Necrostatin-1在高糖環(huán)境下促巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用及機(jī)制

周婷 周雪 宋斌

貴州省人民醫(yī)院口腔科，貴陽(yáng)550002

牙周炎是發(fā)生在牙周支持組織的慢性炎癥性疾病，是成年人失牙的最主要原因[1]。第四次全國(guó)口腔流行病學(xué)調(diào)查[2]結(jié)果顯示，在35～44 歲的成年人中，缺失牙及全口失牙的比例分別是84.4% 和1.8%。此外，全球范圍內(nèi)患有重癥牙周炎的患者有近8 億，全口失牙的患者為2.67 億[3]。因此，牙周炎已經(jīng)成為威脅人類(lèi)健康的重要口腔疾病。近年來(lái)大量研究[4-5]表明，全身健康狀況對(duì)牙周炎的發(fā)生發(fā)展具有促進(jìn)作用，其中糖尿病已被證實(shí)是牙周炎的重要危險(xiǎn)因素。中國(guó)糖尿病的患病率為14.8%，大約1.1 億成年人患有糖尿病，居世界首位，已成為威脅人民健康的重大慢性疾病[6-8]。因此深入探討糖尿病促牙周炎發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，對(duì)于進(jìn)一步揭示牙周炎的發(fā)病機(jī)制以及對(duì)牙周炎的防治具有重大意義。

細(xì)胞凋亡、細(xì)胞自噬作為目前研究較深入的程序性細(xì)胞死亡方式（programmed cell death，PCD），已被證實(shí)參與糖尿病相關(guān)牙周炎的發(fā)生發(fā)展[9]。課題組的前期文獻(xiàn)綜述[10]發(fā)現(xiàn)，程序性細(xì)胞壞死為另一種新的PCD，參與調(diào)控牙周炎的發(fā)生發(fā)展；并有研究[11]表明，程序性細(xì)胞壞死也參與了糖尿病相關(guān)牙周炎的發(fā)生發(fā)展。受體相互作用蛋白1 （receptor interacting protein 1，RIP1） 是調(diào)控程序性細(xì)胞壞死的重要基因之一，能夠調(diào)控細(xì)胞死亡及炎癥反應(yīng)[12-13]。研究表明，RIP1既參與了牙周炎的發(fā)生發(fā)展[14]，也能夠調(diào)控糖尿病的發(fā)展進(jìn)程[15]。課題組的前期細(xì)胞實(shí)驗(yàn)[16]也證實(shí)，高糖環(huán)境能夠促進(jìn)牙周組織中重要細(xì)胞——巨噬細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)。程序性細(xì)胞壞死特異性抑制劑Necrostatin-1 （Nec-1） 能夠通過(guò)下調(diào)RIP1的表達(dá)，減輕高糖環(huán)境對(duì)細(xì)胞的促炎作用[17-19]。Nec-1 作為RIP1的特異性抑制劑，除了能夠抑制炎癥反應(yīng)外[20]，還能夠抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)[21-22]。由于氧化應(yīng)激反應(yīng)是糖尿病相關(guān)牙周炎的一個(gè)重要發(fā)病機(jī)制[23-25]。而糖尿病能否通過(guò)調(diào)控RIP1 的表達(dá)影響牙周組織的氧化應(yīng)激反應(yīng)，目前還未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。因此本文在前期研究基礎(chǔ)上，繼續(xù)采用細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，對(duì)Nec-1能否減輕高糖環(huán)境對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的促進(jìn)作用及其分子機(jī)制進(jìn)行探討。

1 材料和方法

1.1 主要材料

Nec-1 （MCE 公司，美國(guó)），2’，7’-二氯熒光黃雙乙酸鹽熒光探針DCFA-DA、丙二醛（malondialdehyde，MDA） 檢測(cè)試劑盒（北京索萊寶科技有限公司），超氧化物歧化酶（superoxide diamutase，SOD） 酶聯(lián)免疫吸附試劑盒（南京建成生物工程研究所）；RIP1、β-連環(huán)蛋白（β-catenin） 抗體（CST 公司，美國(guó)）；培養(yǎng)基、胎牛血清（Invitrogen 公司，美國(guó)）；互補(bǔ)脫氧核糖核酸（complementary DNA，cDNA） 合成試劑盒、聚合酶鏈反應(yīng)（polymerase chain reaction，PCR） 試劑盒（GeneCopoeia公司，美國(guó)）。

