基于轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分析山藥蛋白防治糖尿病性勃起功能障礙的作用機(jī)制

邢欣 趙大慶 王思明 于士婷 李懿軒 劉美辰

中圖分類號(hào) R285;R966 文獻(xiàn)標(biāo)志碼 A 文章編號(hào) 1001-0408（2021）23-2859-10

DOI 10.6039/j.issn.1001-0408.2021.23.08

摘 要 目的：研究山藥蛋白（DOT）防治糖尿病性勃起功能障礙（DIED）的潛在作用機(jī)制。方法：采用高糖高脂飼料+腹腔注射鏈脲佐菌素（40 mg/kg）的方法復(fù)制DIED大鼠模型。實(shí)驗(yàn)設(shè)置正常對(duì)照組（生理鹽水），模型組（生理鹽水），DOT低、中、高劑量組（0.3、0.6、0.9 mg/kg）和西地那非組（陽性對(duì)照，4.4 mg/kg），每組9只大鼠。在糖尿病模型已建立成功、開始誘導(dǎo)DIED發(fā)生的階段，各組大鼠開始灌胃相應(yīng)溶液，每天1次，連續(xù)11周。測(cè)定大鼠體質(zhì)量、空腹血糖（FPG）值、勃起次數(shù)、勃起率、空腹胰島素（FINS）、胰島素抵抗指數(shù)（IR）以及陰莖海綿體組織中內(nèi)皮型一氧化氮合酶（eNOS）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）含量，以評(píng)價(jià)DOT對(duì)DIED模型大鼠的干預(yù)作用。選擇30 mmol/L葡萄糖誘導(dǎo)48 h建立高糖損傷小鼠海綿體內(nèi)皮細(xì)胞（MCECs）模型，并給予125、250、500 μg/mL DOT進(jìn)行干預(yù)，然后檢測(cè)細(xì)胞活力，以評(píng)價(jià)DOT對(duì)高糖損傷MCECs的影響。繼而采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù)分別篩選正常MCECs與高糖損傷MCECs、高糖損傷MCECs與250 μg/mL DOT處理的MCECs中的差異表達(dá)基因，對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析;分析兩組細(xì)胞間共同的差異表達(dá)基因，并選擇6個(gè)關(guān)鍵基因在mRNA水平上進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果：不同劑量DOT對(duì)DIED模型大鼠體質(zhì)量降低、FINS和IR升高、勃起次數(shù)減少、勃起率降低以及陰莖海綿體組織中eNOS、cGMP含量降低均有不同程度的逆轉(zhuǎn)作用，其中高劑量DOT作用后DIED模型大鼠的上述指標(biāo)變化均被顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.05或P<0.01）。125、250、500 μg/mL DOT均可顯著提高高糖損傷MCECs的活力（P<0.05或P<0.01）。轉(zhuǎn)錄組測(cè)序結(jié)果表明，與正常MCECs比較，高糖損傷MCECs中共有48個(gè)差異表達(dá)基因;與高糖損傷MCECs比較，DOT處理的MCECs中共有779個(gè)差異表達(dá)基因;兩組差異表達(dá)基因在生物學(xué)過程注釋中均以細(xì)胞過程為主、在細(xì)胞組分注釋中均以細(xì)胞部分為主、在分子功能注釋中均以綁定分子功能為主，并主要富集在細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路、錯(cuò)配修復(fù)通路、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號(hào)通路等。在兩組差異表達(dá)基因中，共得到Aldh1a1、Abcc5、Tac1等13個(gè)共同的差異表達(dá)基因，DOT均可顯著回調(diào)高糖損傷MCECs中上述共同差異表達(dá)基因的表達(dá)。經(jīng)驗(yàn)證，DOT可以顯著逆轉(zhuǎn)高糖損傷MCECs中關(guān)鍵基因TGF-β3、Txnip、Aldh1a1、Loxl1、Mt1、Mt2的mRNA表達(dá)。結(jié)論：DOT對(duì)DIED模型大鼠的癥狀具有改善作用;其作用機(jī)制可能與抑制纖維化、降低氧化應(yīng)激等生物學(xué)途徑，從而改善海綿體內(nèi)皮功能有關(guān)。

關(guān)鍵詞 山藥蛋白;糖尿病性勃起功能障礙;轉(zhuǎn)錄組測(cè)序技術(shù);纖維化;氧化應(yīng)激;差異表達(dá)基因

Analysis of the Mechanism of Yam Protein in the Prevention and Treatment of Diabetes-induced Erectile Dysfunction Based on RNA-Seq Technology

XING Xin，ZHAO Daqing，WANG Siming，YU Shiting，LI Yixuan，LIU Meichen（Jilin Institute for Ginseng Science Research， Changchun University of Chinese Medicine， Changchun 130117， China）

