基于TMT10-plex等量標記結合SMOAC富集磷酸肽的定量磷酸化蛋白質組性能評價

趙歡歡，李存玉，金 紅

（復旦大學生物醫(yī)學研究院,上海200032）

蛋白質磷酸化是生物體內廣泛存在的最重要的共價修飾方式之一.細胞內有30%以上的蛋白質發(fā)生磷酸化修飾［1］.蛋白質磷酸化是指蛋白質在磷酸化激酶的催化下將三磷酸腺苷（ATP）或三磷酸鳥苷（GTP）上的磷酸基團轉移到絲氨酸、蘇氨酸或酪氨酸殘基上的可逆過程.激酶誘導蛋白質磷酸化，磷酸酶誘導蛋白質去磷酸化，這一可逆過程能調節(jié)和控制蛋白質活力和功能，參與各種生理和病理過程，包括細胞增殖、發(fā)育分化、細胞凋亡、信號轉導及腫瘤發(fā)生等生命活動.因而，基于質譜的磷酸化研究在蛋白質組學研究中的作用尤為重要［2，3］.

磷酸化蛋白豐度較低，因此在質譜鑒定前通常需要進行磷酸化肽段富集步驟.目前常用的富集方法［4］包括強陽離子交換色譜（SCX）、固相金屬離子親和色譜（IMAC）、金屬氧化物親和色譜（MOAC）以及免疫吸附（利用抗體特異性富集酪氨酸磷酸化肽段）等，其中應用最廣泛的是IMAC［5~7］和MOAC［8~10］.但是，每種方法對樣品磷酸化蛋白組的覆蓋度都是有限的，有研究［11］比較了不同的磷酸肽富集方法，包括磷酸酯化學、IMAC和TiO2色譜，結果顯示每種方法分離出的磷酸化蛋白質組是不同的、只有部分重疊，這意味著目前沒有任何單獨的一種富集方法能夠全面地分析磷酸化蛋白質組.然而，定量分析磷酸化蛋白質組的必要前提是分離出磷酸化蛋白或磷酸化肽，理想的方法是無偏向地分離出樣品中所有的磷酸化肽，且重現(xiàn)性和特異性高.盡管分離磷酸化蛋白和磷酸化肽的方法已經取得了長足的進展［12~17］，但具備上述理想性質的技術尚未開發(fā)出來.

為了獲得盡可能全面的磷酸化蛋白質組，需要使用互補的方法來完成富集.Thingholm等［18］開發(fā)了MOAC與IMAC相結合的磷酸肽富集方法，提高了富集磷酸化肽段的選擇性和靈敏度.此后，IMAC和MOAC的順序洗脫富集方法（SIMAC，Sequential elution from IMAC）在各種大規(guī)模的磷酸化蛋白質組學研究中獲得了廣泛應用［19~21］.Sun等［22］通過在復雜生物樣品中添加磷酸肽標準品測試了SIMAC方法的重復性和線性，結果顯示SIMAC方法對大多數磷酸肽只有有限的線性和重復性，可能是每個生物樣品單獨富集時由磷酸化富集方法本身引入的差異，或是電離過程中不同磷酸化肽的電離水平不同引起的，也可能是由兩者結合導致的.為了避免多次富集可能引入的差異，近年來多使用等重標記技術定量磷酸化蛋白質組，用等重同位素標記不同組的肽段，將其混合后再進行磷酸化富集，不同組的樣品得以同步完成磷酸化富集.然而，由于磷酸化肽段豐度極低，如需深度挖掘還要在LC-MS/MS分析前使用液相色譜對標記或者富集后的肽段混合物進行組分分離以降低樣本復雜度［23，24］，同時對樣本需求量也較大.

