梁 艷 趙雪瑩 白 雪 劉德強(qiáng) 張 妍 潘 朋

(齊齊哈爾大學(xué)生命科學(xué)與農(nóng)林學(xué)院 齊齊哈爾 161006)

黑皮油松(Pinustabulaeformisvar.mukdensis)為油松的變種，抗逆性強(qiáng)，具有耐干旱和瘠薄土壤、耐寒、防風(fēng)、抑菌能力強(qiáng)等優(yōu)良特性，是我國北方兼具經(jīng)濟(jì)價(jià)值與生態(tài)價(jià)值的造林樹種(Wangetal.， 2019)。黑皮油松樹形俊美、枝虬若龍，尤其是冬態(tài)更能充分體現(xiàn)北方地域性的植物景觀特色，已被廣泛應(yīng)用于我國北方園林綠化中(陳新宇等， 2019)。由于黑皮油松生命周期較長，且存在種子結(jié)實(shí)率低、子代優(yōu)良性狀降低等問題(Huietal.， 2016)，導(dǎo)致嫁接與種子的傳統(tǒng)良種繁育方式難以滿足市場(chǎng)需求，而離體快繁技術(shù)能顯著加速樹種品質(zhì)改良并提高良種苗木的生產(chǎn)能力(高潔等， 2019； 宋躍朋等， 2019)。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，與其他木本植物類似(Bongaetal.， 2010)，以黑皮油松的休眠芽作為外植體進(jìn)行離體培養(yǎng)褐變較嚴(yán)重，類似的褐變問題在歐洲赤松(Pinussylvestris)等松屬(Pinus)植物的離體培養(yǎng)中也普遍存在(Andersoneetal.， 2005)，極大地影響了其離體培養(yǎng)的成功率，制約了其優(yōu)質(zhì)組培苗的快速繁殖與推廣應(yīng)用。因此如何有效抑制黑皮油松外植體褐變是組培生產(chǎn)中亟待解決的關(guān)鍵問題之一。

大量研究表明，培養(yǎng)基中添加聚乙烯吡咯烷酮(polyvinyl pyrrolidone，PVP)、維生素C(VC)、硝酸銀(AgNO3)和活性炭(active carbon，AC)等抗氧化劑以及酚類物質(zhì)的吸附劑可達(dá)到抑制外植體褐化的目的。在葡萄(Vitisvinifera)(饒慧云等， 2015)、天女木蘭(Magnoliasieboldii)(高紅兵等， 2017)、水曲柳(Fraxinusmandshurica)(彭春雪等， 2019)等材料的研究中發(fā)現(xiàn)，培養(yǎng)基中添加適宜濃度的PVP對(duì)抑制外植體褐化效果顯著。組培中褐變多由酶促褐變引起，酚類化合物是褐變發(fā)生的主要底物，酚類物質(zhì)再經(jīng)多種氧化酶催化后形成醌類物質(zhì)，醌類物質(zhì)通過聚合產(chǎn)生褐色物質(zhì)，酶、底物和氧氣是引起外植體褐變的3個(gè)基本條件。酚類物質(zhì)的含量與種類直接影響著褐化的程度，相關(guān)研究已發(fā)現(xiàn)與褐化有關(guān)的酚類物質(zhì)主要包括咖啡酸、阿魏酸、香豆酸、綠原酸、兒茶酚和對(duì)羥基苯甲酸等(Babbaretal.， 1986； Cosetengetal.， 2010)。相對(duì)于草本植物，酚類物質(zhì)含量較髙的木本植物的褐化問題尤為嚴(yán)重，成為制約其離體培養(yǎng)及快速繁殖成功與否的重要因素(Xuetal.， 2011； Wangetal.， 2014)。此外，多酚氧化酶(polyphenol oxidase，PPO)、過氧化物酶(peroxidase，POD)、苯丙氨酸解氨酶(phenylalanine ammonia-lyase，PAL)等也與褐化過程相關(guān)(Wangetal.， 2014)。