ABSTRACT? ?OBJECTIVE： To study the potential mechanism of yam protein （DOT） in the prevention and treatment of diabetes-induced erectile dysfunction （DIED）. METHODS： DIED model was induced by high-glucose and high-fat diet and intraperitoneal injection of streptozotocin （40 mg/kg）. The experiment was set up in the normal control group （normal saline）， model group （normal saline）， DOT low-dose， medium-dose and high-dose groups （0.3， 0.6， 0.9 mg/kg）， sildenafil group （positive control， 4.4 mg/kg）， with 9 rats in each group. In the stage of successful establishment of diabetes model and initiation of inducing DIED， rats in each group were given relevant solution intragastrically， once a day， for consecutive 11 weeks. Body weight， fasting plasma glucose （FPG）， the times and rate of penile erection， fasting insulin （FINS）， insulin resistance index （IR）， the contents of endothelial nitric oxide synthase （eNOS） and cyclic guanosine monophosphate （cGMP） in penile cavernous tissue were determined so as to evaluate the intervention effects of DOT on DIED model rats. High-glucose damaged mice cavernous endothelial cells （MCECs） model was induced by 30 mmol/L glucose for 48 h， and then give DOT 125， 250， 500 μg/mL. The cell viability was detected so as to evaluate the effects of DOT on high-glucose damaged MCECs model. RNA-Seq technology was adopted to screen the differentially expressed genes between normal MCECs and high-glucose damaged MCECs， high-glucose damaged MCECs and MCECs treated with 250 μg/mL DOT. Gene ontology （GO） function enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis were performed for differentially expressed genes. The common differentially expressed genes between 2 groups were analyzed， and mRNA expressions of six key genes were validated. RESULTS： Different doses of DOT could reverse the reduction of body weight， the increase of FINS and IR， the reduction of the times and rate of penile erection， the decrease of eNOS and cGMP contents in penile cavernous tissue of DIED model rats; above indexes of DIED model rats were reversed significantly after treated with high-dose of DOT （P<0.05 or P<0.01）. 125， 250， 500 μg/L DOT could significantly improve the activity of high-glucose damaged MCECs （P<0.05 or P<0.01）. RNA-Seq technology showed that compared with normal MCECs， a total of 48 differentially expressed genes were found in high-glucose damaged MCECs. Compared with high-glucose damaged MCECs， a total of 779 differentially expressed genes were found in MCECs treated with DOT. The differentially expressed genes of 2 groups were mainly cellular process in biological process annotation， cellular part in cell component annotation and binding molecular function in molecular function annotation， which were mainly enriched in extracellular matrix receptor interaction pathway， mismatch repair pathway， phosphatidylinositol 3 kinase-protein kinase B （PI3K-Akt） signal pathway and so on. Among differentially expressed genes of 2 groups， 13 common differentially expressed genes such as Aldh1a1， Abcc5， Tac1 were found. DOT could significantly reverse the expression of the above common differentially expressed genes in high-glucose damaged MCECs. After validation， DOT could significantly reverse the mRNA expression of TGF-β3， Txnip， Aldh1a1， Loxl1， Mt1 and Mt2 in high-glucose damaged MCECs. CONCLUSIONS： DOT could improve the symptom of DIED model rats， the mechanism of which may be related to biological pathway of inhibiting fibrosis and reducing oxidative stress， so as to improve the endothelial function of cavernous body.

KEYWORDS? ?Yam protein; Diabetes-induced erectile dysfunction; RNA-Seq technology; Fibrosis; Oxidative stress; Differentially expressed genes

糖尿病性勃起功能障礙（diabetic erectile dysfunction，DIED）是糖尿病的常見并發(fā)癥，發(fā)病率高達(dá)50%～75%，嚴(yán)重影響了患者的生活質(zhì)量[1-3]。高血糖引起的機(jī)體氧化應(yīng)激、纖維化是致使內(nèi)皮功能障礙，進(jìn)而誘發(fā)DIED的重要原因[4]。然而，由于內(nèi)皮功能障礙患者的內(nèi)源性一氧化氮（NO）生成率較低，致使治療勃起功能障礙的“黃金藥物”——5型磷酸二酯酶抑制劑對(duì)DIED的療效較差[5-7]。因此，研發(fā)可有效防治DIED的新型藥物具有重要意義。

山藥是薯蕷科植物薯蕷Dioscorea opposita Thunb.的根莖，入腎經(jīng)，是《金匱要略》《圣濟(jì)總錄》等醫(yī)學(xué)經(jīng)典著作中治療陽痿、消渴等病癥的臨床常用藥[8-10]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)，山藥總蛋白能夠通過改善腎陽虛模型大鼠睪丸組織纖維化和氧化應(yīng)激，發(fā)揮治療腎陽虛型勃起功能障礙的作用[11]。然而，目前關(guān)于山藥蛋白防治DIED、改善內(nèi)皮功能的研究幾近空白，且發(fā)揮作用的有效物質(zhì)基礎(chǔ)尚不明確。在以往的研究中，多數(shù)是以人臍靜脈內(nèi)皮細(xì)胞作為研究高糖所致內(nèi)皮功能損傷的體外模型，但其并不能準(zhǔn)確地模擬海綿體內(nèi)皮細(xì)胞的微血管環(huán)境。因此，本研究以從山藥總蛋白中分離、純化得到的高純度山藥蛋白——DOT為研究對(duì)象，通過建立大鼠DIED模型，考察DOT對(duì)模型大鼠的干預(yù)作用，以及DOT對(duì)模型大鼠內(nèi)皮功能的影響;在此基礎(chǔ)上，采用Matrigel 3D技術(shù)分離、培養(yǎng)小鼠海綿體內(nèi)皮細(xì)胞（MCECs），然后利用高糖誘導(dǎo)致MCECs損傷，在體外模擬糖尿病誘導(dǎo)的內(nèi)皮功能障礙模型，探討DOT對(duì)高糖損傷MCECs的恢復(fù)作用;然后，進(jìn)一步采用轉(zhuǎn)錄組測(cè)序（RNA-Seq）技術(shù)，從分子水平分析DOT對(duì)內(nèi)皮功能的保護(hù)作用機(jī)制，從改善內(nèi)皮功能角度為DOT防治DIED的新治療靶點(diǎn)研究提供參考。