本文旨在開發(fā)能夠靈敏、高效、全面地定量磷酸化蛋白質組的技術，在SIMAC的基礎上探索了另一種順序組合的富集方法SMOAC（Sequential enrichment of MOAC）.考慮到大規(guī)模磷酸化蛋白質組學應用中，樣品需求量大以及分別富集引入的差異等問題，我們將SMOAC與等重同位素標記技術相結合，對各個樣品酶解后的肽段進行等重同位素標記，然后混合，再用SMOAC富集磷酸化肽段.這不僅減少了樣品的需求量，避免了多個樣品因多次富集引入的差異，也減少了磷酸化肽段的損失，提高了富集效率，從而實現(xiàn)更準確的磷酸化蛋白質差異定量分析.紫草素能抑制人肝癌細胞HepG2的增殖，誘導HepG2細胞凋亡，研究發(fā)現(xiàn)經紫草素處理后的HepG2細胞中磷酸化蛋白的表達有變化［25］.本文將SMOAC結合TMT-10PLEX試劑等量標記的方法對經紫草素處理的及正常的人肝癌HepG2細胞進行磷酸化差異蛋白分析，以研究方法的可行性，并探索了樣品經SMOAC富集后獲得單磷酸化肽和多磷酸化肽段的最優(yōu)采集方式.

1 實驗部分

1.1 試劑與儀器

人肝癌HepG2細胞株（中國科學院上海細胞生物學研究所細胞庫）；紫草素（大連美侖生物技術有限公司）；DMEM培養(yǎng)基（Dulbecco’s modified eagle medium）、胎牛血清（FBS）、胰酶、青鏈霉素混合液（PS）、甲酸（FA，質譜純）、0.5 mol/L三（2-羧乙基）膦還原劑（TCEP）、1 mol/L四乙基溴化銨（TEAB）和蛋白酶及磷酸酶抑制劑混合物［Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail（100×）］均購自美國Thermo Fisher公司；磷酸鹽緩沖液（PBS）購自Adamas試劑有限公司；尿素（Urea，分析純）、十二烷基硫酸鈉（SDS）和碘乙酰胺（IAA）購自國藥集團化學試劑有限公司；三氟乙酸（TFA）購自美國Sigma公司；乙腈（ACN，質譜純）和甲醇購自德國Merck公司.

MilliQ超純水系統(tǒng)（美國Millipore公司）；C18除鹽柱（美國Waters公司）；C18反相色譜柱、High-Select?TiO2Phosphopeptide Enrichment Kit（TiO2磷酸化肽段富集試劑盒）、High-Select?Fe-NTA Phosphopeptide Enrichment Kit（Fe-NTA磷酸化肽段富集試劑盒）、TMT10plex?Isobaric Label Reagent Set（同位素標記試劑）、-80℃超低溫冰箱、Easy-nLC1200型超高效液相色譜儀及Thermo Scientific?Orbitrap Exploris 480型質譜儀（美國Thermo Fisher公司）.

1.2 實驗過程

1.2.1 細胞培養(yǎng)、分組及給藥人肝癌HepG2細胞株經復蘇后加入DMEM培養(yǎng)基（10%FBS+1%PS）中，于37℃，5%CO2條件下培養(yǎng).取對數生長期細胞進行后續(xù)實驗：0.25%胰酶消化、細胞計數，并取細胞接種于6孔培養(yǎng)板中，每孔1×105個，然后放入培養(yǎng)箱中培養(yǎng).當細胞生長至80%時開始給藥處理.實驗設置正常對照組（C1~C6）和處理組（T1~T6），每組6個復孔，處理組加入紫草素（終濃度為10×10-6mol/L），正常對照組加入等量的空白培養(yǎng)基，置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h后收集細胞，用預冷的PBS緩沖液清洗2次，細胞沉淀于-80℃保存，備用.