1.2 巨噬細(xì)胞的誘導(dǎo)及分組處理

THP-1人單核細(xì)胞株（購(gòu)買(mǎi)于中國(guó)科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會(huì)細(xì)胞庫(kù)），培養(yǎng)于含10% 胎牛血清（fetal bovine serum，F(xiàn)BS） 的杜氏改良細(xì)胞培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium，DMEM）中，培養(yǎng)條件為37 ℃、5%CO2、飽和濕度，采用課題組前期研究[19]的方法，給予終濃度50 ng·mL-1的佛波酯（PMA） 誘導(dǎo)THP-1 細(xì)胞，每2 d 換液1次，將其誘導(dǎo)成巨噬細(xì)胞，巨噬細(xì)胞的分組處理如下。

1.2.1 高糖對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 將用佛波酯誘導(dǎo)分化成功的巨噬細(xì)胞分為兩組：對(duì)照組與高糖組分別給予含葡萄糖濃度5.5 mmol·L-1與25 mmol·L-1的培養(yǎng)基培養(yǎng)，兩組細(xì)胞均培養(yǎng)72 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS 含量，試劑盒檢測(cè)MDA與SOD水平。

1.2.2 Nec-1 在高糖環(huán)境下對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響及RIP1 表達(dá)的影響 分為3 組：正常葡萄糖濃度（5.5 mmol·L-1）培養(yǎng)的對(duì)照組、高糖組（25 mmol·L-1葡萄糖）、 高糖+Nec-1 （5 μmol·L-1）組。3組細(xì)胞均培養(yǎng)72 h后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS 含量，MDA 與SOD 的生化試劑盒分別檢測(cè)MDA與SOD水平。

1.2.3 RIP1 在高糖環(huán)境下對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響 采用課題組前期研究[19]的方法構(gòu)建基因缺陷型細(xì)胞，即設(shè)計(jì)并合成3 條靶向RIP1 mRNA的干擾片段與陰性對(duì)照片段，將干擾片段分別轉(zhuǎn)染進(jìn)巨噬細(xì)胞中，經(jīng)實(shí)時(shí)熒光定量（quantitative real-time，qRT）-PCR 檢測(cè)，確定干擾成功后使用最佳干擾效率的一條做后續(xù)實(shí)驗(yàn)。巨噬細(xì)胞分組如下：高糖+si-NC組、高糖+si-RIP1組。巨噬細(xì)胞在高糖環(huán)境處理下，給予干擾片段處理，72 h 后，流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)巨噬細(xì)胞內(nèi)ROS 含量，試劑盒檢測(cè)MDA與SOD水平。

1.3 ROS含量的檢測(cè)

采用DCFA-DA 熒光探針檢測(cè)巨噬細(xì)胞活性氧（reactive oxygen species，ROS） 水平：巨噬細(xì)胞分組處理結(jié)束后，加入10 μmol·L-1的DCFA-DA 熒光探針繼續(xù)培養(yǎng)30 min，無(wú)血清DMEM 洗滌細(xì)胞2～3次，采用流式細(xì)胞儀檢測(cè)ROS含量。

1.4 MDA及SOD活性的檢測(cè)

巨噬細(xì)胞經(jīng)上述1.2 中各個(gè)分組（對(duì)照組；高糖組；高糖+Nec-1 組；高糖+si-NC 組；高糖+si-RIP1 組） 處理后，使用MDA 及SOD 活性試劑盒檢測(cè)每組細(xì)胞MDA及SOD活性，實(shí)驗(yàn)步驟嚴(yán)格按照檢測(cè)試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行。

1.5 qRT-PCR檢測(cè)RIP1的基因表達(dá)

給予分組處理后的巨噬細(xì)胞，按照試劑盒的要求用Trizol 法提取細(xì)胞總RNA，按照常規(guī)qRTPCR 方法，對(duì)RIP1 的基因表達(dá)進(jìn)行檢測(cè)，以甘油醛-3-磷酸脫氫酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH） 為內(nèi)參基因。

1.6 蛋白質(zhì)印跡法檢測(cè)RIP1的蛋白表達(dá)

巨噬細(xì)胞分組處理后，棄去上清液，加入100 μL的裂解液，離心15 min，收集上清液，蛋白質(zhì)印跡法對(duì)RIP1進(jìn)行半定量檢測(cè)。

1.7 統(tǒng)計(jì)方法

采用GraphPad Prism 8.0.2 軟件處理數(shù)據(jù)，計(jì)量數(shù)據(jù)按均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，兩組間比較采用t檢驗(yàn)，多于兩組的組間比較用單因素方差分析，P＜0.05即認(rèn)為差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié)果

