三陰性乳腺癌細胞脂肪非典型鈣黏蛋白4表達下調的生物學作用及機制

蒲盧蘭，謝少利，李金穗，蘇小涵，譚巧，高硯春，鄧世山，侯令密，3

[1.川北醫(yī)學院附屬醫(yī)院甲狀腺乳腺外科、乳腺癌生物靶向研究室、院士（專家）工作站，四川南充637000；2.川北醫(yī)學院解剖學教研室，四川南充637000；3.四川大學華西醫(yī)院營山醫(yī)院甲狀腺乳腺外科，四川南充637000]

三陰性乳腺癌（triple negative breast cancer，TNBC）是一種雌孕激素受體及HER-2 表達均呈陰性且惡性程度極高的乳腺腫瘤，因為缺乏特異性的治療靶標，臨床預后極差，尋找TNBC 早期診斷和治療的靶點尤其重要[1-2]。課題組前期研究發(fā)現(xiàn)脂肪非典型鈣黏蛋白4（FAT4）在TNBC 組織中呈低表達，F(xiàn)AT4 的低表達與TNBC 患者的惡性生物學特征（淋巴結轉移、組織學分級等）及不良預后密切相關[3-4]。但是FAT4 影響TNBC 的具體機制尚不明確。相關研究表明FAT4 作為Hippo 信號通路的上游因子，能夠誘導該通路的磷酸化影響腫瘤細胞的功能表型[5-8]。為進一步研究FAT4 對TNBC惡性生物學行為的影響，探討FAT4 在TNBC 中的作用機制。本研究通過細胞學模型檢測降低FAT4表達水平后TNBC 細胞系生物學行為（增殖與凋亡、遷徙與侵襲）的改變，并檢測細胞EMT 表型及通路下游蛋白YAP 的表達及磷酸化改變，初步探討其相關性與機理，旨在為FAT4 調節(jié)TNBC 增殖與凋亡、侵襲與轉移的機制提供進一步的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

人正常乳腺上皮細胞系MCF-10A 及TNBC 細胞系BT-549、MDA-MB-231、MDA-MB-468、MDA-MB-436 均購于中國科學院細胞總庫；川北醫(yī)學院分子免疫研究所提供轉染所需大腸桿菌DH5α 菌；慢病毒載體介導的FAT4 沉默體系及對照，由上海吉凱基因化學技術有限公司負責構建及包裝。

1.2 主要儀器設備

細胞培養(yǎng)箱：德國HERAEUS 公司；冷凍離心機：美國THERMO 公司；-80 ℃冰箱：英國ABCAM公司；流式細胞儀：美國BD 公司；PCR 儀：美國BIO-RAD 公司；超純水器：中國四川卓越水處理設備有限公司；普通顯微鏡：日本OLYMPUS 公司。

1.3 主要實驗試劑

胎牛血清：美國GIBCO 公司；RPMI-1640 培養(yǎng)基/胰蛋白酶：美國HYCLONE 公司；青/鏈霉素：美國 INVITROGEN 公司； shRNA-FAT4/shRNANegative Control：中國上海吉凱基因化學技術有限公司；DEPC：美國SIGMA 公司；CHAPS：美國AMRESCO 公司；Western blot 電泳液/轉膜液/洗滌液：中國碧天云公司；Annexin V-FITC/PI 試劑盒：中國凱基生物公司；CCK-8 試劑盒：中國凱基生物公司；Transwell 試劑盒：美國MILLIPORE 公司；抗FAT4 抗體（Western blot）/抗β-actin 多克隆抗體/抗GAPDH 抗體：英國ABCAM 公司。

1.4 實驗方法

1.4.1 細胞培養(yǎng) 將RPMI-1640 培養(yǎng)液中加入10%胎牛血清、1×105IU/L 鏈霉素、1×105IU/L 青霉素，制成培養(yǎng)液。正常人乳腺細胞株MCF-10A 及TNBC細 胞 株 BT-549、 MDA-MB-231、 MDA-MB-468、MDA-MB-436 在恒溫細胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)（37 ℃，5%CO2）。

1.4.2 檢測FAT4 在TNBC 細胞株中的表達水平 按照GIBCO 公司RNA 提取試劑盒操作說明提取細胞總RNA；BIO-RAD 公司蛋白質提取試劑盒操作說明書提取總蛋白；qRT-PCR 技術及Western blot 技術檢測各細胞系中FAT4 的mRNA 及蛋白質的相對表達量。