1.2.2 細胞蛋白質提取、酶解及標記與C18除鹽向每管HepG2細胞沉淀中加入8 mol/L Urea+0.1%SDS（質量/體積）并混合均勻，所用裂解液中包含Protease and Phosphatase Inhibitor Cocktail（100×），置于冰上裂解30 min，裂解產物于低溫下以12000 r/min轉速離心30 min.對上層清液采用二喹啉甲酸（BCA）法測定蛋白濃度.根據BCA所測濃度每個樣品取100 μg蛋白溶液，各加入0.5 mol/L TCEP（終濃度10×10-3mol/L），于37℃孵育1 h進行還原反應；避光加入1 mol/L IAA（終濃度40×10-3mol/L），于室溫避光靜置45 min進行烷基化反應；然后，加入6倍體積于-20℃預冷的丙酮沉淀4 h，以低溫12000 r/min轉速離心20 min后去掉上層清液；將沉淀用預冷的90%丙酮清洗2遍，高速離心后去掉上層清液，待沉淀表面液體揮發(fā)后用100 μL 0.1 mol/L TEAB溶解蛋白沉淀；按胰蛋白酶與蛋白質量比1∶25加入胰蛋白酶，于37℃反應過夜.

從低溫冰箱里取出2組六標TMT試劑（126，127N，127C，128N，128C和131），室溫下平衡10 min后每管加入41 μL質譜純乙腈混合均勻使其溶解，按表1所示分別加入到相應的2組酶解肽段中，室溫下反應2 h；每管中加入8 μL 5%羥胺于室溫下孵育30 min以終止標記反應；2組均取等量標記肽段混合凍干.

Table 1 TMT reagents of the corresponding samples

用600 μL 0.1%TFA復溶凍干的2組已標記肽段；用1 mL甲醇活化C18柱，1 mL 0.1%TFA平衡柱子；將復溶的標記肽段上樣到平衡好的C18柱上；用0.1%TFA清洗3次后，依次用300 μL 140%ACN+0.1%TFA，300 μL 60%ACN+0.1%TFA洗脫肽段；將2次洗脫液合并混合均勻后凍干，待磷酸化富集實驗.

1.2.3 SMOAC法磷酸化肽富集SMOAC連續(xù)富集法分為MOAC富集和IMAC富集2步，依次使用TiO2磷酸化富集試劑盒及Fe-NTA磷酸化富集試劑盒完成.MOAC富集：取TiO2小柱用洗滌緩沖液清洗1次，再用結合/平衡緩沖液平衡1次；將1.2.2節(jié)標記后脫鹽凍干的肽段混合物用結合/平衡緩沖液重新溶解，轉移到平衡過的TiO2小柱內以1000 r/min轉速離心5 min以結合磷酸肽，離心得到的流穿液再轉移到TiO2小柱內重復結合1次，收集流穿液；之后依次用結合/平衡緩沖液、洗滌緩沖液、質譜純水洗滌TiO2小柱，收集這3種清洗液，并與流穿液合并、凍干；分2次用50 μL磷酸化肽段洗脫緩沖液從洗滌過的TiO2小柱中洗脫出與TiO2結合的磷酸化肽（TiO2洗脫液），并立即進行真空離心凍干.IMAC富集：取Fe-NTA樹脂柱用試劑盒里的結合/洗滌緩沖液清洗平衡2次；將上述經TiO2富集后的流穿餾分和清洗餾分合并凍干，之后重新溶解于結合/洗滌緩沖液中，并轉移到平衡過的Fe-NTA樹脂柱中，室溫下孵育30 min后以1000 r/min轉速離心30 s；用結合/洗滌緩沖液洗滌Fe-NTA樹脂柱3次，再用質譜純水洗滌1次；分2次用100 μL磷酸化肽段洗脫緩沖液從洗滌過的樹脂柱中洗脫出磷酸化肽段（Fe-NTA洗脫液），立即進行真空離心凍干.

需要特別注意的是，2次富集用到的緩沖液來源于各自的試劑盒，不能混用.該富集實驗采用1.2.2節(jié)的2組標記肽段平行進行2組，其中一組將2次洗脫下來的磷酸化肽段合并后進行質譜分析，另一組分別進行質譜分析.另外，為了盡量確保2組分析的上樣量一致，前者合并后取一半進行質譜分析，后者全部進行質譜分析.

1.2.4 液相色譜-質譜聯(lián)用分析經富集后的磷酸化肽段用Thermo Scientific?Easy-nLC1200型超高效液相色譜儀與Orbitrap Exploris 480型高分辨質譜儀聯(lián)用進行LC MS/MS實驗.

