張建民，占炳東，陳旭富，曹?chē)?guó)平，王雙青，呂 磊，楊瑞軍，葉承華

萊姆病是一種全球性的蜱媒傳染病，由經(jīng)蜱叮咬傳播的伯氏疏螺旋體(Borreliaburgdorferi)感染所致[1]。20世紀(jì)70年代該病在美國(guó)首次發(fā)現(xiàn)，1982年Burgdorfer 從蜱類(lèi)及感染患者的體內(nèi)分離出伯氏疏螺旋體[2]。

我國(guó)于1985年首次在黑龍江林區(qū)內(nèi)發(fā)現(xiàn)萊姆病患者，迄今全國(guó)各省/自治區(qū)/直轄市(含臺(tái)灣地區(qū))均有萊姆病病例報(bào)告[3]，同時(shí)也從可疑萊姆病病人血清中檢測(cè)出抗體陽(yáng)性[4]。衢州市目前尚無(wú)典型萊姆病病例報(bào)告，但有明確的血清抗體陽(yáng)性的疑似病例報(bào)道，人群中存在萊姆病感染[5]，并且衢州市有明確的蜱及蜱媒傳染病分布[6]報(bào)道。

為深入研究萊姆病螺旋體在我市鼠類(lèi)中的感染情況，間接評(píng)估萊姆病的感染風(fēng)險(xiǎn)，我們采集衢州市部分縣區(qū)的鼠類(lèi)標(biāo)本開(kāi)展萊姆病螺旋體核酸檢測(cè)。

1 材料與方法

1.1 材 料

1.1.1 標(biāo)本采集 2014-2017年，在柯城、開(kāi)化鄉(xiāng)鎮(zhèn)的農(nóng)田、山林處捕獲鼠類(lèi)，經(jīng)無(wú)菌解剖后，取鼠脾置于無(wú)菌凍存管中，于-80 ℃存放。

1.1.2 試劑 TIANGEN血液/組織/基因組DNA提取試劑盒(cat#DP304-03)；DreamTaqTMGreen PCR Master Mix (2X) 預(yù)混反應(yīng)體系(Thermo K1082)。

1.1.3 儀器 寧波新芝Scientz-48高通量組織破碎儀，Eppenderf5425高速離心機(jī), BIO-Rad擴(kuò)增儀，BIO-Rad HE-120en電泳儀,BIO-Rad Chemi DocTMXRS+凝膠成像系統(tǒng)。

1.1.4 巢式PCR擴(kuò)增引物靶序列 萊姆病螺旋體核糖體5s-23s基因間隔區(qū)(第1輪23s3/23sa，第2輪23s5/23s6)。見(jiàn)表1。

表1 引物序列Tab.1 Primer sequence

1.2 方 法

1.2.1 DNA提取 取鼠脾10 mg左右，采用組織破碎儀破碎后制成細(xì)胞懸液，按TIANGEN(cat#DP304-03)提取試劑盒說(shuō)明書(shū)對(duì)樣品進(jìn)行DNA提取。-40 ℃保存，備用。

1.2.2 巢式PCR檢測(cè) 采用30 μL 反應(yīng)體系，第1輪反應(yīng)體系:2×Mix 15 μL，上游引物(10.0 μmol/L) 0.8 μL， 下游引物(10.0 μmol/L)0.8 μL，模板3.0 μL，ddH2O 10.4 μL，總體積30.0 μL 體系。第2輪反應(yīng)體系: 2×Mix15 μL，上游引物(10.0 μmol/L) 0.8 μL， 下游引物(10.0 μmol/L) 0.8 μL，模板1.0 μL，ddH2O 12.4 μL，總體積30.0 μL 體系。反應(yīng)條件：第1輪PCR為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 35 s，35個(gè)循環(huán)后；72 ℃ 延伸10 min；然后降溫到4 ℃保存。第2輪PCR反應(yīng)為94 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 30 s，59 ℃ 30 s，72 ℃ 30 s，35個(gè)循環(huán)后；72 ℃ 延伸10 min；然后降溫到4 ℃保存。

1.2.3 PCR產(chǎn)物檢測(cè) 巢式PCR產(chǎn)物用1.2%瓊脂糖凝膠140 V電泳30～40 min，在凝膠成像儀成像拍照。陽(yáng)性片段為253 bp左右。

1.2.4 測(cè)序及序列分析 將PCR產(chǎn)物送生工生物上海有限公司測(cè)序，使用Lasergen軟件經(jīng)序列分析并在NCBI網(wǎng)站應(yīng)用Blast對(duì)序列進(jìn)行比對(duì)。與下載的同源性高且正式發(fā)表的序列用 MUSCLE(v3.8.31)軟件對(duì)提供的核酸序列進(jìn)行多重比對(duì)。將比對(duì)后的序列采用fastree(version 2.1.11)軟件中的 Maximum Likelihood 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分支的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證(bootstrap，1 000 replications)。

2 結(jié) 果

2.1 鼠類(lèi)分布 2014-2017年在柯城區(qū)、開(kāi)化縣兩個(gè)采集點(diǎn)共捕鼠378只，其中，黑線(xiàn)姬鼠127只、褐家鼠88只、黃胸鼠67只、社鼠49只、針毛鼠33只、臭鼩鼱5只、白腹巨鼠3只、黃鼩2只、青毛鼠2只、東方田鼠2只，分別占捕獲總數(shù)的33.59%、23.28%、17.72%、12.96%、8.73%、1.32%、0.79%、0.53%、0.53% 和0.53%。黑線(xiàn)姬鼠、褐家鼠和黃胸鼠為優(yōu)勢(shì)種，占總數(shù)的74.6%。

