基于線粒體COI基因分析廣州市15個白紋伊蚊種群的遺傳多樣性

鄭梓豪，吳珊珊，魏 勇，鐘代斌，鄭學(xué)禮

白紋伊蚊(Aedesalbopictus)是登革病毒、寨卡病毒的主要傳播媒介[1]。廣州市的首個登革熱病例報(bào)告于1978年，之后廣州市登革熱疫情就不斷出現(xiàn)，在2014年出現(xiàn)了有記錄以來最嚴(yán)重的登革熱疫情的暴發(fā)[2]。而目前針對登革熱流行的預(yù)防方法主要是對攜帶登革病毒的白紋伊蚊通過使用化學(xué)殺蟲劑進(jìn)行消殺[3-5]。細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ(COI)基因在線粒體內(nèi)，其為母系遺傳且遺傳進(jìn)化速率較核DNA快，比核DNA更易受遺傳漂變的影響，利用線粒體DNA多態(tài)性分析不僅可以在一定層面上了解種群的遺傳多樣性，還可以探討形成特定遺傳結(jié)構(gòu)的歷史原因和地理原因，使其成為研究分子進(jìn)化遺傳常用分子標(biāo)記物，并能運(yùn)用于建立物種鑒定的DNA條形碼系統(tǒng)的研究，目前已被廣泛應(yīng)用于昆蟲的系統(tǒng)進(jìn)化和種內(nèi)遺傳分化的分析[6-9]。蔡燕麗等利用COI基因及SSCP技術(shù)分析了廣州市13個區(qū)域的白紋伊蚊遺傳多態(tài)性[10]。郭玉燕等利用COI基因分析了我國部分地區(qū)的白紋伊蚊遺傳多態(tài)性[11]。張瑞玲等報(bào)告了不同地理種群白紋伊蚊線粒體基因COI的遺傳多樣性分析[12]。游麗斌等報(bào)告福建省白紋伊蚊 mtDNA-COI基因的系統(tǒng)發(fā)育分析[13]。我們在上述文獻(xiàn)報(bào)道的基礎(chǔ)上，開展本項(xiàng)研究，分析白紋伊蚊的系統(tǒng)進(jìn)化和種內(nèi)遺傳分化，是這項(xiàng)研究的新穎之處。

本文通過采用更大的樣本量來分析廣州市不同白紋伊蚊種群的線粒體的細(xì)胞色素c氧化酶亞基Ⅰ基因(COI)片段的遺傳結(jié)構(gòu)，從白紋伊蚊的COI基因多樣性，為昆蟲的系統(tǒng)進(jìn)化和種內(nèi)遺傳分化”的理論的提升方面，提供科學(xué)參考資料。

1 方 法

1.1 白紋伊蚊的采樣 本實(shí)驗(yàn)只采集白紋伊蚊樣本，采集時(shí)間為2020年9月至2020年11月，采樣點(diǎn)選取是基于廣州市的行政區(qū)，行政街道的劃分，白紋伊蚊的孳生習(xí)性，棲息習(xí)性見圖1。成蚊采用人誘法，幼蟲采用幼蟲吸管法，并將幼蟲帶回實(shí)驗(yàn)室飼養(yǎng)至成蚊。形態(tài)學(xué)鑒定方法參考陸寶麟和吳永厚編著的《中國重要醫(yī)學(xué)昆蟲分類與鑒別》[14]。經(jīng)鑒定為白紋伊蚊的成蚊，在-20 ℃凍死后浸泡在無水乙醇中-80 ℃保存。

圖1 廣州市白紋伊蚊種群采樣地點(diǎn)分布圖Fig.1 Distribution of sampling sites of Ae. albopictus population in Guangzhou

1.2 基因組DNA的提取 采用DNA提取試劑盒(Omega，Insect DNA kit)提取單只成蚊的基因組DNA，-80 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.3 白紋伊蚊線粒體COI基因片段的擴(kuò)增和測序 擴(kuò)增COI基因片段的引物參考Folmer[15]等人使用的通用引物，正向引物(5′-GGTCAACAAATCATAAAGATATTGG-3′)，反向引物(5′-TGATTTTTTGGTCACCCTG AAGTTTA-3′)。PCR反應(yīng)擴(kuò)增體系為25 μL，其中Premix Taq(Takara公司)12.5 μL，正向引物(10 μmol/L)1 μL，反向引物(10 μmol/L)1 μL，模板DNA 2 μL,滅菌ddH2O 8.5 μL。PCR反應(yīng)條件：94 ℃ 1 min；94 ℃ 40 s，45 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，5個循環(huán)；94 ℃ 40 s，53 ℃ 40 s，72 ℃ 1 min，30個循環(huán)。72 ℃ 7 min。4 ℃保存。用0.5%TBE電泳緩沖液，取PCR產(chǎn)物3～5 μL， 1.2%瓊脂糖凝膠(含有0.5 μg/mL溴化乙錠染料)中電泳，150 V電壓30 min后，紫外燈下觀察是否有目的條帶。出現(xiàn)目標(biāo)條帶的樣本送北京擎科新業(yè)生物技術(shù)有限公司用反向引物測序。