目前黑皮油松愈傷組織抗褐化研究已有相關(guān)報(bào)道(付雙彬等， 2017)，但對(duì)于其休眠芽外植體離體培養(yǎng)中的褐化現(xiàn)象及抗褐化處理過程中相關(guān)酶活性與酚酸類物質(zhì)含量變化的研究尚未見報(bào)道。鑒于此，本研究以成年黑皮油松的休眠芽為外植體，分析抗褐化劑PVP處理對(duì)其褐變及萌發(fā)的影響，篩選適宜的PVP處理濃度，在此基礎(chǔ)上分析抗褐化過程酚酸類物質(zhì)及PPO、POD、PAL酶活性的動(dòng)態(tài)變化，確定引起褐化現(xiàn)象的主要酚酸類物質(zhì)，探討PVP處理過程中酚酸類物質(zhì)及相關(guān)酶活性與其褐化的相關(guān)性，為黑皮油松組織培養(yǎng)過程中褐變這一瓶頸問題的解決提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐，進(jìn)而為黑皮油松高效植株再生體系的構(gòu)建奠定基礎(chǔ)。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料和培養(yǎng)方法 2018年3月10日從齊齊哈爾大學(xué)校園的成年黑皮油松上采集生長健壯、無病蟲害、芽體飽滿的休眠葉芽作為外植體。葉芽在洗潔精溶液中清洗干凈后流水下沖洗2 h，超凈工作臺(tái)上采用0.1%的HgCl2浸泡6 min，無菌水沖洗5次，每次5 min(帶有振蕩)； 無菌器械剝?nèi)パ亏[(圖1A)，將葉芽橫切成0.5～0.7 cm厚的薄片，按照形態(tài)學(xué)方向豎直接種到培養(yǎng)基上(圖1B)。

圖1 PVP處理對(duì)黑皮油松外植體褐化的影響

1.2 PVP處理試驗(yàn) DCR基本培養(yǎng)基(Guptaetal.， 1985)中分別添加不同質(zhì)量濃度的PVP(100、300、500、800、1 000、1 500、2 000 mg·L-1)，分別記為P1、P2、P3、P4、P5、P6、P7，以不添加任何抗褐化劑為對(duì)照(CK)。其余添加成分相同，分別添加30 g·L-1蔗糖、7 g·L-1瓊脂、2.0 mg·L-16-BA，pH5.8。培養(yǎng)條件： 溫度(25 ± 2)℃，光照每天16 h，光照強(qiáng)度1 500～2 000 lx。每個(gè)處理培養(yǎng)30個(gè)外植體，重復(fù)3次。接種后每隔4天觀察外植體的褐化情況，培養(yǎng)32天統(tǒng)計(jì)外植體的褐化率及休眠芽萌發(fā)率。

采用目視觀察確定褐化程度，將褐化等級(jí)劃分為3級(jí)： “+” 外植體輕度褐化，周圍培養(yǎng)基色澤淺； “++” 外植體中度褐化，周圍培養(yǎng)基顏色加深； “+++” 外植體褐化嚴(yán)重，周圍培養(yǎng)基顏色深。

褐化率=(褐化的外植體數(shù) /接種的外植體總數(shù))× 100%；

萌發(fā)率=(萌發(fā)的外植體數(shù) /接種的外植體總數(shù))× 100%。

1.3 酶活性和酚酸含量的測(cè)定 1)取樣 分別于接種后0、4、8、12、16、20、24、28、32天選取1 500 mg·L-1PVP處理與CK處理下典型性的黑皮油松外植體，液氮速凍后-80 ℃保存用于酶活性與酚酸含量的測(cè)定。

2)酶活性的測(cè)定 PPO活性測(cè)定參照朱廣廉等(1990)方法，PAL活性測(cè)定參照Solecka和Kacperska(2003)方法，POD活性測(cè)定參照李合生(2003)的愈創(chuàng)木酚法，3種方法均略作修改。

