雨生紅球藻中代謝物及礦質(zhì)元素對(duì)高光的響應(yīng)

王曉丹，劉寶玲，李潤植

（山西農(nóng)業(yè)大學(xué)農(nóng)學(xué)院，山西太谷030801）

藻類植物生活在復(fù)雜多變的棲息地，經(jīng)常要適應(yīng)極其惡劣的環(huán)境。它們的代謝受到水溫、鹽分、光照和營養(yǎng)成分等因素的影響，為了生存，被迫快速適應(yīng)不斷變化的環(huán)境條件，產(chǎn)生大量具有生物活性的次生代謝物[1]。在逆境條件下，雨生紅球藻（Haematococcus pluvialis）能大量積累蝦青素及一些化合物，其中，蝦青素具有抗氧化、抗炎、抗癌和增強(qiáng)免疫等活性，被廣泛應(yīng)用于功能型營養(yǎng)食品和藥物中。因此，研究逆境條件下，雨生紅球藻中這些活性物質(zhì)合成積累機(jī)制以及建立相應(yīng)的調(diào)控技術(shù)，促進(jìn)微藻高效生產(chǎn)這些有益生物資源，以達(dá)到商業(yè)化應(yīng)用是目前研究的一個(gè)活躍領(lǐng)域[2]。

應(yīng)對(duì)不利的環(huán)境條件，植物（微藻）會(huì)在細(xì)胞和分子水平上利用各種機(jī)制來應(yīng)對(duì)[3]。前期的研究表明，雨生紅球藻797在高光脅迫條件下，細(xì)胞內(nèi)產(chǎn)生蝦青素，同時(shí)發(fā)生細(xì)胞自噬對(duì)抗活性氧（reactive oxide species，ROS），總脂肪酸的含量增加，脂肪酸成分發(fā)生改變，飽和脂肪酸增加而不飽和脂肪酸降低[4]。雨生紅球藻中氨基酸和無機(jī)礦質(zhì)元素是否也協(xié)同蝦青素參與逆境調(diào)控卻未知。前人研究表明，脯氨酸在花生[5]、柵藻（Scenedesmus quadricauda）[6]和嗜鹽真菌（halophile fungi）[7]中，具有抗逆活性。筆者研究17種水解氨基酸，以探討高光誘導(dǎo)雨生紅球藻中蝦青素積累時(shí)，脯氨酸是否也參與對(duì)抗高光的氧化脅迫，以及其他氨基酸的代謝變化。一些藻類能吸收周圍水域中的可吸收元素，一些元素在藻細(xì)胞內(nèi)的積累量能達(dá)到其生活水域中該元素濃度的數(shù)倍[8]。所以，在研究雨生紅球藻適應(yīng)環(huán)境脅迫下，有機(jī)化合物（蝦青素）積累變化的同時(shí)，也需要分析細(xì)胞體內(nèi)氨基酸和無機(jī)元素的動(dòng)態(tài)變化。

本試驗(yàn)對(duì)雨生紅球藻797藻株在高光脅迫條件下，藻細(xì)胞形態(tài)、細(xì)胞中蝦青素含量、氨基酸和無機(jī)元素等動(dòng)態(tài)變化進(jìn)行分析，以期深入揭示雨生紅球藻細(xì)胞脅迫應(yīng)激的生理生化反應(yīng)機(jī)制。

1 材料和方法

1.1 試驗(yàn)材料

1.1.1 藻種及培養(yǎng)基 雨生紅球藻（797株系）購自上海光語生物科技有限公司。藻細(xì)胞以光自養(yǎng)的方式培養(yǎng)在無菌的BG-11培養(yǎng)基中[9]。

1.1.2 主要儀器 氨基酸自動(dòng)分析儀（Biochrom 30+）；正置顯微鏡（奧林帕斯，BX53，日本）；原子吸收光譜儀（德國耶拿Zip 700型）；SP-Max 2300A2光吸收型全波長酶標(biāo)儀（上海閃譜生物科技有限公司）；血球計(jì)數(shù)板，上海求精生化試劑儀器有限公司；人工氣候箱（寧波東南儀器有限公司）。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 雨生紅球藻797的培養(yǎng) 在人工氣候箱中靜置培養(yǎng)，正常條件及高光誘導(dǎo)條件下的培養(yǎng)參照文獻(xiàn)[4]進(jìn)行。