1 材料

1.1 主要儀器

AL204型電子天平、FE20型pH計(jì)均購(gòu)自德國(guó)? ?Mettler-Toledo公司;Mini Protean型蛋白電泳儀、CFX型實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（qPCR）儀購(gòu)自美國(guó)Bio- Rad公司;iBrightTMFL1000型凝膠成像系統(tǒng)、ACCU- CHEK型血糖儀均購(gòu)自上海羅氏制藥有限公司;3111型CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱購(gòu)自美國(guó)Thermo Fisher Scientific公司;EVOS型數(shù)碼倒置顯微鏡購(gòu)自美國(guó)AMG公司;Infnite 200 PRO型酶標(biāo)儀購(gòu)自美國(guó)Life Sciences公司;HiSeq 2500型基因測(cè)序儀購(gòu)自美國(guó)Illumina公司;EVOS FL Auto型全自動(dòng)熒光顯微鏡購(gòu)自美國(guó)Life Technologies公司;WP-UO-YJ-40型超純水機(jī)購(gòu)自四川沃特爾水處理設(shè)備有限公司。

1.2 主要藥品與試劑

DOT（批號(hào)CM202010003，純度99.9%）由長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)藥大健康創(chuàng)新中心制備;乙二胺四乙酸（EDTA，批號(hào)20191221）、磷酸鹽緩沖液（PBS，批號(hào)20200428）均購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;一氧化氮合酶（eNOS）、環(huán)磷酸鳥苷（cGMP）、胰島素酶聯(lián)免疫吸附檢測(cè)（ELISA）試劑盒（批號(hào)均為202104）均購(gòu)自上海優(yōu)選生物科技有限公司;MCECs完全培養(yǎng)基（批號(hào)WH01112005XP）、Hank’s平衡鹽溶液（批號(hào)WH0111- 2005XP）均購(gòu)自武漢普諾賽生命科技有限公司;CCK-8檢測(cè)試劑盒（批號(hào)I02020141G14）購(gòu)自美國(guó)Invigentech公司;M199培養(yǎng)基（批號(hào)RNBJ1753）、青霉素-鏈霉素雙抗（批號(hào)A5955）、D-葡萄糖（批號(hào)SLCC4951）、鏈脲佐菌素（STZ，批號(hào)WXBD4533V）、阿撲嗎啡（APO，批號(hào)SLCB4167，純度≥98.5%）均購(gòu)自美國(guó)Sigma公司;Matrigel基質(zhì)膠（批號(hào)0048009）購(gòu)自美國(guó)Corning公司;兔源血小板內(nèi)皮細(xì)胞黏附分子1（PECAM-1）多克隆抗體（批號(hào)ab263899）、大鼠結(jié)蛋白（Desmin）多克隆抗體（批號(hào)ab178537）均購(gòu)自英國(guó)Abcam公司;Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔免疫球蛋白G（IgG）二抗、Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG二抗（批號(hào)分別為146644、133283）均購(gòu)自美國(guó)Jackson Immuno Research公司;總RNA提取試劑盒（批號(hào)W9113）購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司;RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒（批號(hào)AK71647A）、TB Green? Premix Ex TaqTM試劑盒（批號(hào)AJG1875A）均購(gòu)自日本Takara公司;其余試劑均為分析純或?qū)嶒?yàn)室常用規(guī)格，水為蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

本研究所用動(dòng)物為SPF級(jí)雄性SD大鼠[鼠齡為4～6周齡，體質(zhì)量為（200±20） g]和SPF級(jí)C57BL/6J雄性小鼠[鼠齡為4～6周齡，體質(zhì)量為（18±2） g]，均由長(zhǎng)春市億斯實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限責(zé)任公司提供，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)為SCXK（吉）2018-0007。動(dòng)物購(gòu)入后飼養(yǎng)于溫度（23±2） ℃、相對(duì)濕度（55±10）%的SPF級(jí)動(dòng)物房中。本研究動(dòng)物實(shí)驗(yàn)方案經(jīng)長(zhǎng)春中醫(yī)藥大學(xué)動(dòng)物研究倫理委員會(huì)批準(zhǔn)后實(shí)施（倫理批號(hào)為2020203）。

2 方法

2.1 DOT對(duì)DIED模型大鼠的防治作用考察

2.1.1 造模、分組與給藥 將60只SD大鼠適應(yīng)性飼養(yǎng)3 d后，分為正常對(duì)照組（n=10）和造模組（n=50）。其中，正常對(duì)照組大鼠飼以正常飼料，造模組大鼠飼以高糖高脂飼料。飼養(yǎng)4周后，正常對(duì)照組大鼠腹腔注射檸檬酸鈉緩沖液（pH=4.5），造模組大鼠腹腔注射40 mg/kg STZ誘導(dǎo)建立糖尿病模型（建模方案是在文獻(xiàn)[12-13]的基礎(chǔ)上加以適當(dāng)修改后確定的）。注射前大鼠均先禁食禁水12 h。腹腔注射7 d后，通過大鼠尾靜脈取血，測(cè)定其空腹血糖（FPG）值，以FPG>11.1 mmol/L為糖尿病建模成功標(biāo)準(zhǔn)[13]。取45只糖尿病造模成功的大鼠，按隨機(jī)數(shù)字表法隨機(jī)分為模型組，DOT低、中、高劑量組（0.3、0.6、0.9 mg/kg，劑量依據(jù)前期預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置）和西地那非組（陽性對(duì)照組，4.4 mg/kg，劑量依據(jù)文獻(xiàn)[14]設(shè)置），每組9只。正常對(duì)照組和模型組大鼠灌胃生理鹽水，各給藥組大鼠灌胃相應(yīng)藥物（均以生理鹽水為溶劑溶解），灌胃體積均為2 mL，每天1次，連續(xù)11周。在實(shí)驗(yàn)期間，正常對(duì)照組大鼠繼續(xù)飼以正常飼料;其余各組大鼠繼續(xù)飼以高糖高脂飼料，以誘導(dǎo)DIED的發(fā)生。