2.1 高糖環(huán)境對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS 的結(jié)果顯示，高糖組細(xì)胞內(nèi)的ROS 含量（圖1） 顯著高于對(duì)照組（P＜0.000 1）。MDA 與SOD 試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示MDA活性（圖2A） 也較對(duì)照組顯著上調(diào)（P＜0.000 1），SOD活性（圖2） 較對(duì)照組顯著降低（P＜0.000 1）。這些結(jié)果表明，高糖環(huán)境誘發(fā)巨噬細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖1 高糖環(huán)境對(duì)THP-1來(lái)源的巨噬細(xì)胞ROS的影響Fig 1 The effects of high glucose on ROS of THP-1 derived macrophages

圖2 高糖環(huán)境對(duì)THP-1 來(lái)源的巨噬細(xì)胞MDA 及SOD 活性的影響Fig 2 The effects of hig glucose on MDA and SOD levels of THP-1 derived macrophages

2.2 Nec-1 在高糖環(huán)境下對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的影響

流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS 的結(jié)果如圖3 所示，高糖+Nec-1 組中細(xì)胞ROS 含量顯著低于高糖組（P＜0.000 1）。MDA 與SOD 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示（圖4），與高糖組相比，在高糖+Nec-1 組MDA 活性顯著下調(diào)（P＜0.000 1），SOD 活性（圖4） 顯著上升（P＜0.01）。表明Nec-1 緩解高糖對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的促進(jìn)作用。

圖3 Nec-1在高糖促細(xì)胞ROS上升中的作用Fig 3 The effects of Nec-1 on high glucose-induced ROS

圖4 Nec-1在高糖致細(xì)胞MDA、SOD表達(dá)改變中的作用Fig 4 The effects of Nec-1 on high glucose-induced MDA and SOD

2.3 Nec-1 對(duì)高糖環(huán)境下巨噬細(xì)胞中RIP1 表達(dá)的影響

巨噬細(xì)胞在高糖環(huán)境下給予Nec-1 過(guò)表達(dá)后，qRT-PCR及WB檢測(cè)RIP1的表達(dá)。qRT-PCR與WB結(jié)果如圖5 示，高糖組RIP1 mRNA 及蛋白表達(dá)水平顯著高于對(duì)照組（分別為P＜0.001、P＜0.000 1）；高糖+Nec-1 組RIP1 基因及蛋白表達(dá)卻顯著低于高糖組（P＜0.000 1），這提示RIP1 參與高糖環(huán)境促巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖5 Nec-1對(duì)高糖環(huán)境下巨噬細(xì)胞中RIP1表達(dá)的影響Fig 5 Effect of Nec-1 on the expression of RIP1 in macrophages under high glucose

2.4 RIP1 對(duì)高糖環(huán)境下誘導(dǎo)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激的影響

qRT-PCR 實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示：RIP1 基因表達(dá)得到有效沉默（P＜0.001）（圖6A）。流式細(xì)胞術(shù)檢測(cè)ROS的結(jié)果顯示：與高糖+si-NC 組相比，高糖+si-RIP1 組的ROS 含量顯著降低（圖6B～D）。MDA與SOD 檢測(cè)試劑盒檢測(cè)結(jié)果顯示（圖6E、F）：高糖+si-RIP1 組的MDA 活性顯著低于高糖+si-NC 組（P＜0.001）；高糖+si-RIP1 組的SOD 活性顯著高于高糖+si-NC組（P＜0.000 1）。綜上，氧化應(yīng)激指標(biāo)的結(jié)果表明，沉默巨噬細(xì)胞內(nèi)RIP1 的表達(dá)，能夠緩解高糖環(huán)境誘導(dǎo)的氧化應(yīng)激反應(yīng)。

圖6 RIP1在高糖促細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用Fig 6 The role of RIP1 on high glucose-induced oxidative stress

