運(yùn)輸應(yīng)激對山羊小腸形態(tài)和熱休克蛋白表達(dá)的影響

鄭文亞，李國生，劉 犇,2,3*，方滿新,2，胡迎東,2，胡 威,2，彭瑞妮,2,3，高 凡

（1.宜春學(xué)院生命科學(xué)與資源環(huán)境學(xué)院，江西宜春 336000；2.江西綠科農(nóng)牧科技有限公司，江西宜春 336000；3.江西省高等學(xué)校硒農(nóng)業(yè)工程技術(shù)研究中心，江西宜春 336000）

現(xiàn)代動物生產(chǎn)中，養(yǎng)殖場與市場、屠宰場之間的畜禽安全運(yùn)輸是十分重要的一個環(huán)節(jié)[1]。然而在運(yùn)輸過程中，各種不良因素會導(dǎo)致動物的壓力增加，如陌生環(huán)境、禁食缺水、通風(fēng)不良、高溫或低溫、動物的裝卸、噪聲以及車廂環(huán)境的污染均會危害動物福利[2]，增加發(fā)病率和死亡率[3]。而小腸作為消化、吸收和營養(yǎng)物質(zhì)代謝的重要場所[4]，極易成為熱應(yīng)激、運(yùn)輸應(yīng)激和缺氧應(yīng)激等不良反應(yīng)的靶器官[5]，某些消化系統(tǒng)疾病通常是由這些反應(yīng)引起的，例如食欲不振或亢進(jìn)、腹瀉或便秘等，嚴(yán)重時可能導(dǎo)致動物死亡。研究表明，運(yùn)輸應(yīng)激損害大鼠小腸并破壞某些重要基因的表達(dá)[6]。

熱休克蛋白（HSPs）作為主要的應(yīng)激相關(guān)蛋白，由于其在細(xì)胞中的生理和保護(hù)作用通常被稱為分子伴侶[7]。當(dāng)細(xì)胞處于應(yīng)激狀態(tài)時，HSPs 水平升高，促進(jìn)蛋白質(zhì)的正確折疊，維持蛋白質(zhì)的天然結(jié)構(gòu)和功能[8]。對于某些由應(yīng)激引起的胃腸道疾病，如胃潰瘍等，HSPs 可能起重要的保護(hù)作用[9]。此外，HSPs 家族中不同成員在正常和應(yīng)激條件下表現(xiàn)出不同的功能[10]。其中，HSP90在細(xì)胞適應(yīng)應(yīng)激，維持正常細(xì)胞功能中起重要作用[11]，HSP70 家族被認(rèn)為是細(xì)胞內(nèi)有效的應(yīng)激緩沖體系[12]，而HSP27 在細(xì)胞發(fā)育、免疫功能調(diào)節(jié)和疾病防治中均發(fā)揮重要作用[13]。本研究旨在探討運(yùn)輸應(yīng)激對山羊小腸顯微和超微結(jié)構(gòu)的損傷及其對熱休克蛋白表達(dá)的影響，對于臨床上緩解運(yùn)輸應(yīng)激所帶來的危害有重要意義。

1 材料與方法

1.1 主要試劑 蘇木精、伊紅染液購自北京夢怡美生物科技有限公司，小鼠SP 免疫組化試劑盒及濃縮二氨基聯(lián)苯胺（DAB）顯色液購自北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司，HSP27（ab79868）、HSP70（ab5439）、HSP90（ab13492）以及山羊抗小鼠IgG（ab6789）購自abcam 公司，小鼠抗β-actin 內(nèi)參蛋白（BM0627）和免疫印跡技術(shù)彩色預(yù)染蛋白Marker（AR1113）購自博士德生物，4× 蛋白上樣緩沖液（AI11800A）購自TAKARA 公司，超敏化學(xué)發(fā)光檢測試劑盒（GS0720）購自US EVERBRIGHT INC 公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動物處理 隨機(jī)選擇體重（13.89±2.96 kg）、體況相似的12 只健康贛西公山羊，分為3 組，分別為對照組（不運(yùn)輸）、運(yùn)輸應(yīng)激2 h 組、運(yùn)輸應(yīng)激6 h 組，每組4 只，溫度28～32℃（實(shí)驗(yàn)時間為2018 年7 月28日），禁食、禁水以35～45 km/h 的速度進(jìn)行公路運(yùn)輸。頸部快速放血致死后迅速采取山羊十二指腸、空腸和回腸，部分放入4% 多聚甲醛和2.5% 戊二醛中固定，部分放入液氮中速凍后轉(zhuǎn)入-80℃超低溫冰箱保存，用于后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