3)酚酸含量的測(cè)定 參考Alonso-Salces等(2005)方法略加改動(dòng)。稱取冷凍樣品1.0 g，加入10 mL 50%甲醇水溶液，研磨制備勻漿液，50 ℃ 40 kHz超聲40 min，重復(fù)提取2次，合并提取液； 將提取液8 000 r·min-1離心10 min，收集上清液，剩余上清液用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀40 ℃減壓濃縮，2 mL甲醇潤洗殘?jiān)?0%甲醇定容至5 mL，上機(jī)測(cè)試。測(cè)試條件： 超高效液相色譜儀(型號(hào) 1290，美國安捷倫公司生產(chǎn))； 二極管陣列檢測(cè)器(型號(hào)1290 Infinity II)； 色譜柱為Eclipse Plus C18柱(50 mm × 2.1 mm，1.8 μm)。使用A和B雙泵系統(tǒng)，流速0.5 mL·min-1，柱溫30 ℃，波長280 nm，進(jìn)樣量1 μL。流動(dòng)相A為2%(體積分?jǐn)?shù))乙酸水溶液，流動(dòng)相B為甲醇溶液。采用梯度洗脫： 0～2 min，A100%～100%，B0～0； 2～3 min，A100%～95%，B0～5%； 3～4 min，A95%～85%，B5%～15%； 4～5 min，A85%～75%，B15%～25%； 5～7 min，A75%～65%，B25%～35%； 7～9 min，A65%～50%，B35%～50%； 9～12 min，A50%～100%，B50%～0。甲醇和乙酸均為色譜純，沒食子酸、綠原酸、咖啡酸、兒茶酚、香豆酸、對(duì)羥基苯甲酸和阿魏酸7種標(biāo)準(zhǔn)品純度≥99%(Sigma公司生產(chǎn))。定量方法參照孫洪圳等(2012)，并略作改動(dòng)。每個(gè)樣品重復(fù)3次進(jìn)樣測(cè)定，測(cè)定結(jié)果取平均值。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)與處理 試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用Microsoft Excel 2007、SPSS 17.0、Origin 8.5軟件進(jìn)行分析處理，鄧肯氏新復(fù)極差法(Duncan)進(jìn)行顯著性檢驗(yàn)，圖中數(shù)據(jù)均為3次重復(fù)平均值。

2 結(jié)果與分析

2.1 抗褐化劑PVP對(duì)黑皮油松休眠芽外植體褐化和萌發(fā)的影響 以未添加抗褐化劑的外植體為對(duì)照(CK)，在培養(yǎng)基中添加不同質(zhì)量濃度的抗褐化劑PVP，于處理32天統(tǒng)計(jì)外植體褐化率與萌發(fā)率(表1)。結(jié)果表明，隨著PVP處理濃度的增加，褐化率與褐化程度均呈現(xiàn)先降后增的規(guī)律性變化，萌發(fā)率則先增后降，說明PVP處理可以有效抑制黑皮油松休眠芽外植體的褐化，并促進(jìn)其萌發(fā)。當(dāng)PVP濃度為1 500 mg·L-1(P6)時(shí)，褐化程度最輕，褐化率最低(25.56%)，萌發(fā)率也最高(37.78%)，整體來看顯著優(yōu)于其他處理； 當(dāng)PVP增至2 000 mg·L-1時(shí)，其抑制褐化與促進(jìn)萌發(fā)效果再次降低。綜合來看，300～1 500 mg·L-1PVP處理可以有效抑制黑皮油松休眠芽外植體的褐化，其中1 500 mg·L-1效果最好。培養(yǎng)32天結(jié)束時(shí)，對(duì)照休眠芽由上至下整體變?yōu)樯詈稚?，幾乎全部死?圖1C)，而PVP處理的外植體褐化程度明顯輕于對(duì)照組，長勢(shì)也明顯優(yōu)于對(duì)照組(圖1D)。