2.1.2 指標(biāo)檢測(cè) 實(shí)驗(yàn)期間，每周記錄大鼠體質(zhì)量和FPG值。末次給藥后，將大鼠放置在透明籠中適應(yīng)環(huán)境20 min，然后皮下注射100 μg/mL APO，觀察30 min內(nèi)大鼠陰莖的勃起次數(shù)，并計(jì)算勃起率[勃起率（%）=某組APO實(shí)驗(yàn)陽性（即陰莖有勃起）大鼠只數(shù)/同期該組大鼠只數(shù)×100%]。隨后，利用3%戊巴比妥鈉麻醉大鼠，于腹主動(dòng)脈取血;將血液在4 ℃下靜置20 min，然后以? ? ? 2 500 r/min離心10 min，收集上層血清。按胰島素ELISA試劑盒說明書方法測(cè)定大鼠血清中空腹胰島素（FINS）含量，并計(jì)算胰島素抵抗指數(shù)（IR）：IR=FPG×FINS/22.5[15]。取大鼠陰莖海綿體組織，在PBS中研碎，然后以3 000 r/min離心5 min，取上清液，分別按對(duì)應(yīng)試劑盒說明書方法測(cè)定大鼠陰莖海綿體組織中eNOS、cGMP含量。

2.2 MCECs的分離、培養(yǎng)

MCECs的分離、培養(yǎng)方案是在文獻(xiàn)[16]的基礎(chǔ)上加以適當(dāng)修改后確定的。將C57BL/6J小鼠脫頸處死，分離其陰莖海綿體組織，鏡下除去尿道及神經(jīng)血管束。將干凈的陰莖海綿體組織剪成1～2 mm3的小塊，置于預(yù)冷的24孔板底，每孔中補(bǔ)加200 μL含50 ng/mL血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子A（VEGF-A）的Matrigel基質(zhì)膠，包被后切塊;將24孔板置于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)14 d，在顯微鏡下觀察，直至細(xì)胞長(zhǎng)滿孔底;然后加入Dispase酶消化1 h，用10 mmol/L EDTA終止消化，以1 100 r/min離心5 min，收集細(xì)胞沉淀，置于MCECs完全培養(yǎng)基中培養(yǎng)，取第2～3代細(xì)胞進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3 MCECs的純度鑒定

采用免疫熒光法進(jìn)行鑒定。將MCECs按2×104? mL-1的密度接種在置有載玻片的6孔板中進(jìn)行細(xì)胞爬片，于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)2 d后，將爬有MCECs的載玻片置于4%多聚甲醛中，室溫固定15 min;加入含5%山羊血清的0.5% Triton X-100封閉30 min;加入PECAM-1一抗（內(nèi)皮細(xì)胞標(biāo)記物，稀釋比例為1 ∶ 1 000）和Desmin一抗（平滑肌細(xì)胞標(biāo)記物，稀釋比例為1 ∶? ? ? ? ? ? 1 000），于4 ℃孵育過夜;分別加入Alexa Fluor 488標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗、Alexa Fluor 594標(biāo)記的山羊抗大鼠IgG二抗（稀釋比例均為1 ∶ 1 000），于室溫孵育1 h;滴加DAPI試劑，于室溫避光染色5 min;用含熒光淬滅劑的封片液進(jìn)行封片，使用熒光顯微鏡觀察細(xì)胞染色情況（MCECs陽性染色呈綠色熒光，陰性染色呈紅色熒光）。統(tǒng)計(jì)陽性細(xì)胞數(shù)和細(xì)胞總數(shù)，并分析MCECs陽性率：陽性率（%）=陽性細(xì)胞數(shù)/細(xì)胞總數(shù)×100%。

2.4 DOT對(duì)高糖損傷MCECs活力的影響

采用CCK-8法進(jìn)行檢測(cè)。取第2～3代MCECs，以MCECs完全培養(yǎng)基制成密度為2×104 mL-1的細(xì)胞懸液，然后按每孔100 μL接種至96孔板中，常規(guī)培養(yǎng)。待細(xì)胞貼壁后，加入無血清M199培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，然后將細(xì)胞分為正常對(duì)照組（MCECs完全培養(yǎng)基）、高糖組（30 mmol/L D-葡萄糖）和DOT低、中、高濃度組（30 mmol/L D-葡萄糖+125、250、500 μg/mL DOT，濃度根據(jù)預(yù)實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)置5個(gè)復(fù)孔;并設(shè)置空白組（不加細(xì)胞）。各組細(xì)胞加藥或MCECs完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)48 h后，在各孔中分別加入10 μL CCK-8試劑，于室溫孵育1 h，然后用酶標(biāo)儀在450 nm波長(zhǎng)處測(cè)定各孔的光密度（OD）值，并計(jì)算細(xì)胞活力：細(xì)胞活力（%）=（實(shí)驗(yàn)組OD值-空白組OD值）/（正常對(duì)照組OD值-空白組OD值）×100%。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.5 MCECs中總RNA提取及cDNA文庫(kù)構(gòu)建