2.2 巢式PCR 對(duì)采集的378份鼠脾標(biāo)本用TIANGEN血液/組織/基因組DNA提取試劑盒提取DNA后，用23 s 3/23 s a和23 s 5/23 s 6兩組引物進(jìn)行兩輪PCR檢測(cè)。在59份標(biāo)本中獲得陽(yáng)性結(jié)果。不同年份、不同鼠種萊姆病核酸陽(yáng)性結(jié)果見(jiàn)表2、表3。

表2 2014-2017年萊姆病螺旋體核酸陽(yáng)性結(jié)果Tab.2 Positive nucleic acid results of Borrelia burgdorferi from 2014 to 2017

表3 不同鼠種萊姆病螺旋體核酸陽(yáng)性結(jié)果Tab.3 Positive nucleic acid results of Borrelia burgdorferi from different rodent species

2.3 測(cè)序結(jié)果和基因型 選取典型的37條序列分別通過(guò)NCBI 網(wǎng)站中的 blastn 軟件進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)它們與GenBank 中伯氏疏螺旋體菌株的 5S～23S rRNA基因間隔區(qū)序列具有高度同源性。在37份樣本擴(kuò)增序列中，有26份陽(yáng)樣本為Borreliagarinii(B.g)基因型；有8份陽(yáng)性樣本為Borreliavalaisiana(B.v)基因型；有3份陽(yáng)性樣本為Borreliaspielmanii(B.sp)基因型。其中，2014年柯城區(qū)采集的樣本全部為B.g基因型，2015年開(kāi)化縣采集的樣本有B.v基因型和B.g基因型，2016、2017年度開(kāi)化縣采集的樣本均為B.v基因型。不同年份、地點(diǎn)采集的樣本基因型見(jiàn)表4。

表4 不同年份地點(diǎn)萊姆病螺旋體基因型Tab.4 Genotypes of Borrelia burgdorferi in different years and locations

2.4 系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)重構(gòu) 對(duì)本次檢測(cè)陽(yáng)性樣本，選取37條典型的序列用 MUSCLE(v3.8.31)軟件進(jìn)行多重比對(duì)。將比對(duì)后的序列采用fastree(version 2.1.11)軟件中的 Maximum Likelihood 法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)，對(duì)系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)分支的可靠性進(jìn)行驗(yàn)證(bootstrap，1000 replications)，結(jié)果見(jiàn)圖1。

圖1 浙江省衢州地區(qū)鼠類(lèi)攜帶萊姆病螺旋體的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)Fig.1 Phylogenetic tree of Borrelia burgdorferi in rodents in Quzhou area, Zhejiang

3 討 論

萊姆病作為近年來(lái)新發(fā)的蜱媒傳染病，已成為全球公共衛(wèi)生問(wèn)題[7]。

萊姆病螺旋體的貯存宿主較多，鼠類(lèi)是其重要的貯存宿主之一。檢測(cè)鼠類(lèi)萊姆病螺旋體病原體伯氏疏螺旋體感染情況，對(duì)防控人萊姆病具有重要意義。目前為止，世界上所分離到的伯氏疏螺旋體菌株不斷增加，2009年報(bào)道有14個(gè)基因型[8]，目前已報(bào)道至少有22個(gè)基因型[3]，其中已確定對(duì)人有致病性的有4個(gè)基因型[9]Borreliaburgdorferisensustricto、Borreliagarinii、Borreliaafzelii及Borreliaspielmanill。而B(niǎo)orreliavalaisiana基因型萊姆病螺旋體的致病性也有不同的報(bào)道，部分研究認(rèn)為Borreliavalaisiana基因型萊姆病螺旋體也有致病性[10]。

本次采用巢式 PCR方法檢測(cè)萊姆病螺旋體，靈敏度、特異度均比較高[11-12]。378份鼠脾標(biāo)本萊姆病螺旋體核酸陽(yáng)性59份，陽(yáng)性率為15.61%，在對(duì)選取的37條序列通過(guò) blastn 軟件比對(duì)，發(fā)現(xiàn)衢州地區(qū)的萊姆病螺旋體有3個(gè)型別，其中Borreliagarinii型占70.3%，Borreliavalaisiana型占21.6%，Borreliaspielmanii型占8.1%。在不同年份、地點(diǎn)采集的鼠標(biāo)本中，萊姆病螺旋體的基因型各不相同，在2014年柯城區(qū)采集的樣本中檢出的均為Borreliagarinii型，2015-2017年開(kāi)化縣采集的樣本中檢出的為Borreliavalaisiana型和Borreliaspielmanii型。提示衢州地區(qū)的萊姆病螺旋體型別相對(duì)比較豐富，這也與衢州地區(qū)低山丘陵地形為主以及開(kāi)化縣打造國(guó)家公園，擁有大片的原始森林，森林覆蓋率達(dá)到80%以上有關(guān)，是一個(gè)天然的生物基因庫(kù)，宿主動(dòng)物和媒介生物種類(lèi)繁多,病原體的基因型與媒介、宿主之間的關(guān)系有待今后繼續(xù)探究。

隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，這些地區(qū)的外來(lái)人員增多，完全無(wú)免疫力的人員進(jìn)入，可能會(huì)對(duì)人群健康構(gòu)成威脅，應(yīng)引起高度重視。

利益沖突：無(wú)

引用本文格式：張建民，占炳東，陳旭富，等. 浙江省衢州地區(qū)鼠類(lèi)攜帶萊姆病螺旋體研究[J].中國(guó)人獸共患病學(xué)報(bào)，2021，37(11)：1053-1056. DOI:10.3969/j.issn.1002-2694.2021.00.149