生活飲用水中菌落總數(shù)新方法應(yīng)用探究

◎ 謝 俊，白 雪，高 然，趙永旺

（蒙牛乳業(yè)（寶雞）有限公司，陜西 寶雞 721013）

水中菌落總數(shù)是指水樣在營養(yǎng)瓊脂上，有氧條件下經(jīng)過37 ℃培養(yǎng)48 h后，每毫升（每克）水樣所含細(xì)菌菌落的總數(shù)。與生活飲用水有關(guān)的衛(wèi)生問題大多來自于微生物污染，菌落總數(shù)作為生活引用水微生物檢測的首選項(xiàng)目，在一定程度上標(biāo)志著飲用水衛(wèi)生質(zhì)量優(yōu)劣。目前國內(nèi)常用檢測方法是《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》（GB/T 5750.12—2006）平板傾注法。

2008年菌落總數(shù)測試片法在食品領(lǐng)域廣泛應(yīng)用。本次選擇3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片法進(jìn)行試驗(yàn)，其原理為采用可再生的水合物材質(zhì)，由上下兩層薄膜組成。上層聚丙烯薄膜含有黏合劑、指示劑及冷水可溶性凝膠；下層聚乙烯薄膜含有細(xì)菌生長所需的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基。細(xì)菌在測試片上生長時，細(xì)胞代謝產(chǎn)物與上層的指示劑TTC發(fā)生氧化還原反應(yīng)，將指示劑還原成紅色非溶解性產(chǎn)物三苯甲臜，從而使細(xì)菌著色。故測試片上紅色菌落判斷為菌落總數(shù)。

3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片法檢測生活飲用水中菌落總數(shù)含量，對比國標(biāo)法檢測更便捷，且易于菌落辨別計(jì)數(shù)；為檢測生活飲用水菌落總數(shù)找出一種便捷檢測、且不影響結(jié)果準(zhǔn)確性的新型方法，也為標(biāo)準(zhǔn)修訂提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試劑與儀器

1.1.1 試劑

3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片（貨號70200572157，有效期至20220104）；營養(yǎng)瓊脂（批次20190902，有效期3年，密封保存于陰涼干燥處）；3份質(zhì)控樣品（批次為QC-FD-034的生活飲用水中菌落總數(shù)定量分析質(zhì)控樣，由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院提供）；2份實(shí)驗(yàn)室間比對樣（批次為20-C448和20-H712，由中國檢驗(yàn)檢疫科學(xué)研究院提供）。

1.1.2 儀器設(shè)備

電子天平（百分之一）、電熱恒溫培養(yǎng)箱、滅菌器、超凈工作臺、恒溫水浴箱。

1.2 樣液準(zhǔn)備

1.2.1 質(zhì)控樣品

于無菌環(huán)境下開啟凍干樣品西林瓶蓋，立即（1 min內(nèi)）從220 mL無菌水中吸取20 mL加入西林瓶中將樣品復(fù)溶，待樣品粉末溶解后，將溶液吸出轉(zhuǎn)移至無菌瓶中，再用余下的無菌水反復(fù)清洗西林瓶內(nèi)壁，回收清洗液于上述無菌瓶中，220 mL溶液即為待測水樣樣品原液。

1.2.2 生活飲用水樣品樣液制備

依據(jù)《生活飲用水標(biāo)準(zhǔn)檢驗(yàn)方法 微生物指標(biāo)》（GB/T 5750.12—2006）進(jìn)行處理。對1.2.1制備后的質(zhì)控樣品和生活飲用水樣液以無菌操作方法吸取1 mL充分混勻的水樣，注入盛有9 mL滅菌生理鹽水的試管中，混勻成1∶10的稀釋液。吸取l∶10的稀釋液l mL注入盛有9 mL滅菌生理鹽水的試管中，混勻成l∶100稀釋液，并依次稀釋成l∶l 000、l∶10 000稀釋液等備用。每遞增稀釋一次，更換一支l mL滅菌吸管。

1.3 檢測方法

1.3.1 營養(yǎng)瓊脂平板傾注法

依據(jù)樣品量及樣本污染情況[1]，在無菌條件下用滅菌吸管取1 mL充分混勻的水樣稀釋液，置于2個無菌平皿內(nèi)，同時吸取1 mL無菌生理鹽水，做空白對照。傾注15～20 mL已融化并冷卻至45 ℃左右的營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基，并立即旋搖平皿，使水樣與培養(yǎng)基充分混勻。待冷卻凝固后翻轉(zhuǎn)平皿，置于（36±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)48 h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.3.2 3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片法

依據(jù)樣品量及樣本污染情況，在無菌條件下用滅菌吸管取1 mL充分混勻的水樣稀釋液[2]，注入3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片中心位置，蓋下膜后用壓板壓平，每次檢驗(yàn)時進(jìn)行平行接種，同時做空白對照。壓板后至少等待1 min，置于（36±1）℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（48±2）h，進(jìn)行菌落計(jì)數(shù)。

