張氏消腫定痛膏原藥提取物的制備：取各張氏消腫定痛膏原藥0.5 g，置15 mL 離心管中，加甲醇10 mL，超聲提取1 h，加甲醇至刻度，搖勻，經(jīng)0.22 μm微孔濾膜濾過，即得。

張氏消腫定痛膏透皮成分的制備：健康SD 大鼠處死后剃毛，剝離大鼠背部皮膚，剔除皮下脂肪以及粘連物，剪成適當(dāng)大小，-20 ℃保存；用時解凍，生理鹽水浸潤，自制滲透池，角質(zhì)層面敷貼張氏消腫定痛膏，真皮層面向接受室，接受池中加10 mL預(yù)熱生理鹽水，37 ℃恒溫攪拌，每隔2 h從接受池吸取滲透液后再補(bǔ)加預(yù)熱生理鹽水，重復(fù)以上步驟至12 h，即得透皮滲透液（制備過程見圖1）。待測液高速離心后取上清液，0.22 μm 微孔濾膜濾過，UPLCMS/MS測定主要成分含量?？瞻捉M不加藥，用以排除大鼠皮膚及裝置物質(zhì)干擾。

圖1 張氏消腫定痛膏透皮滲透液的制備Figure 1 Preparation of osmotic solution of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment

2.2 測定條件

液相條件：色譜柱為Agilent SBC18柱（1.8 μm，2.1 mm×100 mm）；以超純水（加入0.1%的甲酸）為流動相A相，乙腈為B相，洗脫梯度（0.00 min，5%B；9.00 min 內(nèi)，95%B，維持1 min；10.00～11.10 min，5%B；并以5%平衡至14 min）；流速為0.35 mL/min；柱溫為40 ℃；進(jìn)樣量為2 μL。

質(zhì)譜條件：電噴霧離子源（electrospray ionization，ESI）溫度550 ℃，質(zhì)譜電壓5 500 V，簾氣（curtain gas,CUR）206.85 kPa，碰撞誘導(dǎo)電離（collision-activated dissociation,CAD）參數(shù)設(shè)置為高。在三重四級桿（QQQ）中，每個離子對是根據(jù)優(yōu)化的去簇電壓（declustering potential,DP）和碰撞能（collision energy,CE）進(jìn)行掃描檢測。

2.3 定性定量分析方法

2.3.1 定性分析 基于自建數(shù)據(jù)庫MWDB（metware database），根據(jù)二級譜信息進(jìn)行定性，分析時去除同位素信號，含K+離子、Na+離子、NH4+離子的重復(fù)信號，以及本身是其他更大分子量物質(zhì)的碎片離子的重復(fù)信號。

2.3.2 定量分析 利用三重四級桿質(zhì)譜的多反應(yīng)監(jiān)測模式（multiple reaction monitoring，MRM）分析完成。MRM 模式中，四級桿首先篩選目標(biāo)物質(zhì)的前體離子（母離子），排除其他分子量物質(zhì)對應(yīng)的離子以初步排除干擾；前體離子經(jīng)碰撞室誘導(dǎo)電離后斷裂形成很多碎片離子，碎片離子再通過三重四級桿過濾選擇出所需要的一個特征碎片離子，排除非目標(biāo)離子干擾。獲得不同樣本的質(zhì)譜分析數(shù)據(jù)后，用MultiaQuant軟件打開樣本下機(jī)質(zhì)譜文件，進(jìn)行色譜峰的積分和校正工作，每個色譜峰的峰面積（Area）代表對應(yīng)物質(zhì)的相對含量，并對其中同一化合物在不同樣本中的質(zhì)譜出峰進(jìn)行積分校正。

2.4 樣本質(zhì)控分析

質(zhì)控樣本（QC）由樣本提取物混合制備而成，用于分析樣本在相同的處理方法下的重復(fù)性。在儀器分析的過程中，每10 個檢測分析樣本中插入1 個質(zhì)控樣本，以監(jiān)測分析過程的重復(fù)性。

2.5 數(shù)據(jù)處理

分類比較透皮吸收物質(zhì)總數(shù)量；將所有檢測到的化合物總峰面積相加為100%，然后將每個成分單獨(dú)色譜峰峰面積/總峰面積，得該峰所對應(yīng)化合物相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)（%），根據(jù)相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)值比較每一類化合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)和該類化合物分布；每類物質(zhì)列出相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)大于0.01%或最高的20種化合物。

3 結(jié)果

3.1 數(shù)據(jù)結(jié)果評估

利用軟件Analyst 1.6.3 處理質(zhì)譜數(shù)據(jù)。圖2 為樣品、混樣質(zhì)控QC 樣本的總離子流圖（Total ions current，TIC）及MRM 代謝物檢測多峰圖（多物質(zhì)提取的離子流譜圖，ⅩIC）。通過對不同質(zhì)控QC 樣本質(zhì)譜檢測分析的總離子流圖進(jìn)行重疊展示分析，可見代謝物提取和檢測重復(fù)性、儀器穩(wěn)定性良好，數(shù)據(jù)可靠。