1.3 病理學(xué)研究 將4%多聚甲醛溶液固定48 h 以上的十二指腸、空腸及回腸組織，流水沖洗24 h 以上，后經(jīng)脫水、透明、浸蠟、包埋制成組織切片，進(jìn)行HE 染色后于光學(xué)顯微鏡下進(jìn)行拍照，觀察其病理變化。將2.5%戊二醛固定液中固定72 h 的十二指腸、空腸及回腸組織置于1%的鋨酸中固定，常規(guī)脫水、包埋后用超薄切片機(jī)進(jìn)行切片，經(jīng)醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色后置于透射電鏡下觀察并進(jìn)行拍攝。

1.4 免疫組織化學(xué) 將制備好的小腸組織石蠟切片進(jìn)行烘片、脫蠟、微波抗原修復(fù)后，依據(jù)小鼠SP 免疫組織化學(xué)試劑盒操作要求進(jìn)行操作，HSP27、HSP70、HSP90 均按1:400 稀釋，設(shè)置陰性對照（一抗用PBS代替）。DAB 顯色后蘇木精復(fù)染，鹽酸酒精分化，返藍(lán)后脫水、透明、封片，立即進(jìn)行觀察和拍照，出現(xiàn)黃色或棕色即為陽性表達(dá)。

1.5 免疫印跡技術(shù) 取小腸組織充分研磨碾碎、加入裂解液裂解后用組織細(xì)胞總蛋白抽提試劑盒按操作步驟提取總蛋白，采用BCA 法測定蛋白濃度，并將實(shí)驗(yàn)組和對照組的總蛋白濃度調(diào)為一致。將制備好的蛋白液上樣后采用聚丙烯酰胺凝膠電泳2 h，PVDF 膜濕轉(zhuǎn)50 min，TBST 洗滌后封閉2 h，將膜裁剪成適宜大小后用TBST洗滌3 次，10min/ 次；4℃條件下放入一抗（HSP27、HSP70、HSP90 分別按1:5000、1:1000、1:1000 稀釋）與小鼠抗β-actin（1:1000 稀釋）孵育18 h，TBST 洗滌3 次，10min/次；室溫下孵育山羊抗小鼠IgG（HSP27、HSP70、HSP90 分別以1:8000、1:20000、1:2000 稀釋）、內(nèi)參蛋白（1:1000 稀釋）2h，TBST 洗滌3 次，10min/次。最后將PVDF 膜按照HRP-ECL 化學(xué)發(fā)光試劑盒的說明進(jìn)行成像，AI600 化學(xué)發(fā)光成像儀拍照。用Image Pro Plus 6.0 軟件對采集的條帶圖像進(jìn)行密度值分析，目的蛋白與相對應(yīng)的內(nèi)參蛋白條帶的密度值比值記為測試值。

1.6 實(shí)時熒光定量PCR 實(shí)時熒光定量PCR 在之前報(bào)道方法[14]的基礎(chǔ)上進(jìn)行了改進(jìn)。使用組織RNA 試劑盒（R6812，Omega，USA）分離總RNA，并使用第一鏈cDNA 合成的逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)預(yù)混液試劑盒（AT301，TransGen,China）逆轉(zhuǎn)錄為cDNA。使用Top Green qPCR SuperMix 試劑盒（AQ131，TransGen）在CFX96 TouchTM實(shí)時系統(tǒng)（Bio-Rad,USA）上擴(kuò)增cDNA，表1 列出了所使用的引物序列。通過2-ΔΔCt方法分析實(shí)時熒光定量PCR 的數(shù)據(jù)，將相對表達(dá)水平標(biāo)準(zhǔn)化為β-肌動蛋白的表達(dá)水平。

表1 實(shí)時熒光定量PCR 引物序列

1.7 統(tǒng)計(jì)分析 使用SPSS 18.0 軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析，單因素方差分析后再進(jìn)行LSD 多重比較。數(shù)據(jù)表示為平均值±標(biāo)準(zhǔn)差，P＜0.05 表示有顯著差異，P≥0.05 表示無顯著差異。