1.4 統(tǒng)計(jì)方法

使用Mintable軟件進(jìn)行配對T檢驗(yàn)分析，P＜0.05具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

1.5 計(jì)算方法

質(zhì)控樣品測試結(jié)果依據(jù)證書特性值區(qū)間進(jìn)行評價(jià)；實(shí)驗(yàn)室間比對質(zhì)控樣品測試結(jié)果采用“穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)四分位距計(jì)算Z值”進(jìn)行評價(jià)。當(dāng)|Z|≤2，測試結(jié)果滿意；當(dāng)2＜|Z|＜3，測試結(jié)果有問題（可疑）；當(dāng)|Z|≥3，測試結(jié)果不滿意（離群）。

2 結(jié)果與分析

2.1 平板傾注法及3M PetrifilmTM測試片法檢測結(jié)果及分析

選擇15組自制水樣、3組質(zhì)控樣、2組實(shí)驗(yàn)室間比對樣分別使用營養(yǎng)瓊脂平板傾注法和3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片法進(jìn)行檢測，其檢測結(jié)果使用精密度和T檢驗(yàn)進(jìn)行分析。由表1可知，兩種方法檢測結(jié)果的對數(shù)差絕對值均＜0.45，表明營養(yǎng)瓊脂平板傾注法和3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片法檢測生活飲用水中菌落總數(shù)的差異符合要求。

表1 平板傾注法和3M PetrifilmTM測試片法數(shù)據(jù)對比分析表

由T檢驗(yàn)得，平均差的95%置信區(qū)間為（-0.069 2，0.122 0），t=0.58，P=0.570＞0.05，表明營養(yǎng)瓊脂平板傾注法和3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片法檢測生活飲用水中菌落總數(shù)結(jié)果無顯著性差異，見表2。

表2 平板傾注法和3M Petrifilm TM測試片法T檢驗(yàn)分析表

2.2 質(zhì)控樣品3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片法檢測結(jié)果及分析

由表3可知，質(zhì)控樣品使用3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片法檢測結(jié)果分別為4 000 CFU·mL-1，93CFU·mL-1、88 CFU·mL-1。對照質(zhì)控樣證書，檢測結(jié)果均在證書特性值區(qū)間范圍內(nèi)，表明3M PetrifilmTM測試片法適用于生活飲用水中的菌落總數(shù)測定，檢測結(jié)果精準(zhǔn)。

表3 質(zhì)控樣品3MPetrifilmTM測試片法菌落總數(shù)結(jié)果評價(jià)表

2.3 實(shí)驗(yàn)室間比對樣3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片法檢測結(jié)果及分析

由表4可知，實(shí)驗(yàn)室間比對樣使用3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片法檢測結(jié)果分別為1 800 CFU·mL-1、370 CFU·mL-1，使用穩(wěn)健統(tǒng)計(jì)四分位距法計(jì)算Z值分別為1.2、1.1，結(jié)果評價(jià)均為滿意。表明3M PetrifilmTM測試片法適用于生活飲用水中菌落總數(shù)測定，檢測結(jié)果精準(zhǔn)。

表4 實(shí)驗(yàn)室間比對樣3M PetrifilmTM測試片法菌落總數(shù)結(jié)果評價(jià)表

3 結(jié)論與討論

（1）試驗(yàn)結(jié)果表明，3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片法檢測生活飲用水中的菌落總數(shù)結(jié)果與營養(yǎng)瓊脂平板傾注法檢測結(jié)果無顯著性差異，從精密度、準(zhǔn)確度維度進(jìn)行評價(jià)，均表明3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片適用于生活飲用水中的菌落總數(shù)測定。

（2）營養(yǎng)瓊脂平板屬于普通培養(yǎng)基，不具有選擇性。出現(xiàn)特殊菌落、繁殖過快時易造成菌斑重疊覆蓋現(xiàn)象，影響結(jié)果計(jì)數(shù)。而3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片中含有指示劑TTC發(fā)生氧化還原反應(yīng)使細(xì)菌著色，呈現(xiàn)紅色斑點(diǎn)，便于計(jì)數(shù)。具體見圖1、圖2。

圖1 平板法菌落形態(tài)圖

圖2 測試片法菌落形態(tài)圖

（3）3M PetrifilmTM測試片法檢測過程中減少藥品稱量、配置、滅菌、平皿清洗等環(huán)節(jié)，培養(yǎng)過程占用面積小，節(jié)省空間。適合培養(yǎng)空間小和檢測樣品數(shù)量多的實(shí)驗(yàn)機(jī)構(gòu)。

綜上所述，3M PetrifilmTM菌落總數(shù)測試片適用于生活飲用水中的菌落總數(shù)測定，同時為水質(zhì)中菌落總數(shù)檢測提供了一種便捷易操作的檢測方法。