圖2 張氏消腫定痛膏UPLC-MS/MS離子流圖Figure 2 UPLC-MS/MS ion flow map of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment

3.2 張氏消腫定痛膏及其滲透液中的化學(xué)成分

張氏消腫定痛膏中總共檢測到542 種化合物（圖3，ZSZG），其中黃酮類化合物122 種，酚酸77種，氨基酸及其衍生物42 種，萜類40 種，木脂素和香豆素40 種，有機(jī)酸34 種，生物堿33 種，核苷酸及衍生物26 種，脂質(zhì)25 種，醌類12 種，鞣酸9 種，維生素8種，糖及醇類5種，其他69種。

張氏消腫定痛膏滲透液中總共檢測到422種化合物（圖3，ZSZG-D），其中酚酸71種，黃酮類化合物75 種，萜類37 種，木脂素和香豆素38 種，有機(jī)酸31種，生物堿27 種，氨基酸及其衍生物28 種，醌類10種，核苷酸及衍生物16 種，脂質(zhì)12 種，鞣酸6 種，其他71種。

圖3 張氏消腫定痛膏（ZSZG）及透皮滲透液（ZSZG-D）中化合物分類及數(shù)量Figure 3 Classification and quantity of compounds in Zhang's antiswelling (ZSZG) and relieving pain ointment and dialysate(ZSZG-D)

3.3 張氏消腫定痛膏滲透液中化合物的相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)

將同類物質(zhì)相對百分比相加，計算該類化合物總質(zhì)量分?jǐn)?shù)（圖4），其中生物堿占（6.33±2.10）%，酚酸占（37.83±9.23）%，有機(jī)酸占（7.91±2.22）%，黃酮占（5.61±0.60）%，萜類占（3.20±0.92）%，木脂素和香豆素占（3.31±1.03）%，氨基酸及衍生物占（9.99±1.20）%，醌類占（2.05±0.91）%，核苷酸及衍生物占（7.78±1.29）%，脂質(zhì)占（3.48±0.10）%，鞣酸占（0.13±0.09）%，其他化合物占（12.39±2.91）%。

圖4 張氏消腫定痛膏滲透液中化合物分類及總相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)Figure 4 Classification and total relative content of compounds in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment

將同類物質(zhì)相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行統(tǒng)計（圖5），其中酚酸平均質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高，但各成分的質(zhì)量分?jǐn)?shù)差異較大，最高的化合物為綠原酸*（*代表同分異構(gòu)體，下同）。

圖5 張氏消腫定痛膏滲透液中化合物分類及質(zhì)量分?jǐn)?shù)分布Figure 5 Classification and content distribution of compounds in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment

3.4 張氏消腫定痛膏的主要透皮成分

將每類物質(zhì)相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)進(jìn)行排序，選取相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)較高的20 種或大于0.01%的化合物列表。可見氨基酸及其衍生物、酚酸、黃酮、木脂素和香豆素、生物堿、萜類、有機(jī)酸、核苷酸及其衍生物、脂質(zhì)、醌類和鞣質(zhì)中，質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的化合物依次為L-精氨酸（表1）、綠原酸*（表2）、6-羥基山柰酚-3，6-O-二葡萄糖苷-7-O-葡萄糖醛酸（表3）、5-甲氧基-8-羥基補(bǔ)骨脂素（表4）、去甲麻黃堿（表5）、獐牙菜苷（表6）、氨基丙二酸（表7）、N6-琥珀酰腺苷（表8）、十六烷基鞘胺醇（表9）、大黃酸-8-O-（6′-O-乙?；?葡萄糖（表10）和沒食子酸（表11），其他化合物中羥基紅花黃色素A質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高（表12）。

表1 張氏消腫定痛膏滲透液中主要氨基酸及其衍生物（前20種）Table 1 Main amino acids and derivatives in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表1 張氏消腫定痛膏滲透液中主要氨基酸及其衍生物（前20種）Table 1 Main amino acids and derivatives in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表2 張氏消腫定痛膏滲透液中主要酚酸類物質(zhì)（前20種）Table 2 Main phenolic acids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表2 張氏消腫定痛膏滲透液中主要酚酸類物質(zhì)（前20種）Table 2 Main phenolic acids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表3 張氏消腫定痛膏滲透液主要黃酮類物質(zhì)（前20種）Table 3 Main flavonoids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表3 張氏消腫定痛膏滲透液主要黃酮類物質(zhì)（前20種）Table 3 Main flavonoids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表4 張氏消腫定痛膏滲透液中主要木脂素和香豆素（前20種）Table 4 Main lignans and coumarins in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表4 張氏消腫定痛膏滲透液中主要木脂素和香豆素（前20種）Table 4 Main lignans and coumarins in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表5 張氏消腫定痛膏滲透液中主要生物堿（前20種）Table 5 The main alkaloid in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表5 張氏消腫定痛膏滲透液中主要生物堿（前20種）Table 5 The main alkaloid in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表6 張氏消腫定痛膏滲透液中主要萜類化合物（前20種）Table 6 Main terpenoids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表6 張氏消腫定痛膏滲透液中主要萜類化合物（前20種）Table 6 Main terpenoids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表7 張氏消腫定痛膏滲透液中主要有機(jī)酸（前20種）Table 7 Main organic acids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表7 張氏消腫定痛膏滲透液中主要有機(jī)酸（前20種）Table 7 Main organic acids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表8 張氏消腫定痛膏滲透液中主要核苷酸及衍生物（＞0.01%）Table 8 Main nucleotides and derivatives in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表8 張氏消腫定痛膏滲透液中主要核苷酸及衍生物（＞0.01%）Table 8 Main nucleotides and derivatives in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表9 張氏消腫定痛膏滲透液中主要脂質(zhì)（＞0.01%）Table 9 Main lipids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表9 張氏消腫定痛膏滲透液中主要脂質(zhì)（＞0.01%）Table 9 Main lipids in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表10 張氏消腫定痛膏滲透液中主要醌類物質(zhì)（＞0.01%）Table 10 Main quinones in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表10 張氏消腫定痛膏滲透液中主要醌類物質(zhì)（＞0.01%）Table 10 Main quinones in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表11 張氏消腫定痛膏滲透液中主要鞣質(zhì)（＞0.01%）Table 11 Main tannins in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表11 張氏消腫定痛膏滲透液中主要鞣質(zhì)（＞0.01%）Table 11 Main tannins in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(＞0.01%)(,n=3)

