邵雪花，賴 多，匡石滋

（廣東省農(nóng)業(yè)科學(xué)院果樹研究所/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部南亞熱帶果樹生物學(xué)與遺傳資源利用重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室/廣東省熱帶亞熱帶果樹研究重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，廣東 廣州 510640）

【研究意義】印楝素（azadirachtin,AZA）作為植物源殺蟲劑的典型代表，可抑制多種害蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，已被廣泛應(yīng)用到害蟲防制中［1］。草地貪夜蛾是農(nóng)業(yè)生產(chǎn)中的重要害蟲［2］，也是對(duì)印楝素最為敏感的害蟲之一。研究表明，對(duì)FOXO基因是調(diào)控昆蟲生長(zhǎng)發(fā)育的關(guān)鍵轉(zhuǎn)錄因子［3］，但該基因如何調(diào)控印楝素所誘導(dǎo)的昆蟲細(xì)胞凋亡卻未見報(bào)道，這在一定程度上制約了印楝素的科學(xué)使用?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】印楝素是從印楝樹（Azadirachta indicaA.Juss）的種子、葉子和其他部分中分離出來的檸檬苦素類化合物，幾十年來一直在害蟲綜合治理中用作拒食劑和害蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑［4］。AZA 被認(rèn)為是最有效生物農(nóng)藥之一，最適合于商品化開發(fā)的植物源殺蟲劑［5-7］。草地貪夜蛾（Spodoptera frugiperda）是起源于美洲大陸的一種跨國界遷飛性農(nóng)業(yè)重大害蟲，具有繁殖能力強(qiáng)、遷飛擴(kuò)散快和防控難度大等特點(diǎn)［8-10］。其寄主范圍廣，幼蟲可取食禾本科、菊科、豆科和莧菜科等76 科353 種植物，給生產(chǎn)帶來巨大威脅［11］。前人研究表明，AZA 可以誘導(dǎo)粉紋夜蛾（Cabbage looperHi-5）、斜紋夜蛾（Spodoptera lituraSL-1）和 草地貪夜蛾（Spdoptera frugiperdasf9）等多種昆蟲細(xì)胞凋亡，進(jìn)而抑制細(xì)胞增殖［12-14］。此外，AZA 已被證明可激活癌細(xì)胞中的多種凋亡信號(hào)通路，如受體通路、AIF 介導(dǎo)通路、ROS 依賴性、p38 和JNK1/2 通路以及MAPK通路［15-16］。細(xì)胞凋亡（Apoptosis）又稱程序性細(xì)胞死亡（Programmed cell death，PCD），是一種特殊的細(xì)胞死亡方式，是為維持內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定，由基因控制的細(xì)胞自主有序的主動(dòng)死亡過程［17］。當(dāng)細(xì)胞凋亡調(diào)控失衡時(shí)，可引起細(xì)胞過度增殖或過度凋亡，導(dǎo)致細(xì)胞死亡和相關(guān)疾病的發(fā)生［18］。FOXO基因作用廣泛，參與調(diào)控生長(zhǎng)、抗腫瘤、細(xì)胞分化、新陳代謝及細(xì)胞凋亡等多種過程［19］。FOXO 不僅可調(diào)控幼蟲的生長(zhǎng)發(fā)育，還能通過胰島素受體InR對(duì)胰島素信號(hào)通路進(jìn)行反饋調(diào)節(jié)［20］。【本研究切入點(diǎn)】我們之前的研究表明AZA 可通過溶酶體釋放組織蛋白酶而誘導(dǎo)中腸細(xì)胞凋亡［21］，F(xiàn)OXO基因位于溶酶體信號(hào)通路的上游，可參與調(diào)控凋亡信號(hào)的轉(zhuǎn)導(dǎo)通路，那么該基因是如何調(diào)控印楝素誘導(dǎo)的昆蟲細(xì)胞凋亡呢？本研究從轉(zhuǎn)錄因子FOXO出發(fā)，結(jié)合細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)等技術(shù)手段，研究FOXO基因在印楝素誘導(dǎo)sf9 細(xì)胞凋亡中的作用。【擬解決的關(guān)鍵問題】本研究以印楝素和草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞為研究對(duì)象，探討印楝素通過FOXO轉(zhuǎn)錄因子調(diào)控sf9 細(xì)胞的增殖和凋亡的作用機(jī)理，為探索印楝素分子機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