2 結(jié)果

2.1 運(yùn)輸應(yīng)激山羊小腸的顯微病理學(xué)觀察 如圖1 所示，與對照組相比，運(yùn)輸應(yīng)激后小腸組織結(jié)構(gòu)均有損傷，主要發(fā)生在固有層，固有層炎性細(xì)胞浸潤十分明顯，十二指腸和空腸多為淋巴細(xì)胞和漿細(xì)胞浸潤，回腸主要為中性粒細(xì)胞、嗜酸性粒細(xì)胞和淋巴細(xì)胞浸潤，此外，固有層充血出血，腺上皮破損、變性。十二指腸和空腸固有層細(xì)胞變性壞死，中央乳糜管擴(kuò)張，部分管腔中可見壞死脫落的細(xì)胞碎屑（圖1-B1），炎性細(xì)胞浸潤明顯（圖1-C1），毛細(xì)血管充血出血（圖1-B2），腸上皮細(xì)胞發(fā)生壞死、融合（圖1-C2）。少量回腸黏膜上皮細(xì)胞變性壞死，固有層炎性細(xì)胞浸潤（圖1-B3、1-C3），腺體結(jié)構(gòu)不完整，嚴(yán)重者腺體結(jié)構(gòu)崩解，腺上皮細(xì)胞變性壞死，胞核碎裂溶解，胞質(zhì)淡染出現(xiàn)空泡化，毛細(xì)血管充血出血（圖1-B3）。

圖1 山羊小腸顯微病理學(xué)觀察（HE 染色，400×）

2.2 運(yùn)輸應(yīng)激山羊小腸的超微病理學(xué)觀察 透射電鏡觀察發(fā)現(xiàn)，運(yùn)輸應(yīng)激組十二指腸柱狀上皮細(xì)胞微絨毛彎曲、倒伏，線粒體增生、腫脹和空泡化，內(nèi)質(zhì)網(wǎng)結(jié)構(gòu)不完整、膜破裂，細(xì)胞核固縮、核膜內(nèi)陷，染色質(zhì)凝集邊移，電子密度增高（圖2 A1-C1）。空腸上皮細(xì)胞微絨毛也發(fā)生彎曲、倒伏，大量高電子密度的神經(jīng)內(nèi)分泌顆粒出現(xiàn)在細(xì)胞頂部，線粒體增殖聚集，呈圓形、細(xì)長型或S 形，部分出現(xiàn)腫脹、嵴斷裂、內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊等現(xiàn)象，細(xì)胞核異常，有不同程度的固縮、壞死和凋亡，電子密度高（圖2 A2-C2）?；啬c柱狀上皮細(xì)胞微絨毛彎曲、倒伏，部分核濃縮、形狀不規(guī)則，核膜內(nèi)陷或破裂，異染色質(zhì)凝集邊移，胞質(zhì)中可見較多囊泡和小管，糖原豐富，線粒體增生，集中在微絨毛下方，形態(tài)各異，部分線粒體腫脹、嵴消失、內(nèi)部結(jié)構(gòu)模糊（圖2 A3-C3）。

圖2 山羊小腸超微病理學(xué)觀察（醋酸鈾-枸櫞酸鉛染色）

2.3 山羊小腸三種熱休克蛋白的表達(dá)定位 HSP27 在十二指腸腸絨毛黏膜上皮細(xì)胞表達(dá)，且主要在胞質(zhì)中表達(dá)，呈黃色，固有層白細(xì)胞有少量表達(dá)，在腸腺周圍組織中表達(dá)較多，呈黃色或淺黃色（圖3-A1、B1、C1）；HSP70 在十二指腸主要表達(dá)于絨毛黏膜上皮細(xì)胞胞漿中，呈黃色，在固有層有少量白細(xì)胞表達(dá)，呈黃色或棕黃色，其他部位則無表達(dá)（圖3-D1、E1、F1）；HSP90 在十二指腸的表達(dá)主要出現(xiàn)在腸絨毛黏膜上皮細(xì)胞胞核及胞質(zhì)中，呈淺黃色（圖3-G1、H1、I1）?？漳cHSP27 主要表達(dá)部位在腸絨毛黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)，而基底部、小腸腺周圍組織表達(dá)較少（圖3-A2、B2、C2）；空腸HSP70 主要在腸絨毛黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)中表達(dá)，在固有層僅腸絨毛處有少量白細(xì)胞表達(dá)，其他部位則無表達(dá)（圖3-D2、E2、F2）；HSP90 在腸絨毛上皮及小腸腺上皮細(xì)胞表達(dá)，表達(dá)主要在細(xì)胞核，呈棕色或淺棕色（圖3-G2、H2、I2）。HSP27 在回腸腸絨毛黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)有表達(dá)，呈深棕色或棕色，固有層結(jié)締組織、壞死脫落的細(xì)胞碎屑以及白細(xì)胞均有表達(dá)，呈棕黃色，小腸腺上皮也有表達(dá)，呈淺黃色，小腸腺周圍白細(xì)胞及結(jié)締組織表達(dá)呈棕黃色（圖3-A3、B3、C3）；HSP70 在回腸表達(dá)量少，僅在腸絨毛黏膜上皮細(xì)胞胞質(zhì)有表達(dá)，呈黃色或淺黃色（圖3 D3、E3、F3）；HSP90 在回腸主要在腸絨毛黏膜上皮細(xì)胞胞核表達(dá)，呈棕色或棕黃色，在小腸腺上皮也表達(dá)，呈棕色或淺棕色，在集合淋巴小結(jié)中，大量淋巴細(xì)胞表達(dá)，胞核呈棕色（圖3G3、H3、I3）。

