35 日齡撒壩仔豬盲腸發(fā)育及微生物多樣性研究

楊玉婷，高 歡，冉津銘，沈麗艷，蔣恒鑫，李雪艷，楊 光，潘洪彬*

（1.云南農(nóng)業(yè)大學(xué)動物科學(xué)技術(shù)學(xué)院，云南省動物營養(yǎng)重點實驗室，云南昆明 650201；2.達州職業(yè)技術(shù)學(xué)院，四川達州 635000；3.云南文化藝術(shù)職業(yè)學(xué)院，云南昆明 650201）

我國是養(yǎng)豬大國，擁有豐富的豬品種遺傳資源，地方品種豬達100 多種[1]。撒壩豬主要分布于滇中楚雄彝族自治州的祿勸、昆明、武定、楚雄等縣、市，以祿勸縣撒營盤（以前稱撒壩）為中心而得名，是云南省“六大名豬”之一，具有耐粗飼、肉質(zhì)優(yōu)良、適應(yīng)性強、抗逆性好等特性[2]。我國自1964 年開始飼養(yǎng)長白豬，其生長速度快，屠宰率和胴體瘦肉率高，是我國生豬飼養(yǎng)利用的主要豬種之一[3]。

豬腸道中棲息著大量的微生物，腸道微生物及其代謝產(chǎn)物與宿主營養(yǎng)物質(zhì)的消化吸收、腸道健康狀態(tài)和免疫反應(yīng)等密切相關(guān)，因此，腸道微生物也被認為是動物的重要器官之一[4]。研究顯示，單胃動物大腸中的微生物數(shù)量顯著高于小腸，盲腸、結(jié)腸和直腸是微生物聚集的主要區(qū)段，并且盲腸核心菌群有助于維持腸道的正常功能和黏膜的完整性[5]。研究發(fā)現(xiàn)，國外商品豬種和中國地方豬種的腸道微生物區(qū)系差異較大[6]。然而，目前關(guān)于撒壩豬腸道形態(tài)學(xué)和微生物多樣性的研究鮮見報道。本試驗通過比較35 日齡撒壩和長白仔豬盲腸組織形態(tài)學(xué)和微生物多樣性的差異，為合理開發(fā)利用撒壩豬及其腸道微生物資源提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗動物與試驗設(shè)計 選取均為第三胎的撒壩和長白母豬各3 頭，同一環(huán)境下單欄飼養(yǎng)，飼喂NRC 無抗日糧，日糧原料組成及營養(yǎng)成分見表1。分娩后，母豬與其分娩的仔豬在同一欄中飼養(yǎng)，母乳飼養(yǎng)至35 日齡。每頭母豬隨機選取仔豬各3 頭屠宰，每個豬種各9 頭，共18 頭仔豬；迅速取盲腸食糜于液氮保存；并取盲腸中段組織于4%甲醛固定液固定。

表1 日糧原料組成及營養(yǎng)成分

1.2 盲腸組織形態(tài)學(xué)測定 固定24 h 的盲腸組織，依次進行石蠟包埋、切片、蘇木精-伊紅（HE）染色，染色后用二甲苯透明5 min，用中性樹膠加蓋玻片封片，并利用Image-proplus 6.0（Media Cybernetics，Inc.，Rockville，MD，USA）軟件觀察盲腸形態(tài)，測量隱窩深度和肌層厚度。

1.3 16S rDNA 測序 18 個仔豬盲腸食糜樣本，根據(jù)制造商說明，使用QIAamp?Fast DNA Stool Mini Kit（Qiagen，Cat No.：19593）試劑盒提取總DNA。擴增16S V3+V4 測序區(qū)域，引物序列Forard Primer（5'→3'）：CCTACGGGRSGCAGCAG（341 F）；Reverse Primer（5'→3'）：GGACTACVVGGGTATCTAATC（806 R）。純化后的PCR 產(chǎn)物文庫用Qubit? dsDNA HS Assay Kit試劑盒進行定量檢測，按照盲腸食糜樣品的測序量要求，進行適當比例混合。利用Illumina Miseq（Miseq 2500 PE250）測序。撒壩和長白仔豬各有一個樣品建庫失敗。

1.4 生物信息學(xué)分析 在Illumina Miseq 平臺上，針對16S rDNA 的V3+V4 區(qū)進行擴增，利用雙末端測序（Paired-End）方法，通過Pandaseq 軟件利用重疊關(guān)系將雙末端測序得到的成對Reads 拼接成一條序列，得到高變區(qū)的長Reads[7]。對拼接后的Reads 進行處理，獲取Clean Reads。利用Usearch 序列分析軟件在97% 相似度下進行聚類，對聚類后的序列進行嵌合體過濾后，得到用于物種分類的OTU。使用Venn 圖確定每組中特定OTU 數(shù)量。使用QIIME 軟件基于OTU結(jié)果計算每個樣本的物種的Alpha 多樣性[8]。通過樣品之間的UniFrac 距離矩陣進行Beta 多樣性分析。LEfSe（LDA Effect Size，Linear discriminant analysis Effect Size）分析用于確定組間差異最大的OTU[9]。利用KEGG 數(shù)據(jù)庫（http://www.genome.jp/kegg），進行PICRUSt（phylogenetic investigation of communities by reconstruction of unobserved states）基因功能預(yù)測分析[10]。