1.4 線粒體COI基因片段分析 將序列在NCBI上的GenBank經(jīng)過BLAST比對，與白紋伊蚊線粒體COI基因(KX266719.1)匹配度在99%以上的確認(rèn)為白紋伊蚊(分子生物學(xué)鑒定)。用BioEdit 7.2.軟件觀察序列峰圖，用MEGA X[16]基于MUSCLE算法比對序列，使目標(biāo)序列等長并截去兩端測序不準(zhǔn)確部分，并統(tǒng)計(jì)序列的堿基組成。線粒體COI基因片段的位點(diǎn)多態(tài)性和DNA多態(tài)性分析，錯配分布分析使用DNAsp 6.12[17]軟件進(jìn)行操作。分子變異分析，各種群間的固定系數(shù)(Fst)和基因流(Nm)的計(jì)算，Mantel檢驗(yàn)，中性檢驗(yàn)使用Arlequin 3.5軟件[18]。系統(tǒng)發(fā)育信號檢測使用DAMBE 7.2[19]軟件進(jìn)行操作。如果序列未飽和，說明適合系統(tǒng)發(fā)育分析，則使用MEGA X軟件構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹，統(tǒng)計(jì)方法采用鄰接法(Neighbor-Joining)[20]，Bootstrap值設(shè)置為1 000，替換模型使用Kimura 2-parameter雙參數(shù)法[21]，空位處理使用成對刪除(Pairwise deletion)，其余選項(xiàng)默認(rèn)。構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹時(shí)從GenBank中獲得了一株埃及伊蚊的序列(外群)和多個不同地理株的白紋伊蚊序列，序列號分別是：NC_035159.1(埃及伊蚊)、KF406541.1(巴基斯坦)、AB738203.1(日本)、MF148287.1(馬來西亞1)、MF148279.1(馬來西亞2)、JQ235749.1(云南)、KP843400.1(泰國)、GQ143719.1(澳大利亞)。單倍型網(wǎng)絡(luò)圖使用PopART[22]繪制，適用于分析種內(nèi)數(shù)據(jù)的Median joining network[23]方法。

2 結(jié) 果

2.1 蚊蟲樣本采集結(jié)果 經(jīng)過了形態(tài)學(xué)鑒定和分子生物學(xué)鑒定，并刪去部分峰圖質(zhì)量不佳的樣本序列后，最終確定了642只白紋伊蚊用于本次實(shí)驗(yàn)。采樣地點(diǎn)見圖1和表1。白云區(qū)包括南方醫(yī)科大學(xué)(SMU)和松南閣(SNG)兩個白紋伊蚊種群，海珠區(qū)包括南洲花苑(NZHY)和素社(SS)兩個白紋伊蚊種群，荔灣區(qū)包括東漖(DJ)、廣州醫(yī)科大學(xué)附屬第三醫(yī)院(GY)、鶴翔(HX)3個白紋伊蚊種群，天河區(qū)(天河山莊，TH)、越秀區(qū)(盤福社區(qū)，YX)、從化區(qū)(從化區(qū)第七中學(xué)，CH)、番禺區(qū)(小平村，PY)、花都區(qū)(東鏡村，HD)、黃埔區(qū)(新田村，HP)、南沙區(qū)(潭洲公園，NS)、增城區(qū)(南崗村，ZC)各只有1個白紋伊蚊種群。

表1 廣州市15個白紋伊蚊種群采樣點(diǎn)詳細(xì)信息Tab.1 Information about sampling sites among 15 Ae. albopictus populations in Guangzhou