1.4.3 構建及鑒定FAT4 低表達細胞系 FAT4-

shRNA 干擾序列（FAT4-shRNA1/2/3） 及陰性對照序列由上海吉凱基因化學有限公司設計合成。選擇pGPU6/GFP/Neo 質粒作為載體包裝shRNA，通過轉染感受態(tài)大腸桿菌擴增質粒。293T 細胞接種到6 孔板進行轉染實驗。BT-549、MDA-MB-436 細胞系進行感染，提取細胞總RNA；qRT-PCR 檢測各組細胞FAT4 mRNA 的相對表達情況；提取細胞總蛋白；Western blot 檢測各組細胞FAT4 蛋白的相對表達情況（一抗：抗FAT4 抗體，1∶1 000，ab130076，Abcam；二抗：堿性磷酸酶標記羊抗兔IgG，1∶2 000，A0239，碧天云）。篩選出最有效的干擾片段進行后續(xù)實驗，將TNBC 分別轉染FAT4-shRNA （FAT4敲低組）和陰性對照序列（陰性對照組），以未轉染的TNBC 作為空白對照組。

1.4.4 細胞增殖實驗（CCK-8 實驗） 將2×103/孔的細胞懸液加入96 孔板培養(yǎng)；將培養(yǎng)板分別培養(yǎng)細胞24、48、72 h 后每孔加入CCK8 試劑10 μL；孵育1 h（37 ℃，5%CO2）；根據(jù)酶標儀測定吸光值分析細胞生長情況。

1.4.5 細胞凋亡實驗 取轉染72 h 后細胞，無血清培養(yǎng)基饑餓8 h，吸取500 μL 結合緩沖液重懸細胞后加入5 μL Annexin V-FITC 和5 μL PI；設置流式細胞儀工作程序（激發(fā)波長Ex=488 nm；發(fā)射波長Em=530 nm）；Annexin V-FITC 的綠色熒光通過FITC通道（FL1）檢測；PI 紅色熒光通過PI 通道（FL3）檢測，F(xiàn)lowjo v10 軟件進行數(shù)據(jù)的統(tǒng)計與分析。

1.4.6 細胞遷徙實驗 將小室放入24 孔板，在上室加入基質膠，將小室的下室面均勻涂抹纖維蛋白（10 mg/L），更換無血清培養(yǎng)基讓細胞饑餓培養(yǎng)8 h；在Transwell 小室的上層小室中加入200 μL 細胞懸液，下層小室加入含10%的胎牛血清RPMI-1640 培養(yǎng)基；37℃培養(yǎng)箱孵育4 h；4%多聚甲醛固定，0.1%結晶紫染色微孔膜下面細胞；顯微鏡下選取3 個視野計數(shù)（200×），重復3 次取平均值。

1.4.7 Western blot 實驗 按比例制備SDS-PAGE 膠，50 μg 蛋白樣品加入上樣孔槽中，轉膜，TBST 液將PVDF 膜浸泡，平衡，封閉，一抗孵育（一抗：抗E-cadherin 抗體，1∶2 000，ab133597，Abcam；抗N-cadherin 抗體，1∶2 000，ab76057，Abcam），二抗孵育（堿性磷酸酶標記羊抗兔IgG，1∶2 000，A0239，碧天云），PVDF 膜置于暗室，用BICP/NBT phosphatase Substrate （KPL，美國） 避光顯色；掃描并保存圖像。

1.5 統(tǒng)計學處理

實驗中涉及的所有需要進行統(tǒng)計學處理的實驗數(shù)據(jù)，均采用SPSS 26.0 for Windows 統(tǒng)計軟件進行分析，部分圖片由GraphPad Prism 9 輸出。計量資料用均數(shù)±標準差（±s）表示，組間比較用方差分析，P＜0.05 為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結果

2.1 FAT4在TNBC細胞系中的表達

以正常乳腺上皮細胞系MCF-10A 中FAT4 mRNA 表達量為參照，4 種TNBC 細胞系中FAT4 mRNA 相對表達量分別為BT-549：0.7012±0.044、MDA-MB-231：0.2899±0.035、MDA-MB-468：0.346±0.065、MDA-MB-436：0.5484±0.028，F(xiàn)AT4 mRNA 在各組細胞中表達有明顯差異（F=169.842，P=0.000）；相對于正常細胞系MCF-10A，各組的相對表達水平降低（均P＜0.05）。在4 種TNBC 細胞系中，BT-549 和MDA-MB-436 細胞系中相對表達量較高（圖1A）。以MCF-10A 中FAT4 蛋白表達量為參照，TNBC 細胞系中FAT4 蛋白相對表達量分別為BT-549： 0.7225±0.071、 MDA-MB-231： 0.4225±0.039、MDA-MB-468：0.4194±0.056、MDA-MB-436：0.6975±0.063；FAT4 蛋白在各組細胞中表達有明顯差異（F=96.707，P=0.000）；相對于正常細胞系MCF-10A，各組的相對表達水平降低（均P＜0.05）。在4 種TNBC 細胞系中，BT-549 和MDA-MB-436 細胞系中相對表達量較高（圖1B）。遂選取BT-549 和MDA-MB-436 細胞系進行后續(xù)實驗。