表1 不同濃度PVP處理對(duì)外植體褐化和芽萌動(dòng)的影響①

為進(jìn)一步明確PVP抑制黑皮油松外植體褐化的時(shí)間效應(yīng)，對(duì)PVP處理不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)外植體的褐化情況進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析(圖2)。隨著處理時(shí)間的增加，對(duì)照與所有PVP處理外植體的褐化率均呈現(xiàn)先增加后趨于穩(wěn)定的變化趨勢(shì)。具體來看，外植體均在培養(yǎng)4天時(shí)開始出現(xiàn)褐化，隨后隨著培養(yǎng)時(shí)間的增加，褐變的外植體數(shù)量逐漸增加。培養(yǎng)8天時(shí)，除P7處理外，其余PVP處理的褐化率均顯著低于對(duì)照，表明PVP(100～1 500 mg·L-1)處理從第8天開始表現(xiàn)出明顯的抑制黑皮油松外植體褐化的作用； 8～12天所有處理外植體褐變愈發(fā)嚴(yán)重，褐化率增加幅度大，其中800 mg·L-1PVP處理的褐化率從14.44%急劇增加到47.78%； 除P2、P6處理外，對(duì)照與其他5個(gè)PVP處理的外植體均在20～24天時(shí)褐化率達(dá)到峰值，隨后趨于穩(wěn)定。

圖2 PVP處理不同時(shí)間對(duì)黑皮油松外植體褐化的影響

2.2 PVP處理過程相關(guān)酶活性的動(dòng)態(tài)變化 組培褐變是一個(gè)復(fù)雜的生理代謝過程，為了更清楚地了解抗褐化劑PVP減緩黑皮油松離體外植體褐化的機(jī)理，進(jìn)一步以1 500 mg·L-1PVP處理(最佳處理)不同時(shí)間節(jié)點(diǎn)的黑皮油松外植體為材料，以不添加PVP的外植體為對(duì)照，分析PPO、POD、PAL 3種抗氧化酶活性的變化特征(圖3)。

1) PPO活性的動(dòng)態(tài)變化 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，對(duì)照組PPO活性呈現(xiàn)“升—降—升—降”的交替式變化，0～8天 PPO活性有小幅增加，8～12天急劇增加，12天出現(xiàn)峰值，活性為8.75 U·g-1min-1，顯著高于其他處理天數(shù)(P< 0.05)，為PVP同樣處理天數(shù)下的3.5倍； 12～20天PPO活性呈現(xiàn)遞減的變化趨勢(shì)， 20～24天再次增加，24天活性為5.83 U·g-1min-1，隨后再次降低。對(duì)照組PPO活性在8～12天和20～24天急劇增加，這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)恰好是外植體褐變愈發(fā)嚴(yán)重的時(shí)期。與對(duì)照相比，PVP處理的外植體PPO活性在整個(gè)培養(yǎng)周期內(nèi)始終處于相對(duì)較低的水平(1.25～2.92 U·g-1min-1)，從處理后4 天開始PPO活性顯著低于對(duì)照(圖3A)。上述結(jié)果表明PPO活性變化與黑皮油松外植體褐化密切相關(guān)，PVP處理可抑制PPO活性的升高。

2) PAL活性的動(dòng)態(tài)變化 在0～32天內(nèi)，CK處理PAL活性呈現(xiàn)“升—降—升—降—升—降”的交替式變化，0～12天PAL活性小幅增加，12天活性52.08 U·g-1min-1，12～16 天大幅降低，16～20天急劇增加， 20天達(dá)到峰值(148.33 U·g-1min-1)，顯著高于其他處理天數(shù)(P< 0.05)， 20～32天PAL活性再次出現(xiàn)多次波動(dòng)，28天出現(xiàn)小高峰(活性為65.42 U·g-1min-1)。與對(duì)照相比，PVP處理PAL活性在整個(gè)處理周期內(nèi)一直處于相對(duì)較低的水平，活性為4.58～31.67 U·g-1min-1， 20天時(shí)活性最高(31.67 U·g-1min-1)，但仍顯著低于對(duì)照20天的活性(P< 0.05)(圖3B)。由此看出，與對(duì)照相比，PVP處理從第8天開始PAL活性明顯受到抑制，觀察發(fā)現(xiàn)PVP處理表現(xiàn)出明顯抑制黑皮油松外植體褐化的時(shí)間點(diǎn)也是從第8天開始，褐變嚴(yán)重的對(duì)照PAL活性顯著高于外植體褐變程度輕的PVP處理，因此推測(cè)PVP處理可能通過抑制PAL活性來阻止黑皮油松外植體發(fā)生褐變。