2.2 線粒體COI基因堿基組成分析 廣州市15個種群一共642條核苷酸序列，長度603 bp。A、T、C、G四種堿基組成統(tǒng)計(jì)結(jié)果顯示(表2)：第1位和第2位堿基A加T的比例比G加C的比例稍高，第3位堿基的A和T的含量遠(yuǎn)比G和C的高，A加T的總含量比例更是高達(dá)89.6%。4種堿基的平均含量分別為A(28.7%)、T(38.8%)、C(16.9%)、G(15.6%)，A堿基和T堿基的平均含量是67.5%，G堿基和C堿基的平均含量是32.5%，表明存在AT偏向性，符合線粒體DNA的特性。根據(jù)AT偏斜值公式：(A-T)/(A+T)和GC偏斜值公式：(G-C)/(G+C)，得出廣州市白紋伊蚊種群的AT偏斜值為：-0.150，GC偏斜值為-0.04。對所有序列基于K2P計(jì)算種內(nèi)距離，發(fā)現(xiàn)其范圍在0～0.67%，平均為：0.12%。不同采樣點(diǎn)之間的白紋伊蚊種群的種內(nèi)距離范圍在0.05%(HX、PY)～0.16%(NZHY、ZC)。

表2 廣州市15個白紋伊蚊種群線粒體COI基因核苷酸組成Tab.2 Nucleotide composition of mitochondrial COI gene in 15 Ae. albopictus populations in Guangzhou

2.3 線粒體COI基因序列特征 位點(diǎn)多態(tài)性分析結(jié)果顯示：603個位點(diǎn)中保守位點(diǎn)有564個，變異位點(diǎn)有39個(共有40種突變類型)，單態(tài)位點(diǎn)有15個，簡約信息位點(diǎn)有24個，無插入和缺失，37處出現(xiàn)轉(zhuǎn)換，3處出現(xiàn)顛換，轉(zhuǎn)換/顛換比為7.9，轉(zhuǎn)換遠(yuǎn)比顛換多。

DNA多樣性指數(shù)(表3)分別為：廣州市整體的白紋伊蚊種群的單倍型多樣性(Haplotype diversity，Hd)是0.499，核苷酸多樣性(Nucleotide diversity，Pi)是0.001 08，平均核苷酸差異數(shù)(Average number of nucleotide difference，k)是0.653。各白紋伊蚊種群單倍型分析如下：單倍型多樣性在0.236(HX)～0.725(DJ)，核苷酸多樣性在0.000 40(HX)～0.001 54(DJ)。平均核苷酸差異數(shù)在0.243(HX)～0.931(DJ)。DNA多態(tài)性分析結(jié)果(表4)顯示：642條序列共檢出單倍型有45個。其中特有單倍型有33個，共享單倍型有12個，共享單倍型占所有單倍型的26.7%。種群中包含10個個體以上的單倍型有5種，分別是Hap-1(450)、Hap-3(20)、Hap-4(57)、Hap-10(16)、Hap-15(13)，其中Hap-1為所有種群共享,Hap-3、Hap-4為部分種群共享。

表3 廣州市15個白紋伊蚊種群線粒體COI基因遺傳多樣性Tab.3 Genetic diversity of mitochondrial COI gene of 15 Ae. albopictus populations in Guangzhou

表4 廣州市15個白紋伊蚊種群線粒體COI基因單倍型分布及頻率Tab.4 Distribution and frequency of mitochondrial COI gene haplotypes in 15 Ae. albopictus populations in Guangzhou

2.4 15個地理種群的遺傳結(jié)構(gòu) 分子變異分析(Analysis of molecular variance, AMOVA)結(jié)果表明：15個種群間COⅠ基因的遺傳差異占4.09%，而種群內(nèi)部的差異占95.91%。固定系數(shù)(Fixation Index，F(xiàn)st)的值為0.040 9，P<0.01，認(rèn)為廣州市不同種群之間的白紋伊蚊的遺傳差異主要來自種群個體內(nèi)部，而各個種群之間的白紋伊蚊種群則沒有表現(xiàn)出大的差異性。兩兩種群間的固定系數(shù)Fst(表5)在-0.02～0.13之間，SS和HP種群間的Fst值最小，PY/HD和SNG種群間的Fst值最大。除去部分Nm值為負(fù)值外，所有地點(diǎn)兩兩配對的Nm值都大于1，而且還有部分地點(diǎn)的兩兩配對的Nm值大于10，說明廣州市11個行政區(qū)的的白紋伊蚊都有不同程度的基因交流。

表5 廣州市白紋伊蚊種群之間的固定系數(shù)(Fst)統(tǒng)計(jì)值(左下部分)和基因流(Nm)統(tǒng)計(jì)值(右上部分)Tab.5 Statistic of fixation(Fst, bottom left) and Gene flow(Nm, top right) of Ae. Albopictus population in Guangzhou

Mantel檢驗(yàn)的回歸系數(shù)為0.000 127，相關(guān)系數(shù)為0.072 0，P值為0.354。不能認(rèn)為地理距離和遺傳距離(Fst)這兩者存在相關(guān)性，即廣州市15個白紋伊蚊種群不存在地理隔離現(xiàn)象。