藥物及試劑：草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞sf9（C0004）購自于深圳市百恩生物科技有限公司，印楝素（A115081）購于上海晶純生化科技股份有限公司，SFM（12682-019）購于賽默飛世爾科技公司，小牛血清（11011-8611）購自于杭州四季青生物工程材料有限公司，Phospho-FOXO（#84192）、Cleaved Caspase-3（#9661）、Bim（#2933）均購自Cell signaling 公司，小鼠單克隆抗體，HRP 標(biāo)記的山羊抗小鼠IgG（D110087）購自生工生物工程（上海）股份有限公司，HRP 標(biāo)記羊抗兔IgG（#A0208）購自碧云天生物技術(shù)有限公司，ECL 顯色試劑盒（#1705060）購自Bio-Rad 公司，BCA 定量試劑盒（#PA115）購自于天根生化科技（北京）有限公司。

細(xì)胞培養(yǎng)：將復(fù)蘇后穩(wěn)定生長(zhǎng)的sf9 細(xì)胞置于培養(yǎng)基中，加入含有10%小牛血清的SFX，在27 ℃細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育，傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.2 CCK-8 法檢測(cè)細(xì)胞增殖

將傳代至對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的sf9 細(xì)胞懸浮液（100～500 CFU/μL）接種到96 孔板（100 μL/孔）中。待細(xì)胞貼壁后，吸棄培養(yǎng)基，加入不同濃度的AZA 培養(yǎng)液，設(shè)置AZA 0.625、1.25、2.5、5.0、10.0、20、40、80 mmol/L 8 個(gè)濃度處理，另設(shè)細(xì)胞對(duì)照和溶劑對(duì)照（1‰ DMSO），27 ℃孵育48 h，向各孔加入10 μL CCK-8 溶液，繼續(xù)孵育3 h，于450 nm 處測(cè)定吸光度。每個(gè)濃度設(shè)置8 個(gè)重復(fù)孔，并取每組中3 次實(shí)驗(yàn)的平均值，計(jì)算細(xì)胞活力:

式中，A加藥為含有細(xì)胞、CCK-8 和AZA 的孔內(nèi)OD 值，A空白為只含CCK-8、不含細(xì)胞和AZA 的孔內(nèi)OD 值，A零加藥為含細(xì)胞、CCK-8 不含AZA的孔內(nèi)OD 值。

1.3 透射電鏡觀察sf9 細(xì)胞

5 mmol/L AZA 分別作用于細(xì)胞24、48、72 h，對(duì)照加入1‰ DMSO 細(xì)胞培養(yǎng)液，每隔2 d 重新更換培養(yǎng)液并重新給藥。反復(fù)吹打后收集細(xì)胞懸浮液，室溫800 r/ min 離心5 min，棄去上清液。用 PBS 溶液（pH7.4）洗滌3 次，800 r/ min 離心5 min 后用2.5%戊二醛吹散并置于4 ℃過夜。第2 天室溫800 r/ min 離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，用PBS 溶液（pH7.4）洗滌3 次，800 r/ min 離心5 min。使用2%瓊脂粉包埋細(xì)胞沉淀，修切包埋塊后用PBS 清洗3 次，800 r/ min 離心5 min。用1%鋨酸固定2 h，每次PBS 洗滌3 次，每次洗滌30 min；用不同濃度梯度的乙醇進(jìn)行脫水處理，每次脫水20 min。脫水后的樣品用樹脂與丙酮滲透4 h，然后在純樹脂中滲透過夜；將樣品在聚合反應(yīng)器中聚合，重新包埋后用LKB-V 超薄切片進(jìn)行切片，后將超薄切片用乙酸雙氧鈾-檸檬酸鉛染色，自然干燥后在透射電子顯微鏡下觀察、拍照。

1.4 流式細(xì)胞儀分揀Annexin V-FITC/PI 染色的凋亡細(xì)胞

將sf9 細(xì)胞鋪滿6 孔板的90 %，用AZA 處理細(xì)胞處理方式同透射電鏡檢測(cè)；使用細(xì)胞刮刀輕輕刮取細(xì)胞，800 r/min 離心5 min 收集細(xì)胞沉淀；用預(yù)冷的PBS 洗滌細(xì)胞沉淀2 次，800 r/min 4 ℃離心5 min，棄上清。使用500 μL 的Binding Buffer 懸浮細(xì)胞，用5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI 混勻后輕輕吹打細(xì)胞后避光，室溫反應(yīng)10 min。最后使用流式細(xì)胞儀檢測(cè)Annexin V-FITC的綠色熒光和PI 的紅色熒光。