取第2～3代MCECs，以MCECs完全培養(yǎng)基制成密度為2×104 mL-1的細(xì)胞懸液，然后按每孔2 mL接種至6孔板中，常規(guī)培養(yǎng)24 h。棄去原培養(yǎng)基，每孔中加入2 mL無血清M199培養(yǎng)基饑餓培養(yǎng)24 h，隨后將細(xì)胞分為正常對(duì)照組（MCECs完全培養(yǎng)基）、高糖組（30 mmol/L D-葡萄糖）、DOT組（30 mmol/L D-葡萄糖+250 μg/mL DOT，DOT濃度依據(jù)細(xì)胞活力實(shí)驗(yàn)結(jié)果設(shè)置），每組設(shè)置3個(gè)復(fù)孔。各組細(xì)胞加藥或MCECs完全培養(yǎng)基常規(guī)培養(yǎng)48 h后，收集細(xì)胞，按照總RNA提取試劑盒說明書方法提取細(xì)胞中總RNA。用帶有Oligo（dT）的磁珠富集真核生物的mRNA，以片段化的mRNA為模板合成雙鏈cDNA，并通過PCR實(shí)驗(yàn)富集得到各組MCECs的cDNA文庫(kù)（cDNA文庫(kù)的構(gòu)建委托諾禾致源生物科技有限公司完成）。使用基因測(cè)序儀對(duì)建好的文庫(kù)進(jìn)行測(cè)序，對(duì)測(cè)序得到的原始數(shù)據(jù)（raw data）進(jìn)行過濾，去除帶接頭（adapter）和低質(zhì)量讀段（reads）的數(shù)據(jù)，得到待分析數(shù)據(jù)（clean reads），并統(tǒng)計(jì)測(cè)序質(zhì)量值大于20、30的堿基占總體堿基的百分比。

2.6 MCECs差異表達(dá)基因篩選及功能富集分析

使用HISAT v2.0.4軟件將clean reads比對(duì)到小鼠參考基因組，使用RSEM v1.2.12軟件計(jì)算基因和轉(zhuǎn)錄本表達(dá)水平。采用possion Dis算法進(jìn)行差異表達(dá)基因檢測(cè)，以差異倍數(shù)|fold change（FC）|≥1.2且P≤0.001為標(biāo)準(zhǔn)，分別篩選正常對(duì)照組與高糖組、高糖組與DOT組MCECs的差異表達(dá)基因，利用R語言包中的ggplot2包繪制差異基因火山圖。通過Cluster Profiler R 4.0.2軟件中的phyper函數(shù)實(shí)現(xiàn)差異表達(dá)基因的基因本體（GO）功能富集分析和京都基因與基因組百科全書（KEGG）通路富集分析，以錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）≤0.01為顯著富集[17]。在得到的兩組差異表達(dá)基因及顯著富集通路中，篩選出DOT作用后能夠顯著逆轉(zhuǎn)的基因及信號(hào)通路，以探討DOT的可能作用靶點(diǎn)及通路。

2.7 關(guān)鍵基因的表達(dá)情況驗(yàn)證

采用qPCR法對(duì)與纖維化、氧化應(yīng)激相關(guān)的6個(gè)關(guān)鍵基因（TGF-β3、Txnip、Aldh1a1、Loxl1、Mt1、Mt2）在mRNA水平上進(jìn)行驗(yàn)證。取“2.6”項(xiàng)下總RNA，按照RNA逆轉(zhuǎn)錄試劑盒方法將總RNA反轉(zhuǎn)錄合成cDNA。以cDNA為模板，按照TB Green? Premix Ex TaqTM試劑盒方法進(jìn)行PCR擴(kuò)增（引物序列及擴(kuò)增產(chǎn)物大小如表1所示）。PCR反應(yīng)條件為：95 ℃預(yù)變性30 s;95 ℃變性5 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共40個(gè)循環(huán)。反應(yīng)體系（共25 μL）為：SYBR 12.5 μL，DEPC 8 μL，cDNA模版 2.5 μL，上、下游引物各1 μL。以GAPDH為內(nèi)參，采用2-ΔΔCt法計(jì)算各基因的表達(dá)水平（式中，Ct表示每個(gè)反應(yīng)管內(nèi)熒光信號(hào)強(qiáng)度達(dá)到設(shè)定閾值時(shí)所經(jīng)歷的循環(huán)次數(shù)）。實(shí)驗(yàn)重復(fù)3次。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用GraphPad Prism v 6.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。計(jì)量資料以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析和Tukey-Kramer檢驗(yàn)。檢驗(yàn)水準(zhǔn)α=0.05。

3 結(jié)果

3.1 DOT對(duì)DIED模型大鼠的防治作用考察結(jié)果

3.1.1 體質(zhì)量、FPG值、FINS和IR測(cè)定結(jié)果 造模前和灌胃前，各組大鼠的體質(zhì)量、FPG值差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P>0.05）。灌胃結(jié)束后，與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠的體質(zhì)量顯著減少（P<0.01），F(xiàn)PG值、FINS和IR均顯著升高（P<0.01）。與模型組比較，DOT低劑量組大鼠的FINS顯著降低（P<0.01）;DOT中、高劑量組和西地那非組大鼠的體質(zhì)量均顯著增加（P<0.01）;DOT中、高劑量組大鼠的FINS、IR均顯著降低（P<0.01）。各組大鼠的體質(zhì)量、FPG值、FINS和IR測(cè)定結(jié)果見表2。

