四川省3 個地方品種牛成纖維細(xì)胞系的建立及細(xì)胞遺傳特性分析

余敏潔，楊鈺楚，陳軒宇，李 強(qiáng)，楊舒慧，張 燕，張 明*

（1.四川農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科技學(xué)院，四川成都 611130；2.四川省畜牧總站，四川成都 610044）

一個品種種質(zhì)資源的優(yōu)異基因一旦被發(fā)掘出來并加以利用，產(chǎn)生的效益是無法估量的[1]，而某種基因一旦從地球上消失就很難進(jìn)行再生創(chuàng)造，將直接影響到國家經(jīng)濟(jì)未來的發(fā)展?jié)摿2]。

四川省是南方養(yǎng)牛大省，也是牛遺傳資源大省[3]。峨邊花牛主要分布于四川省樂山市峨邊彝族自治縣和涼山彝族自治州的大小涼山地區(qū)，產(chǎn)肉多肉質(zhì)細(xì)嫩，具有特殊芳香，抗逆性好，是四川省優(yōu)良品種，于1987 年編入《四川家畜家禽品種志》，并認(rèn)定為我國地方品種[4]。平武黃牛主要分布在四川省平武縣，主要特征是體格較大，體態(tài)勻稱，為四川省特色品種[5]。布拖牛即涼山黃牛是經(jīng)過長期選育而形成的以役用為主的役肉兼用型小型黃牛品種，具有耐粗飼、耐寒、耐勞、性情溫順、抗病力強(qiáng)的特點[6]。這3 個品種是我國畜禽遺傳資源保護(hù)名錄中的地方牛種。細(xì)胞遺傳資源的保存，是對個體保種方式的補(bǔ)充[7]，但直到目前，峨邊花牛、平武黃牛和涼山黃牛3 種地方牛種作為細(xì)胞遺傳資源庫保存的細(xì)胞系尚未建立，且我國普通牛的染色體組G 帶模式圖尚未建立。本研究以牛耳緣組織為材料，擬建立3 個品種的皮膚成纖維細(xì)胞系，構(gòu)建遺傳資源保存細(xì)胞系的核型和G 帶模式圖，并通過G 帶和mtDNA-D-Loop 分析這3 個本地牛的進(jìn)化關(guān)系，完善細(xì)胞遺傳學(xué)基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，為地方品種牛遺傳資源的保存提供了材料且積累了數(shù)據(jù)。

1 材料和方法

1.1 實驗動物 選取涼山黃牛（公牛7 頭，母牛43 頭）、峨邊花牛（公牛7 頭，母牛43 頭）和平武黃牛（公牛5 頭，母牛40 頭），采集5 mm×5 mm 的耳緣組織，采集后用含雙抗的PBS 清洗，然后按照組織冷凍保存方法進(jìn)行保存，實驗室解凍后剪碎進(jìn)行植塊培養(yǎng)。

1.2 組織收集與凍存 牛耳緣先用50%碘酒消毒，然后用75%的酒精脫碘，用毛剪迅速取耳尖的皮膚組織塊，在75%的酒精中洗30 s，然后在含1 000 IU/mL 青霉素+1 000 μg/mL 鏈霉素的PBS 溶液中浸洗1 min×3 次，將組織塊放入盛有PBS 的EP 管4℃冷藏，3～6 h 內(nèi)將組織塊剪碎，用含F(xiàn)BS 以及10% DMSO（Sigma）的DMEM/Ham’s F12（HyClone）組織凍存液進(jìn)行冷凍保存。