色譜條件：C18反相色譜柱（75 μm×500 mm，2 μm，10 nm）；流動相：A相為0.1%FA水溶液，B相為80%ACN+0.1%FA溶液；流速300 nL/min；洗脫梯度：0~170 min，2%~20%B；170~174 min，20%~30%B；174~175 min，30%~100%B；175~180 min，100%B.

質譜條件：正離子模式檢測；一級質譜分辨率120 K，采集的質量掃描范圍為m/z400~1600；采集模式為數據依賴采集，Normalized AGC target（%）設為300，Maximum injection time設為50×10-3s，檢測的肽段所帶電荷數為2~5，動態(tài)排除時間20 s；二級分辨率30 K，Normalized AGC target（%）設為100，Maximum injection time 50×10-3s，二級碎裂模式HCD.

1.2.5 數據庫檢索質譜數據使用Proteome Discoverer 2.4（Thermo Fisher Scientific）內嵌（Sequest HT）軟件進行分析，以Swiss Prot_human為數據庫搜庫.搜庫參數：peptide mass tolerance=10×10-6；enzyme=trypsin；fragment mass tolerance=0.02 u；固定修飾（Fixed modification）：TMT6plex（N-term），Carbamidomethyl（C），TMT6plex（K）；可變修飾（Variable modification）：oxidation（M），acetyl（protein N-term），deamidated（NQ），phosphorylation（S/T/Y）；漏切上限（Max missed cleavage）設為2；Site probabilities＞75；蛋白假陽性率（False discovery rate，F(xiàn)DR）設為1%.

2 結果與討論

2.1 實驗方法

磷酸化是細胞內最常見的共價修飾方式之一，在各種生理和病理過程中起到重要作用.磷酸化肽段豐度低，不易檢出；同時非磷酸化肽的存在會抑制磷酸肽的電離，影響其信號.因此，在質譜分析之前必須要從肽段中分離出磷酸化肽.目前已開發(fā)出的多種磷酸化富集方法對磷酸化肽段的富集都有一定的選擇性和偏向性，沒有任何單獨的一種方法能夠全面地分離出所有的磷酸化肽.為了提高磷酸化肽段的回收率，盡可能全面地獲得樣品中的磷酸化肽，本文探索了一種連續(xù)互補的富集方法SMOAC來富集磷酸化肽.同時，考慮到常規(guī)的磷酸化起始富集需要1 mg的蛋白起始量，為了減少樣品需求量，也為了避免每個樣品分別富集引入的差異，本文結合TMT等重標記的優(yōu)勢，將待分析的各個樣品等重標記并混合后進行富集（具體實驗流程如圖1）.對6例經紫草素處理的和6例未經處理的正常人肝癌細胞HepG2細胞蛋白質進行提取，每個取100 μg蛋白進行還原、烷基化后，分2組（每組3例紫草素處理組+3例正常對照組）用TMT試劑標記，分別混合后進行脫鹽、凍干處理.凍干后的肽段先經過TiO2富集，收集洗脫液，即富集后的肽段，流穿液和清洗液凍干后再用Fe-NTA進行第二次磷酸化肽富集，收集洗脫液.為了更完整地評價SMOAC方法，找到獲得其質譜數據最有效的分析方式，將2組等量的標記肽段混合物同時進行2組SMOAC富集，每組各有2種洗脫液（TiO2洗脫液和Fe-NTA洗脫液），分3次進行LC-MS/MS分析：一組的2種洗脫液單獨分析（圖1中①和②），另一組的2種洗脫液合并后一起分析（圖1中③）.為了保證2組的上樣量一致，前者全部用來質譜分析，后者合并后取一半進行質譜分析；為了減少樣品損失，同時更充分地鑒定磷酸化肽，我們采用3 h長梯度進行LC-MS/MS分析，分別用Proteome Discoverer 2.4軟件檢索，對比2種分析方式，探索酶解肽段經SMOAC富集后采集磷酸化肽的有效方式.