1.5 Western blot 檢測(cè)蛋白表達(dá)

5 mmol/L AZA 處理sf9 細(xì)胞48 h 后，對(duì)照加入1‰ DMSO 的細(xì)胞培養(yǎng)液，用PBS 洗滌3 次，用RIPA 提取總細(xì)胞蛋白，BCA 試劑盒進(jìn)行蛋白定量，加入4×蛋白質(zhì)上樣緩沖液。煮沸5 min，分裝后于-20 ℃冰箱保存待用。將約20 μg 蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-PAGE 電泳，并將蛋白質(zhì)轉(zhuǎn)移至PVDF 膜。將10%脫脂奶粉封閉2 h 后，將一抗于4 ℃搖床上孵育過夜，用PBS 洗滌膜，加入辣根過氧化物酶標(biāo)記的二抗，并用ECL 發(fā)光試劑盒測(cè)試。使用Image Pro4.5 圖像分析軟件進(jìn)行灰度掃描，分析每個(gè)條帶的灰度值，以β-Tubulin作為內(nèi)部參考。分別以Phospho-FOXO、Cleaved Caspase-3、Bim 和β-Tubulin 進(jìn)行灰度比值計(jì)算作半定量分析。

1.6 RNA 提取和qRT-PCR

用TRIzol試劑提取sf9細(xì)胞的總RNA，通過試劑盒合成cDNA。使用SYBR Green Master MixqPCR定量試劑盒測(cè)定FOXO和α-tubulin的m R N A 表達(dá)水平。引物序列如下：F O X O（F:5'-GGATGTGCATTCTATGGTGTACC -3';R:5'-TTTCGGGATTGCTTTATCTCAGAC -3'）,α-tubulin（F:5'-CGCATTCATGGTTGATAACG-3';R:5'-GGGCACCAAGTTAGTCTGGA -3'），基因相對(duì)表達(dá)量采用2-ΔΔCt法測(cè)定［22］，重復(fù)3次。

1.7 雙鏈RNA 合成及Caspase-3 酶活檢測(cè)

通 過T7 RNAi 系 統(tǒng)（RiboMAXTM）合 成dsRNAFOXO，用 LipofectamineTM2000 轉(zhuǎn) 染 sf9細(xì)胞。轉(zhuǎn)染 dsRNAFOXO后，收集 AZA 處理的sf9 細(xì)胞利用Caspase-3 酶活檢測(cè)試劑盒測(cè)定其活性。800 r/min 離心5 min 收集細(xì)胞，PBS 洗滌細(xì)胞3 次，加入RIPA 裂解緩沖液提取細(xì)胞總蛋白。隨后使用 BCA 試劑盒測(cè)定蛋白濃度，將蛋白溶液與Caspase-3 的特異性發(fā)光底物在37 ℃避光孵育4 h，在405 nm 處測(cè)定光密度。

試驗(yàn)數(shù)據(jù)使用SPSS 19.0 單因素方差分析（SPSS，Chicago，USA）進(jìn)行差異顯著性測(cè)驗(yàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 印楝素抑制sf9 細(xì)胞增殖

CCK-8 法檢測(cè)結(jié)果表明，AZA 在體外對(duì)草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞的增殖有明顯的抑制作用。作用48 h 后，細(xì)胞活力隨AZA 濃度的增加而顯著降低（圖1A），呈明顯的濃度依賴性。當(dāng)AZA 在較低濃度0.625 mmol/L 時(shí)，細(xì)胞活力為95.32%；當(dāng)AZA 處理濃度為5 mmol/L 時(shí)，細(xì)胞存活率為67.31%，將該濃度用作后續(xù)試驗(yàn)的處理濃度。進(jìn)一步用5 mmol/L 的AZA 處 理sf9 細(xì)胞24、48、72、96 h 后發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞活力隨處理時(shí)間的延長(zhǎng)而呈下降趨勢(shì)（圖1B）。由此可見，AZA 對(duì)sf9 細(xì)胞的抑制作用呈明顯的時(shí)間和濃度依賴性。

2.2 印楝素破壞sf9 細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)