1.3 原代培養(yǎng) 組織解凍后，用含10%FBS（AusGeneX）的DMEM/Ham’s F12 培養(yǎng)液清洗，然后在DMEM/Ham’s F12 培養(yǎng)液中平衡10 min，進(jìn)一步將組織剪碎成約1 mm3的小塊，玻璃吸管將組織塊吸至培養(yǎng)瓶底壁使其黏附在瓶壁上，倒置培養(yǎng)瓶4 h。組織塊貼壁后，沿瓶壁加入4 mL DMEM/Ham’s F12 培養(yǎng)液，正置培養(yǎng)瓶，讓培養(yǎng)液浸沒組織塊，在37.5℃、5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)[7]。每隔2～3 d 更換2/3 的培養(yǎng)液。

1.4 傳代培養(yǎng)和成纖維細(xì)胞差速粘附分離 當(dāng)培養(yǎng)的細(xì)胞鋪滿瓶底80%～90% 時，用預(yù)熱的PBS 漂洗細(xì)胞2次，加入適量0.25%胰蛋白酶（Solorbio）和0.04%的EDTA，37℃下消化1～2 min，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，1 200 r/min 離心8 min 收集細(xì)胞，然后分瓶，置于37.5℃和5% CO2、飽和濕度的培養(yǎng)箱中。分別在傳代的第1、2、3 代接種細(xì)胞后的1 h、40 min 和30 min吸出未貼壁的細(xì)胞。傳代培養(yǎng)每2～3 d 更換2/3 培養(yǎng)液。

1.5 成纖維細(xì)胞鑒定 傳代到第3 代次的細(xì)胞生長到匯合前用PBS 清洗3 次，然后用4%多聚甲醛固定30 min，再用0.3%Txiton X-100 穿透處理10 min，用3% BSA在室溫下封閉30 min，甩去液體，滴加BSA 1:100 稀釋的小鼠單克隆波形蛋白抗體（sc-80975），4℃過夜后PBS清洗5 min×3 次，1:50稀釋FITC-羊抗小鼠IgG（Boster）二抗孵育1 h，再次清洗后用DAPI 染細(xì)胞核，最后滴加抗熒光淬滅封片劑于熒光顯微鏡（Olympus IX-71,Japan）下觀察并拍照，并計算成纖維細(xì)胞百分率。

1.6 細(xì)胞冷凍與復(fù)蘇 凍存前用PBS 液洗2 遍，用0.25%胰 蛋白酶和0.04% 的EDTA，37 ℃下消化1～2 min，加入含血清的培養(yǎng)基終止消化，1 200 r/min 離心8 min收集細(xì)胞，加入細(xì)胞凍存液1 mL。將凍存管放在4℃下預(yù)冷1 h，然后放入盛滿異丙醇的細(xì)胞凍存降溫盒（Nalgene）置于-80℃的冰箱中過夜，次日將細(xì)胞投入液氮罐中保存。從液氮中取出凍存管，快速投入37℃水浴中，并在水浴中不斷快速搖動凍存管，以迅速解凍；待冷凍液徹底解凍后，用新鮮培養(yǎng)液稀釋10 倍并將溶解液轉(zhuǎn)移至離心管中，再以1 200 r/min 離心8 min，去除DMSO 以緩解冷凍液毒性，用新鮮的培養(yǎng)液懸浮細(xì)胞沉淀，將細(xì)胞稀釋至所需濃度，繼續(xù)培養(yǎng)。

1.7 細(xì)胞生長曲線測定 取對數(shù)生長期細(xì)胞，常規(guī)方法消化細(xì)胞，將終密度為2～3×105個/mL 成纖維細(xì)胞接種到24 孔培養(yǎng)板上，常規(guī)條件下培養(yǎng)，血球計數(shù)板連續(xù)8 d 計數(shù)，每天計數(shù)3 個孔，以培養(yǎng)時間為橫坐標(biāo)、細(xì)胞個數(shù)為縱坐標(biāo)，繪制培養(yǎng)細(xì)胞的生長曲線。