3.1.2 勃起情況及陰莖海綿體組織中eNOS、cGMP含量測(cè)定結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，模型組大鼠勃起次數(shù)顯著減少（P<0.01），勃起率和陰莖海綿體組織中eNOS、cGMP含量均顯著降低（P<0.01）。與模型組比較，DOT中劑量組大鼠勃起率和陰莖海綿體組織中eNOS含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;DOT高劑量組大鼠勃起次數(shù)顯著增加（P<0.01），勃起率和陰莖海綿體組織中eNOS、cGMP含量均顯著升高（P<0.05或P<0.01）;西地那非組大鼠勃起次數(shù)顯著增加（P<0.05），勃起率和陰莖海綿體組織中cGMP含量均顯著升高（P<0.01）。各組大鼠勃起情況和陰莖海綿體組織中eNOS、cGMP含量測(cè)定結(jié)果見表3。

3.2 MCECs的純度測(cè)定結(jié)果

熒光顯微鏡下可見，細(xì)胞核呈現(xiàn)出藍(lán)色卵石狀的橢圓形輪廓，絕大多數(shù)細(xì)胞呈PECAM-1染色陽性。經(jīng)分析，MCECs的陽性率在90%以上，說明細(xì)胞純度較高，可用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。MCECs的免疫熒光染色圖見圖1。

3.3 DOT對(duì)高糖損傷MCECs活力的影響考察結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，高糖組MCECs的活力顯著降低（P<0.01）;與高糖組比較，DOT低、中、高濃度組MCECs的活力均顯著升高（P<0.05或P<0.01），其中以DOT低濃度組MCECs的活力最高。各組MCECs的活力測(cè)定結(jié)果見圖2。

3.4 MCECs的cDNA文庫(kù)測(cè)序數(shù)據(jù)評(píng)估結(jié)果

從正常對(duì)照組、高糖組和DOT組MCECs中分別得到1.52×108、1.46×108、1.51×108個(gè)clean reads，對(duì)應(yīng)的總大?。╟lean reads的個(gè)數(shù)×長(zhǎng)度）分別為7.6 205、7.3 052、7.5 404 Gb。各組clean reads中，測(cè)序質(zhì)量值大于20的堿基在所有堿基中的比例≥98%，質(zhì)量值大于30 的堿基在所有堿基中的比例≥94%，GC堿基對(duì)的含有量在各樣本中基本保持不變。利用HISAT v2.0.4軟件比對(duì)小鼠參考基因組發(fā)現(xiàn)，各組clean reads比對(duì)到基因組中的比率在95.52%～96.25%范圍內(nèi)。以上結(jié)果說明，本研究測(cè)序質(zhì)量較好，測(cè)序數(shù)據(jù)符合后續(xù)分析要求[18]。

3.5 MCECs的差異表達(dá)基因篩選及功能富集分析結(jié)果

3.5.1 差異表達(dá)基因篩選結(jié)果 與正常對(duì)照組比較，高糖組MCECs中共有48個(gè)差異表達(dá)基因，其中34個(gè)基因表達(dá)上調(diào)、14個(gè)基因表達(dá)下調(diào);與高糖組比較，DOT組MCECs中共有779個(gè)差異表達(dá)基因，其中336個(gè)基因表達(dá)上調(diào)、443個(gè)基因表達(dá)下調(diào)。差異表達(dá)基因篩選的火山圖見圖3。

3.5.2 GO功能富集分析結(jié)果 通過對(duì)正常對(duì)照組與高糖組MCECs中48個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，共得到47條GO功能注釋，其中53.19%（25條）的注釋為生物學(xué)過程、29.79%（14條）的注釋為細(xì)胞組分、17.02%（8條）的注釋為分子功能。通過對(duì)高糖組與DOT組MCECs中779個(gè)差異表達(dá)基因進(jìn)行GO功能富集分析，共得到57條GO功能注釋，其中49.12%（28條）的注釋為生物學(xué)過程、31.58%（18條）的注釋為細(xì)胞組分、19.30%（11條）的注釋為分子功能。兩組差異表達(dá)基因在生物學(xué)過程注釋中均以細(xì)胞過程（cellular process）為主，在細(xì)胞組分注釋中均以細(xì)胞部分（cell part）為主，在分子功能注釋中均以綁定分子功能（binding）為主。差異表達(dá)基因的GO功能富集分析結(jié)果見圖4。

3.5.3 KEGG通路富集分析結(jié)果 通過對(duì)正常對(duì)照組與高糖組MCECs中差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，48個(gè)差異表達(dá)基因可以映射到102條不同的生物途徑。其中，顯著富集的途徑有8條，包括蛋白質(zhì)消化吸收（protein digestion and absorption）、甘油脂類新陳代謝（glycerolipid metabolism）、甲狀腺激素合成（thyroid hormone synthesis）等。通過對(duì)高糖組與DOT組MCECs中差異表達(dá)基因進(jìn)行KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，779個(gè)差異表達(dá)基因可以映射到308條不同的生物途徑。其中，顯著富集的途徑有84條，包括黏著斑通路（focal adhesion）、細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路（ECM-receptor interaction）、癌癥通路（pathways in cancer）等。MCECs差異表達(dá)基因的KEGG通路富集分析結(jié)果見圖5。