3) POD活性的動(dòng)態(tài)變化 隨著培養(yǎng)時(shí)間的延長，對(duì)照外植體第4天時(shí)POD活性顯著增加，4～16天POD活性下降，16～20天急劇增加， 20天出現(xiàn)峰值，活性為1 419.12 U·g-1min-1，顯著高于其他處理天數(shù)(P< 0.05)，隨后POD活性再次降低直至培養(yǎng)結(jié)束。與對(duì)照相比，PVP處理的外植體POD活性呈現(xiàn)不同的變化趨勢(shì)，8天時(shí)出現(xiàn)第1個(gè)小高峰(488.33 U·g-1min-1)，隨后降低，16～28天POD活性再次提高(717.08～818.75 U·g-1min-1)，顯著高于其他處理天數(shù)(P< 0.05)，28～32天時(shí)活性再次降低(圖3C)。整體來看POD活性與褐變數(shù)據(jù)變化的規(guī)律不明顯，可能由于取樣持續(xù)時(shí)間歷時(shí)較長，培養(yǎng)基成分和萌發(fā)生長階段等多因素影響導(dǎo)致POD活性測(cè)定結(jié)果呈現(xiàn)波動(dòng)式變化。

2.3 PVP處理過程中酚酸類物質(zhì)含量的動(dòng)態(tài)變化1) 綠原酸含量動(dòng)態(tài)變化 與對(duì)照相比，PVP處理的外植體中綠原酸含量在整個(gè)培養(yǎng)周期始終處于較高的水平，從第4天開始直至培養(yǎng)結(jié)束均顯著高于對(duì)照，且整體呈現(xiàn)“降—升—降—升”的交替式變化，PVP處理0～12天綠原酸含量逐漸降低，隨后再次提高，16天出現(xiàn)小高峰(含量為1.875 μg·mL-1)，但顯著低于0 天的含量，16～20天再次降低后有小幅度的增加，隨后保持穩(wěn)定(圖4A)。上述研究結(jié)果表明PVP處理從第8天開始保護(hù)外植體內(nèi)綠原酸不被氧化，進(jìn)而抑制黑皮油松外植體發(fā)生褐變。

2) 香豆酸含量動(dòng)態(tài)變化 對(duì)照與PVP處理過程中香豆酸含量變化出現(xiàn)多次波動(dòng)，但整體來看對(duì)照與PVP處理香豆酸含量較為接近，始終維持在較低的水平(0.312～0.825 μg·mL-1)，據(jù)此推測(cè)PVP處理抑制黑皮油松外植體褐化的作用可能與香豆酸關(guān)系較小。具體來看，對(duì)照處理0天香豆酸含量最高(0.825 μg·mL-1)，除與20天差異不顯著外，均顯著高于其他處理天數(shù)(P< 0.05)，0～12 天香豆酸含量逐漸降低，12～20 天逐漸增加，隨后再次降低。PVP處理香豆酸含量呈現(xiàn)“降(0～8天)—升(8～16天)—降(16～20天)—升(20～24天)—降(24～32天)”交替式變化(圖4B)。

3) 阿魏酸含量動(dòng)態(tài)變化 對(duì)照外植體中阿魏酸含量在0～16 天遞減，16～32天小幅波動(dòng)； 而PVP處理則出現(xiàn)多次波動(dòng)，呈現(xiàn)“降(0～12 天)—升(12～16 天)—降(16～20 天)—升(20～24 天)—降(24～32 天)”交替式變化。0～12 天PVP處理與對(duì)照阿魏酸含量較為接近，變化趨勢(shì)也類似； 但16～32 天PVP處理阿魏酸含量顯著高于對(duì)照，24 天時(shí)PVP處理外植體阿魏酸含量最高(5.433 μg·mL-1)，顯著高于其他處理天數(shù)(P< 0.05)(圖4C)。據(jù)此推測(cè)PVP處理抑制外植體褐變可能主要是通過保護(hù)綠原酸和阿魏酸不被氧化而起作用，其中對(duì)綠原酸在全程起到保護(hù)作用，對(duì)阿魏酸的保護(hù)作用僅在中后期(16～32 天)。