1.8 培養(yǎng)細(xì)胞核型、G 帶分析 參照張明[7]和Sun[8]方法優(yōu)化后進(jìn)行染色體制備。取培養(yǎng)至匯合度為85% 左右并處于對數(shù)生長期的細(xì)胞為實驗材料，加入3 μL 濃度為0.1 μg/μL 的秋水仙素（Coolaber），培養(yǎng)液終濃度0.1 μg/mL。繼續(xù)培養(yǎng)3 h，使大部分細(xì)胞處于分裂中期。常規(guī)方法消化收集細(xì)胞，同細(xì)胞傳代，轉(zhuǎn)入離心管。去上清液，加入預(yù)熱至37℃的低滲液2 mL 混勻后，繼續(xù)加至10 mL，37℃溫浴40 min。懸液中加入新鮮固定液1 mL，吹打均勻（輕吹防細(xì)胞破裂）。將懸液1 000 r/min 離心8 min。去上清，加入新鮮固定液5 mL，吹打均勻，室溫靜置20 min。重復(fù)2 次固定操作，離心后去上清液，視細(xì)胞數(shù)量加入固定液0.5～1 mL，吹打均勻。取出4℃預(yù)冷載玻片，45°傾斜，距玻片1 m高處用吸管迅速滴上2～3 滴細(xì)胞懸液，立即用嘴吹散懸液使細(xì)胞分散均勻，將載玻片過酒精燈2 次，助染色體分散，展開，空氣干燥。用Giemsa 染色液進(jìn)行染色10 min，用自來水洗掉多余染液，自然干燥后在400倍下鏡檢（Olympus BX51，Japan）。用Band View 4.0（Applied Spectral Immage Inc.Israel）進(jìn)行中期相染色體自動排序和分析核型，然后計算相對長度和著絲粒指數(shù)[9]，并利用Band View Expo 4.0 和Intensity Profile 對G 帶的圖案進(jìn)行分析，利用Ideogram 將G 帶紋分成3 個深淺（Parition、Dark band 和Light band）級別構(gòu)建帶紋模式圖，然后帶紋數(shù)值按照Parition、Dark band 和Light band 排列，用IBM SPSS v19 聚 類分析中Ward 聚類和Pearson 相關(guān)距離構(gòu)建3 個品種的聚類樹[10]。

1.9 細(xì)胞細(xì)菌和支原體檢測 對凍存前后的第2、3 代細(xì)胞進(jìn)行PI 染色，在熒光顯微鏡觀察細(xì)菌污染情況；在相差顯微鏡觀察有無蝕斑、空斑等病毒污染以及有無活動的細(xì)菌[11]。然后將細(xì)菌和病毒用符合NY/T 1900-2010 技術(shù)規(guī)范的細(xì)胞用支原體檢測試劑盒（PCR Mycoplasma Detection Kit,ABM，Canada）進(jìn)行檢測。取500 μL 生長至80%匯合細(xì)胞培養(yǎng)上清液，2 000 r/min將上清至新離心管中，然后15 000～20 000 r/min 離心10 min，沉淀支原體，小心移除上清450 μL，重懸剩余50 μL 培養(yǎng)基，懸液為支原體檢測樣本。具體操作參見試劑盒說明書。

1.10 mtDNA.D-loop擴(kuò)增和測序用天根DNA 抽提試劑盒（Tiangen，DP304）抽提培養(yǎng)成纖維細(xì)胞的DNA，具體步驟見天根血液/ 細(xì)胞/ 組織基因組DNA提取試劑盒（DP304）說明書。引物為F：5'-CTGCAG TCTCACCATCAACC-3'；R：5'-GGGGTGTAGATGCT TGC-3'，在25 μL 反應(yīng)體系（12.5 μL 的2×Taq Master Mix，上下游引物各2.5 μL，1 μg/μL 的DNA 模板5.0 μL，然后加ddH2O）采用表2 引物和條件進(jìn)行PCR 擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物用1%的瓊脂糖凝膠在120 V 電壓下電泳20 min，隨后切取目的條帶進(jìn)行膠回收后送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行雙向測序，序列用DNAStar 編輯、比對獲得每個品種保守序列后用MEGA.7.0 構(gòu)建NJ 樹[12]。