3.5.4 DOT對(duì)高糖損傷MCECs的多靶點(diǎn)調(diào)控分析結(jié)果 從正常對(duì)照組與高糖組、高糖組與DOT組MCECs中共篩選得到Aldh1a1、Abcc5、Tac1等13個(gè)共同的差異表達(dá)基因。這些差異表達(dá)基因產(chǎn)生的調(diào)控作用涉及細(xì)胞增殖、細(xì)胞遷移、氧化還原、應(yīng)激反應(yīng)、代謝等生物過程，并涉及細(xì)胞外基質(zhì)受體相互作用通路、肌動(dòng)蛋白細(xì)胞骨架調(diào)控通路（regulation of actin cytoskeleton）、錯(cuò)配修復(fù)通路（mismatch repair）、磷脂酰肌醇3激酶-蛋白激酶B（PI3K-Akt）信號(hào)通路等4條顯著富集通路。與模型組比較，DOT組MCECs中上述差異表達(dá)基因的表達(dá)均被顯著回調(diào)，結(jié)果見表4。

3.6 MCECs差異表達(dá)基因的驗(yàn)證結(jié)果

與正常對(duì)照組比較，高糖組MCECs中Txnip、? ? ? ?Aldh1a1、Loxl1、TGF-β3等基因的mRNA表達(dá)均顯著上調(diào)（P<0.05或P<0.01），Mt1、Mt2等基因的mRNA表達(dá)均顯著下調(diào)（P<0.05或P<0.01）;與高糖組比較，DOT組MCECs中上述基因的mRNA表達(dá)均被顯著逆轉(zhuǎn)（P<0.01）。該驗(yàn)證結(jié)果與RNA-Seq分析結(jié)果一致，說明測(cè)序結(jié)果真實(shí)可信。DOT對(duì)高糖損傷MCECs中6個(gè)關(guān)鍵基因mRNA表達(dá)的驗(yàn)證結(jié)果見表5。

4 討論

隨著糖尿病病程的延長(zhǎng)，糖尿病患者的勃起功能進(jìn)行性下降，造成陰莖組織出現(xiàn)嚴(yán)重病理損傷，而高血糖引發(fā)的內(nèi)皮功能障礙是誘發(fā)、加重糖尿病患者DIED的關(guān)鍵因素[18]。因此，發(fā)現(xiàn)可有效改善內(nèi)皮功能障礙的活性物質(zhì)已成為防治DIED的重中之重。為了解決上述問題，本研究首先建立糖尿病大鼠模型，并飼以高糖高脂飼料來誘發(fā)DIED，初步探究DOT對(duì)DIED的防治作用，并選擇臨床治療勃起功能障礙的一線藥物西地那非作為陽性對(duì)照藥物。

體質(zhì)量減輕、血糖和IR升高、勃起功能異常是DIED的主要表現(xiàn)。控制血糖是DIED的治療手段之一，可防止高血糖對(duì)血管功能的進(jìn)一步損害;IR升高可致使胰島素不能發(fā)揮其生物學(xué)效應(yīng)，使機(jī)體靶組織器官對(duì)葡萄糖的攝取和利用能力降低，從而導(dǎo)致內(nèi)皮功能障礙[19-20]。本研究結(jié)果顯示，與模型組比較，DOT各劑量組大鼠的體質(zhì)量、勃起率均不同程度地升高，IR均不同程度地降低。這提示，DOT對(duì)DIED模型大鼠的癥狀具有一定的改善作用。相關(guān)勃起生理機(jī)制研究表明，內(nèi)皮細(xì)胞可在eNOS催化下合成并分泌活性物質(zhì)NO，并進(jìn)入海綿體平滑肌抑制cGMP水解，引起海綿體平滑肌松弛，從而促使陰莖勃起[21]。本研究結(jié)果顯示，高劑量DOT可顯著升高DIED模型大鼠陰莖海綿體組織中eNOS、cGMP含量，表明DOT對(duì)DIED的防治作用可能是通過改善內(nèi)皮功能實(shí)現(xiàn)的。

為進(jìn)一步探究DOT改善高糖所致內(nèi)皮功能紊亂的作用與機(jī)制，本研究選擇位于海綿體內(nèi)表面的原代MCECs建立體外細(xì)胞模型來進(jìn)行相關(guān)研究。MCECs是維持海綿體功能最重要的細(xì)胞之一，是研究DIED內(nèi)皮功能的最佳選擇[22-23]。在原代MCECs的分離方式上，本研究選擇了一種新穎的非酶分離方法——Matrigel 3D技術(shù)。該技術(shù)能模擬體內(nèi)細(xì)胞生長(zhǎng)的三維環(huán)境，使MCECs與生長(zhǎng)因子直接接觸而誘導(dǎo)MCECs從組織中爬出，可保證MCECs的原有形態(tài)及功能特性，且方法操作省時(shí)、分離純度高、重復(fù)性好[24]。在以上研究基礎(chǔ)上，本研究又利用高糖誘導(dǎo)模擬糖尿病環(huán)境下MCECs損傷狀態(tài)，并證明了DOT能夠通過提高高糖損傷MCECs的活力來發(fā)揮其改善內(nèi)皮功能障礙的作用。