圖3 山羊小腸HSP27、HSP70 和HSP90 蛋白的表達(dá)情況（400×）

2.4 山羊小腸熱休克蛋白mRNA 和蛋白的定量表達(dá)情況與對照組相比，運(yùn)輸應(yīng)激后山羊十二指腸中HSP27 的mRNA 水平在2、6 h 運(yùn)輸應(yīng)激組均上調(diào)（P＜0.05），HSP70 僅在6 h 運(yùn)輸應(yīng)激組上調(diào)（P＜0.05），而HSP90 mRNA 水平無顯著變化（圖4-A），運(yùn)輸應(yīng)激后HSP27、HSP70 蛋白表達(dá)水平無變化，而6 h 運(yùn)輸應(yīng)激組HSP90 蛋白表達(dá)水平增加（P＜0.05，圖4-B、C）。與對照組相比，運(yùn)輸2 h 組山羊空腸HSP90 mRNA 水平上調(diào)（P＜0.05），運(yùn)輸2 h 組和6 h 組HSP70 mRNA水平均增加（P＜0.05，圖4-D），但3 種蛋白的表達(dá)量均沒有變化（P＞0.05，圖4-E、F）。與對照組回腸相比，HSP27 mRNA 和蛋白水平在2 h 組均下調(diào)（P＜0.05），HSP70 mRNA 和蛋白水平在2 h 組增加（P＜0.05），HSP90 mRNA 和蛋白水平在2 h、6 h 運(yùn)輸應(yīng)激后均無變化（圖4-G、H、I）。

圖4 運(yùn)輸應(yīng)激對山羊小腸HSP27、HSP70 和HSP90 mRNA 和蛋白水平的影響

3 討 論

運(yùn)輸常導(dǎo)致動物體重下降、免疫力降低和肉品質(zhì)下降[15-16]，還會破壞反芻動物瘤胃生態(tài)系統(tǒng)的穩(wěn)定，使菌群發(fā)生變化、釋放內(nèi)毒素、對病原微生物的抵抗能力減弱，從而增加消化道感染的風(fēng)險[15,17]。腸道具有營養(yǎng)吸收和屏障2 個重要功能[2]，尤其是腸道屏障功能的完整性對機(jī)體健康十分重要[18-19]，腸道屏障功能受損后極易引起各種胃腸道及胃腸道之外的疾病，包括肝病、代謝綜合征與肥胖癥等[20-22]。有研究報(bào)道大鼠空腸在運(yùn)輸后出現(xiàn)損傷，可能與細(xì)胞凋亡、氧化應(yīng)激及激素失衡有關(guān)[6]；此外，熱應(yīng)激時豬腸道也會出現(xiàn)明顯損傷，包括腸絨毛頂端受損、上皮細(xì)胞脫落、腸黏膜固有層暴露、絨毛高度和隱窩深度降低等[23-24]。本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)輸后小腸絨毛結(jié)構(gòu)不完整，細(xì)胞壞死脫落，出現(xiàn)較多的炎性細(xì)胞浸潤及充血出血現(xiàn)象，腸上皮細(xì)胞微絨毛倒伏彎曲，胞核固縮，線粒體腫脹、嵴斷裂，以上結(jié)果表明運(yùn)輸應(yīng)激對山羊小腸造成了一定的結(jié)構(gòu)損傷，將會致使腸道通透性增加、細(xì)菌發(fā)生易位，影響其吸收和屏障功能，從而造成運(yùn)輸后腹瀉等疾病發(fā)生率升高[25]。