2 結(jié)果與分析

2.1 牛成纖維細(xì)胞形態(tài)學(xué)觀察與鑒定 冷凍組織塊原代培養(yǎng)7 d，成纖維細(xì)胞和少量類上皮細(xì)胞從組織塊周圍生長（圖1A），培養(yǎng)10 d，大量成纖維細(xì)胞從組織塊周圍長出并迅速增殖。通過差速貼壁連續(xù)傳代3 次，獲得的細(xì)胞成典型的成纖維細(xì)胞狀（圖1C），通過成纖維細(xì)胞標(biāo)志物波形蛋白免疫熒光鑒定（圖1E、F、G、H），第3 代細(xì)胞成纖維細(xì)胞的比例達(dá)到95.9%±8.3%。

圖1 牛成纖維細(xì)胞培養(yǎng)與鑒定

2.2 成纖維細(xì)胞生長曲線 傳代成纖維細(xì)胞生長曲線見圖2，其呈典型的“S”型，細(xì)胞有約3 d 的緩慢生長期，此后進(jìn)入指數(shù)生長期，第7 天細(xì)胞數(shù)達(dá)最大，然后細(xì)胞生長進(jìn)入平臺期，細(xì)胞生長受接觸抑制的影響，此時細(xì)胞密度達(dá)到最大。培養(yǎng)細(xì)胞在6～7 d 進(jìn)行傳代。

圖2 牛成纖維細(xì)胞生長曲線

2.3 牛成纖維細(xì)胞核型分析 參照Levan[13]等的標(biāo)準(zhǔn)，選擇第3 代細(xì)胞中期分裂相（圖3）的細(xì)胞核，進(jìn)行核型配對，并按照相對長度編號（圖4）取100 個分裂相進(jìn)行統(tǒng)計分析。核型分析結(jié)果顯示，2n=60，XX/XY。29 對常染色體為長短不同的端著絲粒染色體，X 染色體為亞中著絲粒染色體，Y 染色體為最短的近端部著絲粒染色體（圖4），與國內(nèi)外報道的黃牛染色體核型一致。牛染色體中正常二倍體染色體（2n=60）所占比例為91.76%，培養(yǎng)的細(xì)胞為穩(wěn)定的二倍體細(xì)胞系。染色體相對長度見表1，3 個牛種，以及公、母在染色體類型上均完全相同，在染色體相對長度上差異均不顯著。X 染色體著絲粒指數(shù)見表2。

表1 平武、峨邊、涼山牛染色體相對長度及形態(tài)類型

表2 3 個地方品種牛X 染色體著絲粒比較

圖3 細(xì)胞中期分裂相

圖4 3 個地方牛種核型

2.4 牛成纖維細(xì)胞染色體G 帶 將3 種地方品種牛染色體G 帶進(jìn)行分析，建立G 帶模式圖（圖5）。3 個品種帶紋數(shù)見表3：平武牛的染色體被分離出83 個區(qū)域，總共382 條帶；峨邊花牛被分離出83 個區(qū)域，總共374 條帶；布拖牛被分離出82 個區(qū)域總共373 條帶。3個品種的染色體G 帶比較發(fā)現(xiàn)：3 個品種在5、6、7、10、13、14、22、23、27、28、29 號常染色體，以及性染色染（X 和Y）具有相同的G 帶模式和帶紋數(shù)，在1、2、3、4、8、9、11、15、16、17、18、19、20、21、24、25 和26 常染色體上，3 個品種的帶紋數(shù)量存在差異。

表3 3 種牛常染色體的G 帶對比

圖5 3 種地方牛的染色體G 帶模式圖

利用帶紋模式的相關(guān)性進(jìn)行聚類分析（圖6A），與3 個品種群體mtDNA-D-loop 保守序列構(gòu)建的NJ 樹（圖6B）比較，結(jié)果發(fā)現(xiàn)：細(xì)胞遺傳學(xué)G 帶聚類和mtDNAD-loop 保守序列聚類獲得了相同的拓?fù)浣Y(jié)構(gòu)樹。