1.2.2 雨生紅球藻797生長曲線的測(cè)定 在紫外消殺4 h以上的超凈工作臺(tái)中，進(jìn)行雨生紅球藻的接種。無菌條件下，吸取10 mL雨生紅球藻藻液加入到滅菌的250 mL錐形瓶中（含100 mL BG-11液體培養(yǎng)基），在人工氣候箱中靜置培養(yǎng)。每間隔2 d進(jìn)行一次取樣，使用血細(xì)胞計(jì)在正置顯微鏡下進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)[9]。同時(shí)，利用酶標(biāo)儀在680 nm波長下測(cè)定藻液的吸光度值（OD680）。試驗(yàn)設(shè)置3個(gè)平行，每個(gè)平行測(cè)定3次。

1.2.3 細(xì)胞形態(tài)的顯微觀察 在高光脅迫條件下處理雨生紅球藻，在0、7、10、13、16和19 d取各試驗(yàn)組的懸浮藻液1 mL，放入1.5 mL離心管中，放置1 min左右，藻體沉降到離心管底。吸取10 μL沉降的藻液滴到載玻片上，蓋上蓋玻片，在正置顯微鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并拍照采集圖片。

1.3 測(cè)定項(xiàng)目及方法

1.3.1 蝦青素的測(cè)定 分別取高光脅迫7、10、13、16和19 d的藻細(xì)胞凍干樣品各5 mg左右，使用二甲基亞砜提取[4]后，采用分光光度法測(cè)定蝦青素的質(zhì)量濃度[10]。

式中，CA為蝦青素的質(zhì)量濃度，OD530為530 nm處的吸光度值，m（mg）為凍干細(xì)胞樣品的質(zhì)量。

1.3.2 氨基酸的測(cè)定 稱取0.05 g左右的雨生紅球藻凍干藻粉，采用酸水解法測(cè)定17種氨基酸[11]。

1.3.3 粗蛋白的測(cè)定 稱取100 mg左右的凍干藻粉，使用南京建成生物公司的試劑盒進(jìn)行測(cè)定。按照試劑盒的說明進(jìn)行總蛋白的測(cè)定，使用酶標(biāo)儀測(cè)定樣品、雙蒸水和蛋白標(biāo)準(zhǔn)品的OD595值。

1.3.4 礦質(zhì)元素的測(cè)定

1.3.4.1 樣品的消解 按照國標(biāo)GB/T5009.12—2003、GB/T5009.15—2003和GB/T5009.17—2003中的方法進(jìn)行消煮，待消煮液冷卻后轉(zhuǎn)移入10 mL容量瓶，加入1%（m/V）SrCl21 mL，再用1%（V/V）的HCl定容到10 mL。同時(shí)，做2個(gè)試劑空白。

1.3.4.2 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制 在10 mL的容量瓶中加入1 mL 1%的SrCl2和各濃度梯度對(duì)應(yīng)的標(biāo)準(zhǔn)溶液量，再用1%的HCl定容到刻度。標(biāo)準(zhǔn)溶液購買自鋼鐵研究總院分析測(cè)試研究所鋼研納克檢測(cè)技術(shù)有限公司，屬于國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)。使用原子吸收光譜儀的火焰法進(jìn)行測(cè)定。各元素標(biāo)準(zhǔn)曲線的相關(guān)系數(shù)（r）≥0.98。

1.4 數(shù)據(jù)分析

所有數(shù)據(jù)采用SPSS 20統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。采用t檢驗(yàn)來分析培養(yǎng)細(xì)胞處理組（誘導(dǎo)16 d）和對(duì)照組（指數(shù)生長中期）差異是否有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以*和**分別表示P≤0.05和P≤0.01[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 正常培養(yǎng)條件下，雨生紅球藻797生長密度的動(dòng)態(tài)變化