Fig.1 Flow chart of analysis

2.2 TiO2洗脫液與Fe-NTA洗脫液鑒定結果分析

從TiO2洗脫液中共鑒定到2467個磷酸化蛋白上7445條磷酸化肽段，肽段特異性約為97%，其中單磷酸化肽段占57.6%，雙磷酸化肽占31.4%，三磷酸化肽占11.0%.從二次富集的Fe-NTA洗脫液中共鑒定到3604個磷酸化的蛋白上11297條磷酸化肽段，肽段特異性約為87%，其中單磷酸化肽段占98.3%，雙磷酸化肽占1.0%，三磷酸化肽占0.1%（圖2）.

Fig.2 Analysis results of the amount of peptides identified from TiO2 eluate and Fe eluate by LC?MS

由于連續(xù)富集的2次洗脫液中磷酸化肽段存在交蓋（占總磷酸化肽段的22.1%），故共鑒定到3946個磷酸化蛋白上15349條磷酸化肽段，其中有52%的總磷酸化肽段是只在二次富集的Fe-NTA洗脫液中鑒定到的，而只在首次富集的TiO2洗脫液中鑒定到的磷酸化肽僅占26.4%，單磷酸化肽中有64%是只在Fe-NTA洗脫液中鑒定到的，占單磷酸化肽總數的50%以上，而大部分多磷酸化肽是從首次富集的TiO2洗脫液中鑒定到的；TiO2洗脫液與Fe-NTA洗脫液共鑒定到磷酸化蛋白3946個，其中交蓋的蛋白約占54%，只在Fe-NTA洗脫液中鑒定到的約占總鑒定量的37.5%（圖3）.

Fig.3 Analysis results of the overlap of peptides and proteins identified from TiO2 eluate and Fe?NTA eluate by LC?MS

以上結果說明了在處理高度復雜的混合物時分析這些通常被丟棄的部分（流穿液和清洗液）的重要性.肽段混合物經TiO2富集后會有一些未能結合在TiO2上的磷酸化肽段或結合不緊密的磷酸化肽段存在于流穿液或清洗液中，將其凍干后再用Fe-NTA進行二次富集，可有效減少磷酸化肽的損失，提高磷酸化肽富集的特異性及鑒定的靈敏度.雖然這種連續(xù)富集的策略（SMOAC）需要1次額外的富集步驟，但是工作量遠比將肽段混合物分餾后再進行多次磷酸肽富集的工作量要低得多.總之，在分析復雜生物樣品的磷酸化蛋白質組過程中，SMOAC是一種快速簡便且高效的方法，可顯著提高大規(guī)模定量磷酸化蛋白質組學的水平.

2.3 兩次洗脫液合并質譜分析與分別質譜分析結果比較

2.3.1 磷酸化肽段及位點比較如圖4所示，將2次洗脫液合并進行質譜分析與分別進行質譜分析相比，鑒定到的總磷酸化肽段數提高了6%，單磷酸化肽段占所有肽段的比例提高14%，但多磷酸化肽段比例降低了7%.2次洗脫液合并分析鑒定到的總磷酸化肽段較多，說明TiO2洗脫液和Fe-NTA洗脫液中有一些共有的磷酸化肽段，由于豐度較低，在分別分析時未能被質譜檢測到，將2次洗脫液合并后信號強度提高而被質譜檢測到；鑒定到的單磷酸化占比提高，表明合并后磷酸化信號強度的升高主要得益于單磷酸化肽段豐度的提高；而多磷酸化肽大多數在TiO2洗脫液中鑒定到，合并質譜分析發(fā)現(xiàn)其比例反而降低，可能是由于單磷酸肽強度的升高使得其對多磷酸化肽電離化的抑制作用增強［18，26］，從而降低了被質譜檢測到的機會.綜上，SMOAC的2次洗脫液合并分析得到的總磷酸化肽段更多，分別分析得到的多磷酸化肽更多.