轉(zhuǎn)錄組學(xué)可從整體水平上研究基因的表達(dá)情況，從“多靶點(diǎn)-多通路-多途徑”闡明藥物的作用機(jī)制[25-26]。為深入分析DOT改善內(nèi)皮功能的可能作用途徑，本研究對(duì)MCECs的轉(zhuǎn)錄組差異表達(dá)基因進(jìn)行重點(diǎn)分析。結(jié)果顯示，與正常對(duì)照組比較，高糖組MCECs有48個(gè)差異表達(dá)基因;與高糖組比較，DOT組MCECs有779個(gè)差異表達(dá)基因。進(jìn)一步通過GO功能富集分析和KEGG通路富集分析發(fā)現(xiàn)，DOT對(duì)內(nèi)皮功能障礙的恢復(fù)作用是通過調(diào)控多種功能基因和信號(hào)通路實(shí)現(xiàn)的。為明確DOT發(fā)揮作用的靶點(diǎn)及生理過程，本研究對(duì)獲得的兩組細(xì)胞（正常細(xì)胞與高糖損傷細(xì)胞、高糖損傷細(xì)胞與DOT處理細(xì)胞）中差異表達(dá)基因數(shù)據(jù)進(jìn)行深度挖掘分析，發(fā)現(xiàn)有13個(gè)重疊基因及4條顯著富集信號(hào)通路，這些基因及信號(hào)通路可能是DOT改善內(nèi)皮功能障礙、防治DIED的關(guān)鍵靶點(diǎn)和途徑。綜合以上分析及本課題組前期研究成果，本研究篩選出了能被DOT顯著調(diào)控的6個(gè)關(guān)鍵基因進(jìn)行深入分析，包括與纖維化、氧化應(yīng)激相關(guān)的TGF-β3、Txnip、Aldh1a1、Loxl1、Mt1、Mt2。

膠原合成增加引起的纖維化因子表達(dá)上調(diào)和海綿狀纖維化是誘發(fā)勃起功能障礙的重要病理、生理機(jī)制[27]。在眾多纖維化因子中，轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子β（TGF-β）被認(rèn)為是與纖維生成最為相關(guān)的細(xì)胞因子，其可引起組織纖維化，從而導(dǎo)致多種器官的功能損害[28]。TGF-β家族包括TGF-β1、TGF-β2、TGF-β3 3種亞基，其中TGF-β3能夠促使膠原大量沉積，進(jìn)而引起纖維化的發(fā)生[29]。此外，TGF-β1可通過激活其下游蛋白表達(dá)，造成內(nèi)皮細(xì)胞纖維化，從而抑制MCECs的遷移和增殖[30]。本研究發(fā)現(xiàn)，經(jīng)DOT處理后，高糖損傷MCECs中TGF-β3基因的mRNA表達(dá)顯著下調(diào)，表示DOT可能是通過抑制TGF- β3基因的表達(dá)來抑制內(nèi)皮細(xì)胞纖維化，從而發(fā)揮其改善內(nèi)皮功能障礙的作用。

據(jù)報(bào)道，長(zhǎng)期升高的葡萄糖水平可促使細(xì)胞產(chǎn)生活性氧（ROS）。當(dāng)ROS產(chǎn)生后，一方面其可干擾NO的生物利用度，介導(dǎo)內(nèi)皮功能障礙;另一方面其可誘導(dǎo)內(nèi)皮細(xì)胞凋亡，進(jìn)而破壞血管組織內(nèi)穩(wěn)態(tài)，影響血管舒張和陰莖勃起[31-32]。硫氧還蛋白相互作用蛋白（Txnip）是調(diào)節(jié)糖和脂代謝的中樞蛋白，其過表達(dá)可引起ROS水平升高、NO水平降低，進(jìn)而啟動(dòng)并放大氧化應(yīng)激反應(yīng)[33-34]。乙醛脫氫酶1家族成員a1（Aldh1a1）是一種多功能酶，其在氧化應(yīng)激狀態(tài)下可在細(xì)胞中聚集，從而緩解氧化應(yīng)激介導(dǎo)的細(xì)胞損傷;氧化應(yīng)激水平降低后，細(xì)胞中Aldh1a1的表達(dá)量也會(huì)隨之減少[35-36]。類賴氨酰氧化酶1（Loxl1）是保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境穩(wěn)定的關(guān)鍵酶，在氧化應(yīng)激狀態(tài)下細(xì)胞中Loxl1的含量會(huì)明顯升高[37]。金屬硫蛋白1（Mt1）和Mt2作為細(xì)胞內(nèi)的抗氧化因子可直接發(fā)揮清除ROS的作用，參與了生物體的多種保護(hù)性應(yīng)激反應(yīng)[38-41]。本研究結(jié)果顯示，DOT能夠顯著逆轉(zhuǎn)高糖損傷MCECs中Txnip、Aldh1a1、Loxl1等基因mRNA表達(dá)的上調(diào)，以及Mt1、Mt2等基因mRNA表達(dá)的下調(diào)。以上結(jié)果提示，DOT對(duì)內(nèi)皮功能的改善作用與降低氧化應(yīng)激反應(yīng)相關(guān)。

綜上所述，DOT對(duì)DIED模型大鼠的癥狀具有改善作用;其作用機(jī)制可能與抑制纖維化、降低氧化應(yīng)激等生物學(xué)途徑，從而改善海綿體內(nèi)皮功能有關(guān)。本研究為DOT改善高糖引起的內(nèi)皮功能障礙提供了治療靶點(diǎn)，也為DOT防治DIED的發(fā)生發(fā)展提供了實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)支撐。但本研究對(duì)于DOT防治DIED的分子機(jī)制研究尚不深入，有待進(jìn)一步完善。

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（收稿日期：2021-06-15 修回日期：2021-10-23）

（編輯：林 靜）