為了建立雨生紅球藻綠色生長階段的生長曲線以及OD680值和單位體積細(xì)胞個(gè)數(shù)的對(duì)應(yīng)關(guān)系，在正常培養(yǎng)條件下，每2 d取樣測(cè)定OD680值和進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。從圖1-A可以看出，雨生紅球藻797在OD680＝0.6左右時(shí)進(jìn)入指數(shù)生長中期，當(dāng)OD680達(dá)到0.759時(shí)，開始進(jìn)入穩(wěn)定期。在人工氣候箱中，用盛有100 mL BG-11培養(yǎng)基的250 mL錐形瓶培養(yǎng)該藻株，細(xì)胞密度最大可達(dá)4.167×105個(gè)細(xì)胞/mL。需要指出的是，一般來講，以分裂方式進(jìn)行繁殖的微藻等微生物，接種到適應(yīng)的液體培養(yǎng)基中，生長曲線會(huì)出現(xiàn)4個(gè)階段：緩慢生長期、對(duì)數(shù)增長期、穩(wěn)定期和凋亡期。本試驗(yàn)是以1∶10的比例進(jìn)行藻液接種，因此，沒有出現(xiàn)緩慢生長期（圖1-B）。此外，本試驗(yàn)測(cè)定雨生紅球藻綠色階段的生長情況，所以，也沒有檢測(cè)凋亡期。

利用作圖分析軟件origin 9.1，以測(cè)定生長曲線的雨生紅球藻藻液的OD680值為橫坐標(biāo)，細(xì)胞密度為縱坐標(biāo)，先建立OD680值和細(xì)胞密度對(duì)應(yīng)的散點(diǎn)圖，再進(jìn)行線性擬合。由圖2可知，在標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)條件下，綠色生長階段的雨生紅球藻797的OD680和細(xì)胞密度呈線性關(guān)系。OD680在0.1～0.9的范圍內(nèi)，符合朗伯-比爾定律，獲得的回歸方程為y＝-0.769 98＋5.891 81x，式中，y是細(xì)胞密度，即細(xì)胞個(gè)數(shù)，單位：105個(gè)細(xì)胞/mL，x是OD680測(cè)定的吸光度值，相關(guān)系數(shù)為r＝0.987 64。說明2個(gè)變量線性相關(guān)性顯著。

2.2 高光誘導(dǎo)對(duì)雨生紅球藻細(xì)胞形態(tài)和蝦青素含量的影響

從圖3、4可以看出，指數(shù)生長期（0 d）的雨生紅球藻797呈現(xiàn)綠色的球形或橢圓形；在高光誘導(dǎo)7 d時(shí)，雨生紅球藻797細(xì)胞都變成圓形，整體呈紅色，開始積累蝦青素，含量達(dá)0.59%；在高光誘導(dǎo)10 d時(shí)，雨生紅球藻797蝦青素基本充滿整個(gè)細(xì)胞，還能看到一點(diǎn)黃綠色在細(xì)胞周圍，蝦青素含量達(dá)到1.27%；在高光誘導(dǎo)13、16 d時(shí)，細(xì)胞中充滿蝦青素，雨生紅球藻797細(xì)胞呈現(xiàn)黑紅色，蝦青素含量分別達(dá)到2.17%和2.78%；高光誘導(dǎo)19 d時(shí)，蝦青素含量高達(dá)3.18%，整個(gè)細(xì)胞的邊緣變成亮紅色，細(xì)胞中夾雜黑紅色。表明隨著雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)蝦青素含量的增加，細(xì)胞形態(tài)、大小和顏色也發(fā)生改變。