圖6 mtDNA-D-loop（A）和G 帶（B）聚類分析

2.5 牛耳緣成纖維細(xì)胞凍存前及復(fù)蘇后細(xì)胞活率 牛耳緣組織成纖維細(xì)胞凍存前細(xì)胞活率為92.16%±5.21%，解凍后細(xì)胞復(fù)蘇活率為90.57%±3.43%，細(xì)胞在凍存前、后活率無顯著差異，復(fù)蘇細(xì)胞生長良好。

2.6 成纖維細(xì)胞系微生物污染檢測結(jié)果 在相差顯微鏡下觀察成纖維細(xì)胞無蝕斑、空斑等明顯的病毒感染情況；支原體檢測結(jié)果顯示平武黑牛、峨邊花牛、涼山黃牛細(xì)胞系均無支原體污染（圖7A）；DAPI 染色后在600 倍鏡下觀察10 個視野，未發(fā)現(xiàn)細(xì)小熒光點（圖7B），表明無細(xì)菌污染。

圖7 支原體與細(xì)菌檢測

3 討 論

皮膚成纖維細(xì)胞是皮下組織的主要細(xì)胞，在適當(dāng)?shù)捏w外培養(yǎng)條件下能迅速增長繁殖[7]。皮膚成纖維細(xì)胞培養(yǎng)中，常采用DMEM/Ham'sF12 培養(yǎng)基，并通過差速貼壁進(jìn)行皮膚成纖維細(xì)胞的純化[14]。本研究通過2～3 次傳代過程的差速貼壁，得到了高純度的成纖維細(xì)胞。

野牦牛[15]、魯西黃牛[16]、南陽牛[17]等染色體數(shù)目均為2n=60，四川的3 個地方牛種的染色體數(shù)目為2n=60。牛成纖維細(xì)胞體外培養(yǎng)過程中，隨著傳代次數(shù)的增加，生長速度變慢，且染色體呈二倍體的細(xì)胞比例逐漸降低，多次傳代細(xì)胞的遺傳穩(wěn)定性降低[18]，本研究冷凍保存的細(xì)胞主要為2～3 代細(xì)胞，二倍體細(xì)胞的比例為91.76%，具有較高的遺傳穩(wěn)定性。研究中，利用G 帶帶紋和mtDNA-D-loop 序列，揭示的涼山黃牛、平武黃牛和峨邊花牛的遺傳關(guān)系相同，研究結(jié)果表明分子遺傳標(biāo)記和細(xì)胞遺傳標(biāo)記均可用于物種進(jìn)化關(guān)系分析。

冷凍保存技術(shù)能夠?qū)崿F(xiàn)細(xì)胞遺傳資源的長期保存[19]。程金華等[20]等選擇了10% DMSO+10% FBS+DMEM/Ham's F12 的細(xì)胞凍存液進(jìn)行保存，解凍后細(xì)胞的活率超過90%。細(xì)胞保存過程中細(xì)胞冷凍過程中為降低低細(xì)胞內(nèi)冰晶的形成，提高解凍后細(xì)胞活性、黏附能力及代謝活性，滲透性抗凍劑的選擇和濃度非常重要[21]。本實驗采用10% DMSO 細(xì)胞培養(yǎng)液作為凍存液，凍存細(xì)胞在凍存前和復(fù)蘇后的活率無顯著差異。

4 結(jié) 論

該實驗成功建立了四川涼山、峨邊、平武3 個地方牛種的皮膚成纖維細(xì)胞系，為后續(xù)的遺傳學(xué)研究提供了寶貴的材料，對地方牛種遺傳資源的保護(hù)具有重要意義。