用5 mmol/L AZA 分別處理sf9 細(xì)胞0、24、48、72 h，從結(jié)果（圖2）可以看出，AZA 處理0 h 細(xì)胞結(jié)構(gòu)完整，細(xì)胞核較大核膜清晰可見，染色質(zhì)分布均勻，可見明顯的細(xì)胞器。當(dāng)AZA 處理24 h 后，細(xì)胞核收縮，染色質(zhì)聚集，細(xì)胞質(zhì)呈空泡狀；處理48 h 后，細(xì)胞空泡化增加，細(xì)胞膜收縮，染色質(zhì)聚集更嚴(yán)重，細(xì)胞變形;處理72 h 后，細(xì)胞核的染色質(zhì)聚集成大顆粒并沿核膜分布，細(xì)胞骨架破損，細(xì)胞變形不能維持正常的穩(wěn)態(tài)，細(xì)胞崩解逐級(jí)走向死亡。表明印楝素可破壞草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞的超微結(jié)構(gòu)。

2.3 印楝素誘導(dǎo)sf9 細(xì)胞凋亡

根據(jù)Annexin V-FITC/ PI 聯(lián)用的流式細(xì)胞分揀原理，其檢測(cè)能夠?qū)颖局械恼＜?xì)胞（圖3A左下）、死亡細(xì)胞（圖3A 左上），早期凋亡細(xì)胞（圖3A 右上）和中晚期凋亡細(xì)胞（圖3A 右下）分類和統(tǒng)計(jì)，獲得的結(jié)果可以更好地計(jì)算細(xì)胞凋亡率。根據(jù)統(tǒng)計(jì)結(jié)果（圖3B），可看出隨AZA 處理時(shí)間延長(zhǎng)，早期凋亡細(xì)胞比率增加。處理0 h為1.09%，處理24 h 為14.83%，處理48 h 為23.81%，處理72 h 為46.94%，不同處理間差異顯著，即AZA 誘導(dǎo)的sf9 細(xì)胞凋亡率與時(shí)間呈正相關(guān)。

2.4 印楝素通過上調(diào)FOXO 基因誘導(dǎo)sf9 細(xì)胞凋亡

用5 mmol/L AZA 處理sf9 細(xì)胞48 h 后，與對(duì)照相比凋亡蛋白Bim 和Cleaved-Caspase-3 的表達(dá)水平顯著增加（圖4A、B）。FOXO 總蛋白表達(dá)無明顯差異，但P-FOXO 蛋白表達(dá)顯著低于對(duì)照。表明AZA 可抑制sf9 細(xì)胞中FOXO 蛋白的磷酸化水平，從而誘導(dǎo)凋亡。進(jìn)一步利用qRT-PCR 檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)OXO基因的表達(dá)量與AZA 處理時(shí)間呈正相關(guān)，在此基礎(chǔ)上通過RNAi 技術(shù)降低FOXO基因在sf9 細(xì)胞中的表達(dá)量，經(jīng)AZA 處理后發(fā)現(xiàn)Caspase-3 的酶活性顯著降低。表明AZA 可通過上調(diào)轉(zhuǎn)錄因子FOXO的表達(dá)而誘導(dǎo)sf9 細(xì)胞凋亡。

3 討論

印楝素是目前世界公認(rèn)的活性最強(qiáng)的拒食劑和昆蟲生長(zhǎng)調(diào)節(jié)劑，是最優(yōu)秀的生物農(nóng)藥之一。印楝素處理后，昆蟲不能正常蛻皮，停滯在幼蟲-蛹中間體或永久幼蟲狀態(tài)［13］。大量實(shí)驗(yàn)證明，印楝素可導(dǎo)致草地貪夜蛾、斜紋夜蛾和粉紋夜蛾等昆蟲離體細(xì)胞的線粒體膜電位降低，引起細(xì)胞凋亡［23-24］。早在1993 年，Rembold 和Annadurai曾報(bào)道印楝素可影響草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞sf9 的增殖和蛋白合成［25］。本研究采用CCK-8 方法證實(shí)了AZA 可抑制草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞的增殖，且呈現(xiàn)時(shí)間和濃度的依賴性。透射電鏡發(fā)現(xiàn)sf9 細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)發(fā)生明顯變化，即細(xì)胞核發(fā)生變形和皺縮，染色質(zhì)聚集，細(xì)胞質(zhì)空泡化；流式細(xì)胞凋亡率檢測(cè)表明，凋亡細(xì)胞與處理時(shí)間呈正相關(guān)，提示AZA 抑制sf9 細(xì)胞增殖，促進(jìn)細(xì)胞凋亡，與前期研究結(jié)果一致。