2.4 高光脅迫下雨生紅球藻氨基酸含量和粗蛋白含量的動(dòng)態(tài)變化

從表1可以看出，在高光誘導(dǎo)條件下，雨生紅球藻797細(xì)胞中的脯氨酸含量極大增加，由指數(shù)生長中期（對(duì)照）的12.61 μg/mg增加到高光誘導(dǎo)16 d時(shí)的24.72 μg/mg，差異極顯著，增加了96.03%（P≤0.01）；而在高光誘導(dǎo)16 d時(shí)，與對(duì)照相比，其他氨基酸成分都明顯降低（P≤0.01）。其中，異亮氨酸＋亮氨酸和苯丙氨酸的含量分別降低了78.28%和77.75%；纈氨酸＋胱氨酸降低了39.13%；谷氨酸、蛋氨酸、組氨酸和精氨酸含量分別降低了58.40%、57.07%、59.19%和50.64%；其他氨基酸含量都下降了68.52%～73.47%。在高光誘導(dǎo)條件下，與大部分氨基酸含量都顯著下降相對(duì)應(yīng)，粗蛋白的含量也顯著降低，由對(duì)照的244.21 μg/mg降低到高光誘導(dǎo)16 d時(shí)的196.43 μg/mg，減少了19.57%（P≤0.01）。

表1 雨生紅球藻797在指數(shù)生長中期（對(duì)照）和蝦青素高積累期（誘導(dǎo)16 d）的氨基酸和粗蛋白含量 μg/mg

2.5 高光脅迫下雨生紅球藻797主要礦質(zhì)元素含量的動(dòng)態(tài)變化

從表2可以看出，與對(duì)照組相比，高光處理16 d的雨生紅球藻細(xì)胞中Ca和Mg含量都顯著增加（P≤0.01），Ca在雨生紅球藻細(xì)胞中的含量由0.740 μg/mg增加到1.680 μg/mg，增加了127.03%；雨生紅球藻細(xì)胞中Mg的含量由0.046 μg/mg增加到2.677 μg/mg，增加了5 719.5%。K、Na、Fe、Cu、Mn和Zn的含量都顯著降低（P≤0.01），分別比對(duì)照組降低了71.53%、60.64%、79.17%、54.55%、81.44%和41.33%。

表2 雨生紅球藻797在指數(shù)生長中期（對(duì)照）和蝦青素高積累期（誘導(dǎo)16 d）的礦質(zhì)元素含量 μg/mg

3 結(jié)論與討論

本研究表明，在雨生紅球藻797的綠色生長階段OD680和細(xì)胞個(gè)數(shù)之間存在強(qiáng)線性關(guān)系（r＝0.987 64）。在其他研究結(jié)果中也驗(yàn)證了綠藻的OD680和細(xì)胞個(gè)數(shù)之間存在很強(qiáng)的線性關(guān)系[13]。

在正常培養(yǎng)條件下，雨生紅球藻細(xì)胞是處于營養(yǎng)生長階段的能動(dòng)的綠色細(xì)胞。但是，在逆境條件下，雨生紅球藻細(xì)胞先是由能動(dòng)的綠色細(xì)胞變?yōu)椴荒軇?dòng)的綠色細(xì)胞，隨后，開始積累蝦青素變?yōu)椴荒軇?dòng)的紅色細(xì)胞，最后積累高量蝦青素的紅色孢子囊細(xì)胞形成[14]。本研究對(duì)綠色階段（指數(shù)生長中期）以及逆境高光誘導(dǎo)階段雨生紅球藻細(xì)胞形態(tài)的觀察與前人對(duì)雨生紅球藻營養(yǎng)生長階段及逆境條件下細(xì)胞形態(tài)變化的描述一致。

光是微藻的能量來源，在微藻的培養(yǎng)中起到重要作用。但是，持續(xù)的高光照不利于雨生紅球藻綠色階段細(xì)胞生物量的增長，因?yàn)槌掷m(xù)的高光照使雨生紅球藻細(xì)胞變成厚壁孢子而停止分裂[15]。所以，在本試驗(yàn)高光誘導(dǎo)的時(shí)間段內(nèi)（0～19 d），雨生紅球藻797細(xì)胞內(nèi)的蝦青素持續(xù)積累，以抵抗高光氧化產(chǎn)生的ROS對(duì)藻細(xì)胞的細(xì)胞膜、DNA和蛋白質(zhì)等的損傷[16]。