3 討論

本研究在課題組前期研究的基礎(chǔ)上，采用高糖環(huán)境（25 mmol·L-1的葡萄糖） 刺激THP-1 來(lái)源的巨噬細(xì)胞作為細(xì)胞模型，來(lái)探討糖尿病對(duì)牙周組織氧化應(yīng)激反應(yīng)的影響及分子機(jī)制。有研究報(bào)道，糖基化終末產(chǎn)物能夠通過(guò)上調(diào)牙周膜干細(xì)胞的ROS 含量，激活了JNK 信號(hào)通路，從而導(dǎo)致細(xì)胞凋亡的發(fā)生[26]；此外，高糖環(huán)境能夠通過(guò)上調(diào)ROS 含量及MDA 活性、降低SOD 活性，抑制牙周膜干細(xì)胞的成骨分化能力[27]；高糖環(huán)境還能通過(guò)上調(diào)細(xì)胞ROS 含量，抑制牙齦成纖維細(xì)胞的增殖和遷移[28]，同時(shí)誘發(fā)牙齦上皮細(xì)胞的炎癥反應(yīng)[29]。上述研究提示，氧化應(yīng)激反應(yīng)在糖尿病促牙周炎發(fā)生發(fā)展中具有重要作用，高糖環(huán)境所誘發(fā)的氧化應(yīng)激反應(yīng)，能夠影響牙周細(xì)胞的生物學(xué)功能，并能導(dǎo)致牙周細(xì)胞發(fā)生炎癥反應(yīng)。本研究同樣證實(shí)了高糖環(huán)境能夠誘導(dǎo)牙周組織的重要細(xì)胞——巨噬細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)（圖1、2），與上述研究具有一致性。那么高糖環(huán)境促進(jìn)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的分子機(jī)制是什么？

課題組在前期研究中發(fā)現(xiàn)，RIP1 的特異性抑制劑Nec-1能夠抑制高糖環(huán)境對(duì)巨噬細(xì)胞的促炎作用，但其能否抑制氧化應(yīng)激反應(yīng)，目前尚未見(jiàn)相關(guān)報(bào)道。研究表明，Nec-1 能夠抑制氯化鈷所誘發(fā)的骨骼肌細(xì)胞氧化應(yīng)激狀態(tài)[30]，還能抑制神經(jīng)細(xì)胞的氧化應(yīng)激損傷[31]。Nec-1 能夠通過(guò)對(duì)氧化應(yīng)激反應(yīng)的有效抑制，減輕中暑導(dǎo)致的腸道損傷[32]、減輕腎臟缺血再灌注損傷[21]，以及減輕順鉑導(dǎo)致的腎毒性[33]。上述研究表明，Nec-1 除了具有抗炎作用，還具有抗氧化應(yīng)激的作用，并能通過(guò)其抗氧化應(yīng)激的特性，減輕氧化應(yīng)激所導(dǎo)致的其他病理改變。因此本研究對(duì)Nec-1在高糖環(huán)境促巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用也進(jìn)行了探討，如圖3和圖4 所示，Nec-1 能夠抑制高糖環(huán)境對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的促進(jìn)作用，與上述結(jié)果保持一致性。鑒于RIP1 是Nec-1 的主要作用靶點(diǎn)，課題組檢測(cè)了RIP1 的表達(dá)量，結(jié)果顯示Nec-1 能夠抑制高糖環(huán)境對(duì)細(xì)胞RIP1 表達(dá)的促進(jìn)作用，提示RIP1 可能參與了氧化應(yīng)激反應(yīng)。研究表明，RIP1 能夠?qū)е戮€(xiàn)粒體功能紊亂從而促進(jìn)ROS 含量的上調(diào)[34]，還能通過(guò)誘發(fā)氧化應(yīng)激反應(yīng)而促進(jìn)壓迫環(huán)境下髓核細(xì)胞的凋亡[35]，但RIP1 在糖尿病促牙周炎發(fā)生發(fā)展中的作用尚不明了。課題組采用小干擾RNA 技術(shù)有效沉默巨噬細(xì)胞的RIP1 表達(dá)，進(jìn)一步探討RIP1 在高糖環(huán)境促巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)中的作用。轉(zhuǎn)染了si-RIP1 及si-NC 的巨噬細(xì)胞在高糖環(huán)境中培養(yǎng)后，課題組再次檢測(cè)氧化應(yīng)激相關(guān)指標(biāo)的改變，結(jié)果顯示，沉默RIP1 后，能夠抑制高糖環(huán)境對(duì)巨噬細(xì)胞氧化應(yīng)激反應(yīng)的促進(jìn)作用，該結(jié)果也與上述研究的結(jié)論相一致。但RIP1 通過(guò)何種機(jī)制調(diào)控高糖環(huán)境促巨噬細(xì)胞發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，將在今后的研究中進(jìn)一步去探討。

綜上所述，本實(shí)驗(yàn)證實(shí)了高糖環(huán)境通過(guò)上調(diào)RIP1的表達(dá)，從而促進(jìn)巨噬細(xì)胞的氧化應(yīng)激反應(yīng)。通過(guò)本研究，能夠進(jìn)一步豐富糖尿病促牙周炎發(fā)生發(fā)展的分子機(jī)制，同時(shí)為牙周炎的防治提供理論依據(jù)。

利益沖突聲明：作者聲明本文無(wú)利益沖突。