Fig.4 Comparison of the amount of phosphopeptides identified from two types of analysis

2.3.2 磷酸化蛋白鑒定及定量比較2次洗脫液分別分析定量得到3946個磷酸化蛋白（FDR<1%），占總鑒定量的91.4%；合并分析定量得到4263個磷酸化蛋白（FDR<1%），占總鑒定量的90.3%.這說明SMOAC能夠有效富集TMT標記的磷酸化肽段，利用TMT等重標記技術結合SMOAC富集技術實現(xiàn)磷酸化蛋白質組的高通量定量是可行的.即使是低于1 mg的少量生物樣本，該策略也能對其磷酸化蛋白質組進行全面的定量分析，也說明將2次洗脫液合并進行質譜分析得到的磷酸化蛋白更多.

2.4 組內重復標記間相關性分析

由于在樣品前處理過程中標記肽段的混合發(fā)生在比較早的階段（富集和質譜分析之前），因此，等量標記最重要的優(yōu)點之一是提高了實驗重現(xiàn)性.為了評價SMOAC富集TMT標記肽段這一流程的可重復性，分析了對照組和處理組組內重復通道間的信號強度.經數據庫檢索后，將1個通道中的lg Abundances與另一個重復通道中的lg Abundances進行了對比.如圖5所示，組內各2個重復間磷酸化蛋白的強度非常好地相關（R＞0.95），表明標記肽段用SMOAC方法富集以后出現(xiàn)的變化較小，實驗重復性良好.

Fig.5 Scatterplots reflecting correlation of protein abundances in technical replicates

2.5 差異磷酸化蛋白結果分析

采用Student’s T-test，以磷酸化蛋白質在經紫草素處理的及正常的HepG2細胞中表達含量作為參考，在SMOAC 2次洗脫液合并分析的數據中找出具有顯著差異的磷酸化蛋白1961種（以P<0.05，表達量±20%為差異［27，28］），其中上調1397種，下調564種.

Fig.6 Scatter plot of enriched KEGG pathways statistics

為了鑒定經紫草素處理后細胞中涉及的信號通路，使用DAVID軟件對鑒定到的差異表達的磷酸化蛋白進行KEGG（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，京都基因與基因組百科全書）信號通路分析，發(fā)現(xiàn)定量到的差異磷酸化蛋白在32種KEGG通路中顯著富集（P≤0.05，表S1，見本文支持信息）.圖6示出了前10個富集通路，主要包括DNA復制、RNA轉運、核糖體生成、蛋白酶體、剪接體和mRNA監(jiān)視通路等，意味著紫草素可能主要通過影響遺傳物質的生成來抑制HepG2細胞的增殖及生長，與已有研究結果相符［25］.

綜上所述，為尋找快速、簡便且能夠全面定量磷酸化蛋白質組的技術，提出了一種靈敏、高效、高通量定量磷酸化蛋白質組的策略：TMT10-plex標記定量技術結合連續(xù)互補的磷酸化肽富集法SMOAC.結果表明，SMOAC能夠有效富集TMT10-plex標記的磷酸化肽段，包括多磷酸化肽和單磷酸化肽；并且其特異性強、靈敏度高、工作量少，不需要將混合的標記肽段分餾后多次富集，只需要一次額外的富集步驟；即使是低于1 mg的少量復雜生物樣本，也能對其差異表達的磷酸化蛋白進行相對全面的定量分析.將該策略與高精度高靈敏度質譜儀結合，可使每組樣品只需要3 h質譜分析時間即能識別大量的磷酸化位點，極大提高了磷酸化蛋白質組學的定量水平.此外，實驗使用6個TMT試劑標記了處理組與對照組各3例樣品的肽段，實現(xiàn)了1次SMOAC富集加1次質譜分析同時分析定量6個生物樣品磷酸化蛋白質組的目的.如果用TMTpro 16-plex標記試劑（美國Thermo Scientific），最多可一次性分析16個樣本，由于富集前需要將標記肽段全部混合，每個樣品只需要50 μg就能得到理想的效果.該策略為標準化磷蛋白質組標記定量技術提供了參考.

感謝復旦大學生物醫(yī)學研究院公共技術平臺蛋白質子平臺周新文老師和劉曉慧老師分別在質譜采集和報告撰寫方面提供的幫助.

支持信息見http：//www.cjcu.jlu.edu.cn/CN/10.7503/cjcu20210406.