中性檢驗(yàn)(表6)顯示所有種群的兩種檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)值都為負(fù)值。Tajima’sD檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)值的P值

表6 廣州市白紋伊蚊種群中性檢驗(yàn)Tab.6 Neutral test of Ae. albopictus population in Guangzhou

小于0.05的種群有7個，分別是：SMU、SS、TH、YX、HP、NS、ZC，表明廣州市部分白紋伊蚊種群不符合中性理論；Fu’sFS檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)值的P值小于0.05的種群有12個，分別是：SMU、NZHY、SS、DJ、GY、HX、TH、YX、PY、HP、NS、ZC，表明了廣州市的大部分種群(12/15)都在歷史上發(fā)生過擴(kuò)張。

如果錯配分布(Mismatch distribution)的實(shí)際觀察結(jié)果與期望值的某個假定模型(恒定或收縮)相吻合，則說明群體狀態(tài)與期望的假定模型一致，反之，則說明背離期望值的假定模型，群體處于擴(kuò)張狀態(tài)(曲線為單峰)。在圖2中可見DJ、ZC種群的分布為單峰分布，與期望的分布不一致，認(rèn)為這些種群經(jīng)歷過擴(kuò)張，SMU、NZHY、GY種群的分布在圖形中有小凸起，結(jié)合中性檢驗(yàn)的結(jié)果來看，可能是曾經(jīng)經(jīng)歷過種群擴(kuò)張，其余種群的分布與期望分布基本一致，認(rèn)為這些種群的發(fā)展較平穩(wěn)。

圖2 廣州市白紋伊蚊線粒體COI基因的錯配分布Fig.2 Mismatch distribution of mitochondrial COI gene of Ae. albopictus in Guangzhou

2.5 廣州市白紋伊蚊單倍型的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系 DAMBE的序列飽和度分析會給出Iss和Iss.C兩個統(tǒng)計(jì)值，當(dāng)Iss的統(tǒng)計(jì)值比Iss.C的統(tǒng)計(jì)值小，且具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的時(shí)候，可以認(rèn)為序列沒有達(dá)到飽和。結(jié)果為：Iss的值為0.001和0.002，Iss.C的值在0.716～0.804之間，P值小于0.01，表明序列沒有達(dá)到飽和，可以用來建立系統(tǒng)發(fā)育樹。各單倍型的聚類關(guān)系結(jié)果如圖3所示，埃及伊蚊與所有的單倍型分開，單倍型34、單倍型3獨(dú)自成為一支。單倍型16和單倍型17聚成為一個小支，接著其余單倍型則分成3個大支，其他地理種群的白紋伊蚊則分布在這3個大分支。巴基斯坦種群和單倍型21聚成一個小支，日本種群和單倍型15、單倍型5、單倍型22聚成一個小分支，云南種群和單倍型23聚成一個小支。

圖3 廣州市15個白紋伊蚊種群線粒體COI基因各單倍型間的聚類關(guān)系(NJ法)Fig.3 Clustering relationship among mitochondrial COI gene haplotypes of 15 Ae. albopictus populations in Guangzhou (NJ method)

在單倍型網(wǎng)絡(luò)(圖4)可見單倍型1(被全部15個種群所共享)為優(yōu)勢單倍型，基本所有的單倍型都以單倍型1為中心，說明單倍型1可能是祖先序列，其他單倍型則可能從單倍型1演化而來。而單倍型4，單倍型15也成為一個小中心。各單倍型之間只相差一個突變步驟，而單倍型1和單倍型37之間相差兩個突變步驟。

3 討 論

本次實(shí)驗(yàn)采樣點(diǎn)包括廣州市11個行政區(qū)，共15個白紋伊蚊種群。廣州市15個白紋伊蚊種群的單倍型多樣性在0.256～0.759之間，核苷酸多樣性在0.000 50～0.001 59之間，平均核苷酸差異數(shù)在0.289～1.003 6之間，其中核苷酸多樣性和廣州市2011年的白紋伊蚊樣品(0.000 6)相符合，略高于2017年福建省的白紋伊蚊樣品(0.001 26)，低于深圳市的白紋伊蚊樣品(0.016 7)[13]。

Mantel檢驗(yàn)的相關(guān)系數(shù)為0.033 4，但是沒有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。原因可能有：①基因流(Nm)的計(jì)算結(jié)果表明廣州市的白紋伊蚊種群存在較頻繁的基因交流；②分子變異分析表明種群間的遺傳距離很小。所以導(dǎo)致了遺傳距離和地理距離之間沒有相關(guān)性。