圖1 FAT4 mRNA及蛋白在各細胞系中的表達A：qRT-PCR檢測FAT4 mRNA相對表達量；B：Western blot檢測FAT4蛋白相對表達量Figure 1 Expressions of FAT4 mRNA and protein in cells of each cell lineA:Relative expression levels of FAT4 mRNA determined by qRT-PCR;B:Relative expression levels of FAT4 protein determined by Western blot

2.2 下調FAT4 表達對TNBC 細胞系的增殖能力的影響

在BT-549 細胞系中，轉染24、48、72 h 各組細胞OD 值：空白對照組分別為0.322±0.032、0.467±0.042、0.563±0.063；陰性對照組分別為0.341±0.043、0.493±0.053、0.586±0.084；FAT4 敲低組分別為0.492±0.053、0.675±0.084、0.782±0.065。3 個時間點各組間OD 值差異均有統(tǒng)計學意義（F=22.38，P=0.000；F=16.538，P=0.000；F=14.294，P=0.001）；其中，F(xiàn)AT4 敲低組在3 個時間的OD 值均明顯高于空白對照組與陰性對照（均P＜0.05），而后兩組在3 個時間點的OD 值差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。在MDA-MB-436 細胞系中，24、48、72 h 各組細胞OD 值：空白對照組分別為0.333±0.076、0.396±0.086、0.505±0.048；陰性對照組分別為0.374±0.042、0.432±0.046、0.532±0.104；FAT4 敲低組分別為0.457±0.046、0.556±0.093、0.798±0.096。3 個時間點各組間OD 值差異均有統(tǒng)計學意義（F=6.308，P=0.013；F=5.801，P=0.017；F=5.801，P=0.017）。其中，F(xiàn)AT4 敲低組在3 個時間的OD 值均明顯高于空白對照組與陰性對照（均P＜0.05），而后兩組在3 個時間點的OD 值差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）（圖2）。

圖2 下調FAT4對BT-549和MDA-MB-436細胞系的增殖能力的影響Figure 2 Effect of down-regulation of FAT4 on the proliferation of BT-549 and MDA-MB-436 cell lines

2.3 下調FAT4表達對TNBC細胞系凋亡的影響

流式細胞儀檢測結果顯示，在BT-549 細胞中的凋亡率分別為：空白對照組（15.16±0.62）%、陰性對照組（17.24±0.27）% 、 FAT4 敲低組（7.0±0.94）%，F(xiàn)AT4 敲低組的凋亡率明顯低于空白對照組與陰性對照組（均P＜0.05），而后兩組的細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；在MDAMB-436 細胞中的凋亡率分別為：空白對照組（18.31±0.55）%、陰性對照組（20.27±0.47）%、FAT4 敲低組（8.90±0.48）%，F(xiàn)AT4 敲低組的凋亡率明顯低于空白對照組與陰性對照組（均P＜0.05），而后兩組的細胞凋亡率差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖3）。

圖3 下調FAT4對BT-549和MDA-MB-436細胞系凋亡的影響Figure 3 Effect of down-regulation of FAT4 on apoptosis of BT-549 and MDA-MB-436 cell lines

2.4 下調FAT4 對TNBC 細胞系遷移和侵襲能力的影響

Transwell 小室實驗結果發(fā)現(xiàn)，降低FAT4 表達水平后，在BT-549 細胞系中，各組穿室細胞數(shù)分別為：空白對照組（39±6） 個、陰性對照組（44±5） 個、FAT4 敲低組（59±10） 個，各組間差異有統(tǒng)計學意義（F=9.617，P=0.003）。其中，F(xiàn)AT4 敲低組的穿室細胞數(shù)明顯多于空白對照組與陰性對照組（均P＜0.05），而后兩組的穿室細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）。在MDA-MB-436 細胞系中，各組穿室細胞數(shù)分別為：空白對照組（36±7）個、陰性對照組（42±9）個、FAT4 敲低組（62±9） 個，各組間差異有統(tǒng)計學意義（F=13.942，P=0.001）。其中，F(xiàn)AT4 敲低組的穿室細胞數(shù)明顯多于空白對照組與陰性對照組（均P＜0.05），而后兩組的穿室細胞數(shù)差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）（圖4）。