本研究表明，在高光誘導(dǎo)條件下，雨生紅球藻797細(xì)胞中脯氨酸的含量比對(duì)照組增加了96.03%。這是因?yàn)樵诓焕沫h(huán)境條件下，細(xì)胞通過改變脯氨酸代謝來保持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的平衡[17]。前人研究表明，雨生紅球藻在積累蝦青素的過程中，細(xì)胞內(nèi)的蛋白質(zhì)含量下降了36.7%[18]，并且蛋白質(zhì)的含量與氨基酸的含量成正相關(guān)。本試驗(yàn)中雨生紅球藻797藻株在高光脅迫下細(xì)胞大部分氨基酸的組分降低，粗蛋白的含量降低了24%。

在高光脅迫下，雨生紅球藻797細(xì)胞的Ca含量顯著增加（P≤0.01），這是因?yàn)橛晟t球藻細(xì)胞在逆境條件下形成厚壁孢子，鈣離子主要以果膠酸鈣的形式存在于細(xì)胞壁中，起到固定細(xì)胞壁和維持細(xì)胞形態(tài)的作用[19]。表明雨生紅球藻對(duì)高光脅迫產(chǎn)生了適應(yīng)機(jī)制，對(duì)鈣的吸收增加，以利于逆境脅迫信號(hào)的傳遞、細(xì)胞壁的增厚和維持細(xì)胞膜形態(tài)，防止高光毒害產(chǎn)生的ROS等有害物質(zhì)對(duì)細(xì)胞膜造成的破壞。

前人研究表明，缺Mg嚴(yán)重影響植物的光合作用[20]。本研究結(jié)果表明，雨生紅球藻797在高光條件下，Mg含量升高，以保證脅迫條件下，光合作用的正常進(jìn)行；Fe含量顯著下降，可能是因?yàn)镕e2+參與催化哈伯-韋斯反應(yīng)產(chǎn)生ROS，以促進(jìn)碳源向蝦青素合成途徑轉(zhuǎn)移來提高蝦青素含量[21-22]。

本研究表明，高光脅迫下雨生紅球藻細(xì)胞內(nèi)K的含量極顯著低于對(duì)照組（P≤0.01）。與本試驗(yàn)結(jié)果一致的是，對(duì)番茄的根區(qū)同時(shí)進(jìn)行低溫和鹽脅迫的誘導(dǎo)，使得K的含量顯著下降[23]。這可能是因?yàn)槟婢趁{迫影響K+轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白酶的活性，進(jìn)而抑制鉀離子的吸收[24]。

本研究結(jié)果表明，高光脅迫使得雨生紅球藻細(xì)胞中Na、Cu、Mn和Zn的含量極顯著低于指數(shù)生長中期（對(duì)照）雨生紅球藻中的含量（P≤0.01）。前人研究也表明，干旱脅迫顯著抑制了番茄、玉米和蘋果植株對(duì)大量元素和微量元素的吸收[25-27]。這是因?yàn)槟婢趁{迫抑制了植物和微藻對(duì)礦質(zhì)元素的同化吸收，導(dǎo)致植株和微藻相對(duì)生長速率和生物量積累的減少[28]。

總之，高光脅迫下，雨生紅球藻細(xì)胞中粗蛋白和大部分氨基酸以及礦質(zhì)元素含量降低，以降低光合作用和細(xì)胞的生長率，同時(shí)，誘發(fā)蝦青素積累、脯氨酸、Mg和Ca等元素含量升高，以增強(qiáng)藻細(xì)胞抵御氧化脅迫的活力，共同應(yīng)對(duì)高光對(duì)藻細(xì)胞造成的毒害作用。本研究為探究雨生紅球藻細(xì)胞抵抗逆境脅迫的相關(guān)機(jī)制等方面奠定了基礎(chǔ)，進(jìn)而為建立外源調(diào)控蝦青素富集的有效技術(shù)提供了科學(xué)依據(jù)。