當(dāng)兩種中性檢驗(yàn)的統(tǒng)計(jì)值接近0時(shí)，說明種群處于穩(wěn)定階段，而統(tǒng)計(jì)值為負(fù)值并且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義的時(shí)候，認(rèn)為種群在歷史上有過擴(kuò)張跡象，Tajima’D更傾向于揭示古老種群發(fā)生擴(kuò)張的歷史，而Fu’sFS對近期種群的擴(kuò)張更為敏感[24]。當(dāng)Tajima’D檢驗(yàn)為負(fù)值且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，可認(rèn)為不符合中性理論，否則認(rèn)為符合中性理論，當(dāng)Fu’sFS檢驗(yàn)為負(fù)值且有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義時(shí)，認(rèn)為種群在近期經(jīng)歷過擴(kuò)張，否則認(rèn)為種群的發(fā)展平穩(wěn)[25]。

錯配分布(Mismatch distribution)是關(guān)于樣品中所有DNA序列之間成對差異數(shù)(Pairwise difference)的分布，而來自高度隔離的亞種群的合并樣本中的平均序列差異會增加。在長期處于種群平衡狀態(tài)的種群中，分布變得參差不齊，而不斷增長的種群則產(chǎn)生了平滑且具有峰值的錯配分布,高峰的位置反映了種群增長的時(shí)間[26]。錯配分布中并沒有太多的種群出現(xiàn)種群擴(kuò)張的跡象。出現(xiàn)種群擴(kuò)張跡象的部分種群的單峰也不明顯。張瑞玲等[12]有研究顯示：較高的單倍型多樣性和較低的核苷酸多樣性表明白紋伊蚊種群可能經(jīng)歷過“瓶頸效應(yīng)”，之后伴隨著種群快速擴(kuò)張的歷史事件，但由于擴(kuò)張歷史不長，核苷酸變異積累不充分。廣州市白紋伊蚊的單倍型多樣性遠(yuǎn)大于核苷酸多樣性，這說明廣州市的15個不同地點(diǎn)的白紋伊蚊種群可能經(jīng)歷過“瓶頸效應(yīng)”后發(fā)生了種群快速擴(kuò)張，但擴(kuò)張歷史不長，核苷酸變異積累不充分。

種群分化系數(shù)(Fst)，又叫固定系數(shù)(Fixation index)，表示種群之間的遺傳分化程度，范圍在0～1之間，值越大表明種群的分化程度越高。一般認(rèn)為Fst<0.05表明種群出現(xiàn)輕度分化，0.05

系統(tǒng)發(fā)育樹中各單倍型的聚類也沒有表現(xiàn)出明顯的地域特征，同樣提示各個行政區(qū)的白紋伊蚊種群遺傳差異小。白紋伊蚊雖然飛行距離有限，但是其蚊卵能夠耐受惡劣環(huán)境，通過便利的交通工具間

注：單倍型間連線上的每條短線代表一個突變步驟。圖4 基于Median joining network方法構(gòu)建的單倍型網(wǎng)絡(luò)圖Fig.4 Haplotype network diagram based on the medium joining network method

接地促進(jìn)了白紋伊蚊的擴(kuò)散[29]。同時(shí)也有研究表明白紋伊蚊是侵襲性很強(qiáng)的物種，甚至在白紋伊蚊能取代埃及伊蚊而成為優(yōu)勢種群[30-31]。同時(shí)由于廣州市重要的經(jīng)濟(jì)地位，使得廣州市的交通運(yùn)輸和經(jīng)濟(jì)貿(mào)易運(yùn)輸十分發(fā)達(dá)，同樣也可能會促進(jìn)白紋伊蚊的擴(kuò)散。

白紋伊蚊可攜帶并傳播多種蟲媒病毒，其作為一種侵襲性很強(qiáng)的物種，對人類的健康造成了不可忽視的影響。本研究通過對廣州市15個白紋伊蚊種群的COI基因進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)了廣州市的白紋伊蚊種群處于群體擴(kuò)張階段，頻繁的基因交流使得廣州市不同行政區(qū)之間的白紋伊蚊種群間分化水平不高，沒有發(fā)現(xiàn)任意兩兩白紋伊蚊種群出現(xiàn)高度分化的情況，大部分種群都屬于低度分化狀態(tài)，各個種群間的遺傳多樣性不高。這些使得不同地理種群的白紋伊蚊具有相似的媒介能力[12]。

利益沖突：無

引用本文格式：鄭梓豪，吳珊珊，魏勇，等.基于線粒體COI基因分析廣州市15個白紋伊蚊種群的遺傳多樣性[J].中國人獸共患病學(xué)報(bào)，2021，37(11)：985-994. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.141