細(xì)胞凋亡受細(xì)胞內(nèi)各種分子調(diào)節(jié)，F(xiàn)OXO 屬于叉頭轉(zhuǎn)錄因子家族，在細(xì)胞凋亡中起重要作用［26］，可被PI3K/Akt 信號(hào)通路調(diào)控，該通路與細(xì)胞生存密切相關(guān)。FOXO 為Akt 的下游底物，激 活A(yù)kt 使FOXO 的Thr32、Ser253 及Ser315 三個(gè)位點(diǎn)發(fā)生磷酸化，并從細(xì)胞核轉(zhuǎn)運(yùn)至細(xì)胞質(zhì)，不發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子的作用；反之，當(dāng)Akt 的活性下降時(shí)，F(xiàn)OXO 的磷酸化水平下降，非磷酸化的FOXO 可移位進(jìn)入細(xì)胞核，發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄活性，誘導(dǎo)靶基因的轉(zhuǎn)錄［27］。Bim 蛋白是Bcl-2 凋亡相關(guān)蛋白家族中僅含有BH3 結(jié)構(gòu)域的促凋亡蛋白，是FOXO 誘導(dǎo)的重要靶基因，轉(zhuǎn)錄因子FOXO 可結(jié)合于Bim 的啟動(dòng)子上調(diào)控Bim 的表達(dá)。Bim 表達(dá)上調(diào)促進(jìn)線粒體釋放細(xì)胞色素c 及Caspase 的激活，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡［28-29］。本研究顯示，AZA 作用sf9 細(xì)胞后，F(xiàn)OXO 總蛋白水平?jīng)]有顯著變化，但磷酸化水平降低，靶基因Bim 的蛋白表達(dá)量增加，Cleaved Caspase-3 蛋白的表達(dá)水平上升，說明印楝素通過降低sf9 細(xì)胞中FOXO基因的磷酸化水平，使其發(fā)揮其轉(zhuǎn)錄因子活性，進(jìn)而誘導(dǎo)FOXO 的靶基因促凋亡蛋白Bim 表達(dá)量升高，該蛋白表達(dá)量升高導(dǎo)致Caspase-3 的激活。為驗(yàn)證這一結(jié)論，本研究在此基礎(chǔ)上，利用RNAi技術(shù)降低sf9 細(xì)胞中FOXO基因表達(dá)，AZA 處理后發(fā)現(xiàn)Caspase-3 活性顯著降低，證實(shí)轉(zhuǎn)錄因子FOXO可調(diào)控AZA 誘導(dǎo)的sf9 細(xì)胞凋亡。然而，由AZA 控制的細(xì)胞的凋亡過程非常復(fù)雜，涉及多個(gè)信號(hào)通路和生物過程，其分子機(jī)制仍需進(jìn)一步研究。

4 結(jié)論

本研究以草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞sf9 為研究對(duì)象，探討了印楝素對(duì)sf9 細(xì)胞增殖的影響及其作用機(jī)理。結(jié)果表明，印楝素對(duì)sf9 細(xì)胞有明顯的增殖抑制作用，且呈明顯的時(shí)間和濃度依賴性。透射電鏡觀察到5 mmol/L AZA 可破壞sf9 細(xì)胞的微觀結(jié)構(gòu)，導(dǎo)致細(xì)胞核收縮，染色質(zhì)聚集，細(xì)胞質(zhì)空泡狀；進(jìn)一步通過流式細(xì)胞儀檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，AZA 可誘導(dǎo)sf9 細(xì)胞凋亡并與處理時(shí)間呈正相關(guān)；分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)AZA 可使sf9 細(xì)胞中FOXO 蛋白的磷酸化水平降低，靶基因促凋亡Bim 和Cleaved Caspase-3 的表達(dá)量增加；進(jìn)一步利用RNAi 技術(shù)沉默F(xiàn)OXO后，經(jīng)AZA 處理發(fā)現(xiàn)Caspase-3 的酶活性顯著降低。表明印楝素可通過上調(diào)FOXO的表達(dá)而誘導(dǎo)草地貪夜蛾卵巢細(xì)胞凋亡。