圖4 下調FAT4對BT-549和MDA-MB-436細胞系遷移和侵襲能力的影響Figure 4 Effect of down-regulation of FAT4 on migration/invasion abilities of BT-549 and MDA-MB-436 cell lines

2.5 下調FAT4 表達水平對TNBC 細胞系Hippo 信號通路的影響

在BT-549 細胞系中，以空白對照組為參照，陰性對照組、FAT4 敲低組中YAP 蛋白相對表達量為0.954±0.062、 0.942±0.04； 磷酸化YAP （p-YAP） 蛋白相對表達量為0.963±0.079、0.263±0.088； E-cadherin 相對表達量為0.972±0.025、0.234±0.032； N-cadherin 相對表達量為0.982±0.044、1.796±0.092。各組間YAP 蛋白表達無明顯差異（F=2.636，P=0.112 5）；各組間p-YAP 蛋白表達有明顯差異（F=143.537，P=0.000）， 其中，F(xiàn)AT4 敲低組p-YAP 蛋白表達量明顯低于陰性對照組與空白對照組（均P＜0.05），而后兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）； 各組間E-cadherin 與N-cadherin 表達量均有明顯差異（F=394.452，P=0.000；F=212.208，P=0.000），其中，F(xiàn)AT4 敲低組的E-cadherin 表達量較陰性對照組與空白對照組明顯降低，而N-cadherin 表達量較陰性對照組與空白對照組明顯升高（均P＜0.05），而陰性對照組與空白對照組間E-cadherin 與N-cadherin 表達量差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）。在MDA-MB-436 細胞系中，以空白對照組為參照，陰性對照組、FAT4 敲低組中YAP 蛋白相對表達量為0.961±0.035、0.972±0.029；p-YAP 蛋白相對表達量為0.964±0.031、 0.275±0.032； E-cadherin 相對表達量為0.948±0.046、0.194±0.056；N-cadherin 相對表達量為0.963±0.049、2.181±0.193。各組間YAP 蛋白表達無明顯差異（F=2.397，P=0.133）；各組間p-YAP蛋白表達有明顯差異（F=400.352，P=0.000），其中，F(xiàn)AT4 敲低組p-YAP 蛋白表達量明顯低于陰性對照組與空白對照組（均P＜0.05），而后兩組間差異無統(tǒng)計學意義（P＞0.05）；各組間E-cadherin 與Ncadherin 表達量均有明顯差異（F=390.204，P=0.000；F=160.888，P=0.000），其中，F(xiàn)AT4 敲低組的E-cadherin 表達量較陰性對照組與空白對照組明顯降低，而N-cadherin 表達量較陰性對照組與空白對照組明顯升高（均P＜0.05），而陰性對照組與空白對照組間E-cadherin 與N-cadherin 表達量差異均無統(tǒng)計學意義（均P＞0.05）（圖5）。

圖5 下調FAT4對TNBC細胞系Hippo信號通路和EMT表型的影響Figure 5 Effect of down-regulation of FAT4 on Hippo signaling pathway and EMT phenotype in TNBC cell lines

3 討論

TNBC 作為一種惡性程度極高的乳腺癌亞型，受到科研與臨床的高度重視[9-11]。盡管國際上開展了大量的針對性臨床試驗，但其治療現(xiàn)狀一直未得到較好的改善[9,12-13]。目前迫切需要尋找有效診斷TNBC 的特異性治療靶點，臨床策略提供新徑。