3 討論

3.1 PVP處理黑皮油松休眠芽外植體的抗褐化效果 PVP作為一種無機(jī)吸附劑，通過吸附外植體釋放出來的酚類物質(zhì)，阻止酚類物質(zhì)不被氧化進(jìn)而達(dá)到抑制外植體褐變的目的，因此在植物組織培養(yǎng)中廣泛用于抑制褐化，而且效果顯著(Babbaretal.， 1986； 饒慧云等， 2015； 高紅兵等， 2017； 彭春雪等， 2019)。本研究結(jié)果表明，300～1 500 mg·L-1PVP處理可以有效抑制黑皮油松休眠芽外植體的褐化，并促進(jìn)休眠芽啟動(dòng)萌發(fā)。葉睿華等(2018)的研究也發(fā)現(xiàn)PVP對(duì)杜鵑蘭(Cremastraappendiculata)原球莖褐化具有抑制作用，并能提高原球莖增殖率。本研究篩選出PVP最佳處理濃度為1 500 mg·L-1，說明培養(yǎng)基中添加適宜濃度的PVP能有效吸附外植體釋放的酚類物質(zhì)，阻止酚類物質(zhì)被氧化成醌類物質(zhì)，從而達(dá)到抑制外植體褐化的效果，但當(dāng)PVP處理濃度增至2 000 mg·L-1時(shí)，防褐化效果顯著降低，說明高濃度的PVP會(huì)影響其抑制褐化作用的發(fā)揮。葡萄愈傷組織的繼代研究中也發(fā)現(xiàn)2 000 mg·L-1PVP有助于抑制褐化，但增至3 000 mg·L-1時(shí)褐化率再次增加(饒慧云等， 2015)，分析可能是由于PVP濃度過高導(dǎo)致其吸附酚類物質(zhì)的同時(shí)也吸附培養(yǎng)基中的營養(yǎng)物質(zhì)，進(jìn)而影響了植物對(duì)有益物質(zhì)的吸收和利用，最終影響抗褐化效果(Teixeriaetal.， 1994)。

3.2 主要酚酸、酶活性與外植體褐化之間的關(guān)系 褐化是復(fù)雜的生化過程，由酶引起細(xì)胞內(nèi)的氧化褐變是組培中外植體褐化的主要方式。PPO、POD和PAL被認(rèn)為是在組培褐變過程中發(fā)揮作用較大的酶，其中PPO是引起酚類物質(zhì)氧化的主要催化酶； PAL是酚類物質(zhì)前體合成中的關(guān)鍵酶，可通過抑制PAL活性，抑制酚類的積累和合成，從而抑制褐變的發(fā)生； POD可在被切割外植體釋放的H2O2作用下促進(jìn)酚類物質(zhì)氧化導(dǎo)致組織褐變(Pérezetal.， 2012)。

本研究中綜合PVP抑制黑皮油松外植體褐變時(shí)間效應(yīng)與酶活作用時(shí)間點(diǎn)數(shù)據(jù)發(fā)現(xiàn)，CK處理PPO、PAL活性在8～12天或20～24 天急劇增加，這2個(gè)時(shí)間點(diǎn)也恰好是外植體褐變愈發(fā)嚴(yán)重的時(shí)期，而PVP處理在第8 天開始褐變程度明顯輕于對(duì)照，與此同時(shí)PPO、PAL活性也顯著低于CK處理，說明PVP抑制黑皮油松外植體褐化過程伴隨著PPO、PAL活性降低，PVP可通過抑制PPO活性的增加阻止酚類物質(zhì)的氧化而導(dǎo)致形成醌類物質(zhì)的減少，或者通過影響PAL的活性進(jìn)而阻止酚類物質(zhì)的合成，最終有效抑制黑皮油松外植體褐變。阿月渾子(Pistaciavera)組培苗(冷平生等， 2012)和葡萄愈傷組織(饒慧云等， 2015)研究中也發(fā)現(xiàn)，PVP處理下PPO活性明顯低于對(duì)照，PVP可通過抑制PAL活性增加有效抑制桃(Prunuspersica)果肉褐變(楊青珍等， 2016)。最近芍藥(Paeonialactiflora)研究中也發(fā)現(xiàn)，抑制褐變過程伴隨著PPO、PAL活性的降低(Caietal.， 2020)。對(duì)于POD與褐化的關(guān)系說法不一，不同植物材料差異較大。馬鈴薯(Solanumtuberosum)塊莖酶促褐變程度與PPO和POD活性顯著正相關(guān)(王麗等， 2019)； 而鳳丹牡丹(Paeoniaostii)愈傷組織褐變與POD活性呈負(fù)相關(guān)(毛沛琪等， 2018)。據(jù)此推測(cè)在黑皮油松組培中PVP主要通過抑制PPO和PAL的活性來阻止酚酸被氧化或者抑制酚類物質(zhì)的合成，進(jìn)而阻止黑皮油松休眠芽外植體發(fā)生褐變。因此在今后的黑皮油松組培中可通過抑制PPO、PAL活性以達(dá)到抑制褐變的目的。