表12 張氏消腫定痛膏滲透液中其他主要物質(zhì)（前20種）Table 12 Main other substances in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

表12 張氏消腫定痛膏滲透液中其他主要物質(zhì)（前20種）Table 12 Main other substances in dialysate of Zhang's antiswelling and relieving pain ointment(the first 20 kinds)(,n=3)

4 討論

張氏消腫定痛膏是張氏正骨學(xué)術(shù)流派傳承人在中醫(yī)理論及張氏正骨學(xué)術(shù)思想指導(dǎo)下研制而成，由骨碎補(bǔ)、當(dāng)歸、紅花、川芎、續(xù)斷、龍血竭、王不留行、梔子、大黃等25味中藥制成，在岳陽市中醫(yī)醫(yī)院及張氏正骨學(xué)術(shù)流派工作室臨床工作中，歷經(jīng)20余年數(shù)萬例的臨床驗(yàn)證，具有行氣、活血化瘀、消腫止痛的功效，對損傷軟組織無菌性炎癥的改變、局部急性炎癥的修復(fù)具有重要促進(jìn)作用[1-4]。

本研究結(jié)果顯示，張氏消腫定痛膏中總共檢測到542種化合物，其中黃酮類化合物和酚酸最多，分別為122 種和77 種。張氏消腫定痛膏滲透液中檢測到422 種化合物，其中最多的是酚酸71 種，黃酮類化合物75 種，萜類37 種；相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高的依次為酚酸[（37.83±9.23）%]、氨基酸及衍生物[（9.99±1.20）%]、有機(jī)酸[（7.91±2.22）%]?？梢姺铀犷愇镔|(zhì)透皮吸收良好，酚酸具有重要的抗炎[5]和治療神經(jīng)肌肉相關(guān)疾病[6]作用，與張氏消腫定痛膏適應(yīng)證較一致。

張氏消腫定痛膏滲透液中化合物相對質(zhì)量分?jǐn)?shù)超過1.00%的分別為綠原酸*、十六烷基鞘胺醇、L-精氨酸、N6-琥珀酰腺苷、脯氨酸甜菜堿、羥基紅花黃色素A*、N-乙酰-L-谷氨酸、黃嘌呤、大黃酸-8-O-（6′-O-乙?；?葡萄糖、哌啶酸、D-（+）-蔗糖、鄰苯二甲酸二丁酯*、新綠原酸*、3，4-二羥基苯甲醛、6-羥基山柰酚-3，6-O-二葡萄糖苷-7-O-葡萄糖醛酸、氨基丙二酸、4-胍基丁酸、異戊烯基腺苷-7-葡糖苷、2-羥基-3-丁烯基硫苷和去甲麻黃堿，其中綠原酸的質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，它具有抗炎[7-8]、抗氧化[9]等活性作用。透皮吸收化合物主要來源于續(xù)斷[10-11]、紅花[12-13]、大黃[14-15]、川芎[16-17]、枳實(shí)[18]和骨碎補(bǔ)[19]等中藥材，與張氏消腫定痛膏處方較一致。

本文結(jié)果表明，基于UPLC-MS/MS和自建數(shù)據(jù)庫等廣泛靶向代謝組研究平臺對于復(fù)雜的中藥復(fù)方物質(zhì)基礎(chǔ)研究具有簡便、高效的特點(diǎn)，但因儀器分辨率限制，定性分析準(zhǔn)確性存在一定爭議；另外，由于不同化合物在質(zhì)譜中響應(yīng)存在差異，導(dǎo)致使用峰面積進(jìn)行相對定量分析具有一定誤差。但本研究對張氏消腫定痛膏透皮吸收化合物具有初步篩選的作用，對后續(xù)提高制劑療效和質(zhì)量控制具有一定的指導(dǎo)意義。