本研究篩選了FAT4 相對穩(wěn)定高表達的TNBC細胞系BT-549 和MDA-MB-436 進行細胞功能驗證實驗。CCK-8 實驗發(fā)現(xiàn)降低FAT4 表達后，BT-549 和MDA-MB-436 細胞系的增殖能力顯著加強。細胞的增殖能力作為腫瘤細胞的一個特異性標志，與腫瘤的惡性程度直接相關[14-15]。Ragni 等[16]通過對小鼠心肌細胞的體內模型研究發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)AT4 可能通過Hippo 通路調節(jié)下游YAP 核轉位促進心肌細胞的增殖能力，F(xiàn)AT4 突變的小鼠因FAT4 低表達導致心肌細胞增殖能力增加而心肌更肥厚。細胞凋亡是一個嚴格調控的生物學過程，在參與組織重塑、維持組織穩(wěn)態(tài)平衡和促進損傷修復中起著重要作用[17]。凋亡的調節(jié)失衡可能與惡性腫瘤的發(fā)生有著極為緊密的聯(lián)系[18-19]。Ma 等[20]通過流式細胞儀檢測發(fā)現(xiàn)降低FAT4 表達能夠減弱胃癌細胞的凋亡能力。本研究通過流式細胞術發(fā)現(xiàn)，降低FAT4 表達能夠抑制細胞的凋亡能力，促進腫瘤細胞的惡性發(fā)展。Transwell 小室實驗顯示，F(xiàn)AT4 低表達后細胞侵襲轉移能力顯著加強，說明在TNBC 的惡性生物學進程上，F(xiàn)AT4 起到了重要的調節(jié)作用。Ma等[20]通過細胞學模型也發(fā)現(xiàn)FAT4 低表達后胃癌細胞侵襲轉移能力增強，可能與細胞上皮間質轉化有關，而上皮間質轉換的表達能直接引起細胞侵襲轉移能力的增強。

Western blot 檢測上皮細胞和間充質細胞表面標志物的變化，結果發(fā)現(xiàn)FAT4 敲低組中TNBC 細胞的上皮細胞表面分子E-cadherin 表達顯著降低，間質細胞表面分子N-cadherin 表達顯著增高。說明FAT4 的低表達在一定程度上促進了EMT 的生物學進程。而EMT 作為一個特殊生理環(huán)境下的生物學狀態(tài)，在許多腫瘤的遠處轉移中均被實驗證明EMT 的存在[21-25]。能夠引起EMT 表型的變化，無疑是FAT4 影響TNBC 細胞侵襲與轉移最直接的證據(jù)。Zhou 等[26]建立小鼠轉移性乳腺癌模型，通過對原發(fā)腫瘤、循環(huán)血液和轉移灶中的腫瘤細胞進行提取分析，結果顯示乳腺癌轉移的病理生理過程是由癌細胞的動態(tài)EMT 所介導的，阻斷EMT 可能成為防治乳腺癌轉移的新策略。Cai 等[27]發(fā)現(xiàn)敲除FAT4 后胃癌細胞增殖和轉移能力增強，且FAT4 通過對Wnt/β-catenin 信號通路調控來抑制腫瘤的EMT。FAT4 在TNBC 中也很可能參與EMT 的誘導發(fā)生，但目前相關具體機制與報道甚少。

FAT4 在Hippo 信號通路中發(fā)揮上游促發(fā)因子的作用，該通路的作用靶點主要是下游蛋白YAP，Hippo 通路的激活能夠引起YAP 蛋白的第127 位絲氨酸殘基磷酸化，使YAP 與14-3-3 蛋白結合停留在細胞質；而阻斷該通路可降低YAP 磷酸化水平，未磷酸化的YAP 能夠順利進入細胞核與轉錄因子TEAD 結合，誘導細胞增殖與腫瘤產生[21-22,28-30]。因此YAP 的磷酸化對能夠降低細胞增殖、遷移的能力。該結果表明，F(xiàn)AT4 的表達水平與下游YAP 的表達水平沒有顯著的相關性，但是YAP 的磷酸化水平卻顯著降低，說明FAT4 影響下游靶點YAP 的磷酸化水平，可能通過該信號通路，調控TNBC 細胞生物學行為的變化。Li 等[31]在鼻咽癌順鉑耐藥細胞中發(fā)現(xiàn)了EMT 特性加強，細胞增殖和遷徙能力增強，而通過消耗Hippo 信號通路下游逆轉EMT 表型，且恢復耐藥細胞的治療敏感性。但是Hippo 信號通路在TNBC 中的研究目前報道較少，該通路的驗證，能為TNBC 的基礎研究拓展思路，為后期臨床轉歸和甚至藥物靶點設計指明了方向。

本研究發(fā)現(xiàn)，降低FAT4 表達水平后TNBC 細胞系BT-549 和MDA-MB-436 細胞增殖能力增強、凋亡能力減弱、侵襲遷移能力增強。FAT4 可能通過Hippo 信號通路誘導TNBC 細胞EMT 的發(fā)生，影響腫瘤細胞侵襲遷移能力。說明FAT4 可能對TNBC發(fā)生發(fā)展有重要影響，有可能成為早期診斷和治療的候選基因。