HSPs 能夠作為分子伴侶參與蛋白質(zhì)的折疊、轉(zhuǎn)運(yùn)和分配，在各種不良環(huán)境條件下，HSPs 可從細(xì)胞中釋放，維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)態(tài)，并可激活多種調(diào)控蛋白，阻斷細(xì)胞凋亡[26]。不同家族的HSPs 在正?；驊?yīng)激條件下其功能也不一樣，其中HSP90 對細(xì)胞發(fā)揮正常功能以及對應(yīng)激的適應(yīng)起著重要作用，HSP90 作為分子伴侶，可以保護(hù)蛋白質(zhì)免受降解，并能與多種信號分子形成復(fù)合物，以維持細(xì)胞的生長和生存[27]，HSP90 在體外保護(hù)小腸上皮細(xì)胞免受過氧化氫或吲哚乙酸誘導(dǎo)的細(xì)胞損傷方面發(fā)揮重要作用，通過調(diào)控HSP90 過表達(dá)可提高對小腸上皮細(xì)胞的保護(hù)作用[28]。另有研究發(fā)現(xiàn)在豬運(yùn)輸應(yīng)激過程中，由于胃及心臟中HSP90 水平都顯著下降，造成其消化道和心臟出現(xiàn)損傷[27,29]。本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)輸6 h 后山羊十二指腸HSP90 蛋白表達(dá)水平升高，運(yùn)輸2 h 后山羊空腸HSP90 mRNA 水平上調(diào)，HSP90 的上調(diào)可能與緩解運(yùn)輸應(yīng)激造成的腸道損傷有關(guān)。

HSP70 能增強(qiáng)細(xì)胞對環(huán)境變化和致病條件的耐受性，提高細(xì)胞存活率[4]。在大鼠早期腸黏膜燙傷模型中，HSP90 和HSP70 總含量顯著升高，從而保護(hù)腸黏膜細(xì)胞和黏膜屏障[30]，可見在HSP90 發(fā)揮保護(hù)作用的同時，腸道細(xì)胞還可通過增加HSP70 的表達(dá)來抵抗應(yīng)激。HSP70 被認(rèn)為是保護(hù)腸上皮細(xì)胞免受有害物質(zhì)侵襲，防治潰瘍的重要物質(zhì)，其表達(dá)可以促進(jìn)細(xì)胞增殖，抑制細(xì)胞凋亡，促進(jìn)蛋白合成，從而加速潰瘍的愈合[4]，另外，HSP70 的表達(dá)還能夠調(diào)節(jié)腸道內(nèi)消化酶的活性，從而改善腸道消化吸收功能[5]，研究表明HSP70 還可在熱應(yīng)激誘導(dǎo)下通過絲裂原活化蛋白激酶信號通路的激活發(fā)揮對大鼠小腸損傷的保護(hù)作用[31]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示運(yùn)輸6 h 后山羊十二指腸HSP70 mRNA 水平升高，運(yùn)輸2 h和6 h 后山羊空腸HSP70 mRNA 水平增加，山羊回腸HSP70 mRNA 和蛋白水平在運(yùn)輸2 h 后明顯增加，提示HSP70 的上調(diào)對運(yùn)輸應(yīng)激山羊小腸可能起著重要的保護(hù)作用。本研究發(fā)現(xiàn)運(yùn)輸應(yīng)激后山羊十二指腸中HSP27的mRNA 水平在2 h 組、6 h 組均升高，HSP27 作為小分子HSPs 家族的一員，能夠維持細(xì)胞骨架與刺激細(xì)胞增殖[26,29]，HSP27 主要通過參與細(xì)胞死亡途徑（如壞死、凋亡或自噬）來保護(hù)細(xì)胞免受其他致命條件的傷害[32]，當(dāng)腸上皮細(xì)胞受損時，HSP27 的磷酸化可作為腸上皮細(xì)胞反應(yīng)激活的一種新型信號通路，使腸道能夠快速重建腸上皮黏膜屏障，從而保護(hù)腸道的完整性[33]。

總之，運(yùn)輸應(yīng)激會對山羊小腸顯微和超微結(jié)構(gòu)造成一定程度的損傷，運(yùn)輸后三種熱休克蛋白表達(dá)量的變化提示其可能對運(yùn)輸應(yīng)激山羊小腸起著一定的保護(hù)作用。