酚類物質(zhì)作為植物組培中褐變的物質(zhì)基礎(chǔ)，其種類和含量對(duì)組織褐變起到至關(guān)重要的作用，酚類物質(zhì)含量越高，褐變?cè)絿?yán)重。本研究PVP處理過程中外植體綠原酸含量顯著高于對(duì)照，說明PVP處理對(duì)外植體內(nèi)的綠原酸具有保護(hù)作用，馬鈴薯(Fengetal.， 2020)和天女木蘭(高紅兵等， 2017)抗褐化研究中也得出類似的結(jié)論。此外，研究發(fā)現(xiàn)添加48.5 mg·L-1阿魏酸能顯著抑制地涌金蓮(Musellalasiocarpa)愈傷組織的褐化，說明阿魏酸在組織培養(yǎng)中具有抗褐化的作用(侯健華等， 2015)。與上述研究結(jié)果類似，在本研究中也證實(shí)了阿魏酸具有抑制黑皮油松外植體發(fā)生褐變的作用，本研究中PVP處理與對(duì)照0～12 天阿魏酸含量接近，且變化趨勢(shì)類似，16～32 天阿魏酸含量顯著高于對(duì)照，說明除綠原酸外，PVP處理也可以有效阻止阿魏酸被氧化，進(jìn)而起到抑制外植體發(fā)生褐變的作用。本研究中香豆酸含量在PVP與對(duì)照處理全程均處于較低水平，說明香豆酸可能化學(xué)性質(zhì)相對(duì)穩(wěn)定不易被氧化，天女木蘭的研究中也得到相似的結(jié)論(高紅兵等， 2017)。綜上得出PVP處理抑制黑皮油松外植體褐變可能主要是通過保護(hù)綠原酸和阿魏酸起作用，其中全程對(duì)綠原酸起保護(hù)作用，而對(duì)阿魏酸僅在中后期發(fā)揮作用。

除上述3種酚酸外，本研究同時(shí)對(duì)沒食子酸、兒茶酚、對(duì)羥基苯甲酸、咖啡酸進(jìn)行了分析，但試驗(yàn)結(jié)果中僅檢測(cè)到了綠原酸、香豆酸和阿魏酸3種酚酸，其余4種酚酸含量過低未檢測(cè)出，說明這4種酚酸對(duì)黑皮油松外植體的褐化現(xiàn)象影響不大。

4 結(jié)論

300～1 500 mg·L-1PVP處理可以有效抑制黑皮油松休眠芽外植體的褐化，并促進(jìn)休眠芽萌發(fā)，1 500 mg·L-1PVP為最佳處理濃度?？购只瘎㏄VP通過抑制PPO、PAL活性來阻止黑皮油松外植體發(fā)生褐變。PVP處理抑制外植體褐變與綠原酸和阿魏酸不被氧化有關(guān)，PVP處理可以對(duì)綠原酸全程起保護(hù)作用，而對(duì)阿魏酸僅在中后期起作用。

目前對(duì)于抗褐化劑處理抑制外植體褐化的時(shí)間效應(yīng)的研究相對(duì)較少，本研究探討了PVP抑制黑皮油松外植體褐化的時(shí)間效應(yīng)及相關(guān)酶活性、酚酸類物質(zhì)與外植體褐變的關(guān)系，結(jié)果可為黑皮油松組織培養(yǎng)過程中褐變這一瓶頸問題的解決提供理論依據(jù)和技術(shù)支撐。