1.5 統(tǒng)計分析 利用SPSS 22.0 軟件進行獨立樣本T 檢驗，結(jié)果以平均數(shù)±標準誤表示，P＜0.05 為差異顯著，P＜0.01 為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 盲腸組織形態(tài)學(xué)分析 由圖1 可知，撒壩仔豬盲腸肌層厚度高于長白仔豬（P＜0.01），隱窩深度（P＜0.05）和隱窩深度/肌層厚度比值（P＜0.01）低于長白仔豬。

圖1 撒壩和長白仔豬盲腸形態(tài)比較

2.2 OTU 聚類分析 由圖2 可知，撒壩和長白仔豬盲腸食糜的OTU 分別為715 和722 個，其中共有OTU 為572 個，分別占到80.00%和79.22%，撒壩仔豬盲腸中特有OTU 為143 個，長白仔豬盲腸中特有OTU 為150 個。

圖2 盲腸食糜OTU 組成

2.3 撒壩和長白仔豬盲腸微生物Alpha 多樣性分析 由表2 可知，長白仔豬盲腸微生物豐富度指數(shù)observed species 和多樣性指數(shù)PD whole tree 指數(shù)均高于撒壩仔豬（P＜0.05）。

表2 長白和撒壩仔豬盲腸微生物Alpha 多樣性

2.4 撒壩和長白仔豬盲腸微生物Beta 多樣性分析 由圖3 可知，基于樣本間OTUs 的未加權(quán)unifrac 分析數(shù)據(jù)結(jié)果，繪制成PCoA 圖形并在圖上顯示Adonis 分析結(jié)果。長白豬和撒壩豬明顯分離，Adonis 分析結(jié)果為R2=0.166（P=0.001）。由圖4 可知，Anosim 相似性分析發(fā)現(xiàn)R2=0.367（P=0.002）。由表3 可知，MRPP 分析顯示未加權(quán)unifrac A=0.062（P=0.002）。以上結(jié)果表明長白和撒壩仔豬盲腸食糜微生物結(jié)構(gòu)存在極顯著差異（P＜0.01）。

表3 MRPP 組間差異分析

圖3 Adonis 分析PCoA 圖

圖4 Anosim 相似性指數(shù)分析圖

2.5 撒壩和長白仔豬盲腸門水平微生物組成比較 由表4 可知，在門水平上，撒壩和長白仔豬盲腸食糜菌群相對豐度97% 以上主要由Bacteroidetes、Firmicutes、Fusobacteria 和Proteobacteria 組成；撒壩仔豬盲腸中Bacteroidetes 的相對豐度高于長白仔豬（P＜0.05），長白仔豬盲腸中Proteobacteria 的相對豐度高于撒壩仔豬（P＜0.05）。

表4 盲腸微生物門水平物種豐度分布圖

2.6 撒壩和長白仔豬盲腸屬水平微生物組成比較 兩豬種盲腸菌群在屬水平上明顯不同。由表5 可知，撒壩仔豬盲腸菌群相對豐度最高的4 個屬依次為Bacteroides、Alloprevotella、Fusobacterium和Prevotella；長白仔豬盲腸中的優(yōu)勢菌群為Prevotella，其次為Bacteroides、Fusobacterium和Alloprevotella；撒壩仔豬盲腸中Bacteroides的相對豐度高于長白仔豬（P＜0.05），而長白仔豬中Prevotella高于撒壩仔豬（P＜0.01）。

表5 盲腸微生物屬水平物種豐度分布圖

2.7 撒壩和長白仔豬盲腸差異微生物分析 基于16S rDNA 基因測序所得的物種注釋信息，我們進行了線性判別分析效應(yīng)大?。↙EfSe）的分析，以比較撒壩和長白仔豬的盲腸微生物差異，從而確定兩豬種顯著富集的微生物（圖5）。撒壩仔豬盲腸中有1 個綱（class）包括Opitutae，1 個目（order）包括Bifidobacteriales，1個科（family）包括Bifidobacteriaceae，7 個屬（genus）包括Megasphaera、ParaBacteroides、Mitsuokella、Acidam inococcus、Bifidobacterium、Gemmiger和Blautia顯著富集。

圖5 盲腸微生物L(fēng)DA 值分布柱狀圖（P＜0.05，LDA＞2）

在長白仔豬盲腸中有3 個門（phylum）包括Fibro bacteres、Synergistetes 和Proteobacteria，5 個綱（class）包括Subdivision5、Fibrobacteria、Synergistia、Epsilon proteobacteria 和Gammaproteobacteria，4 個目（order）包括Fibrobacterales、Synergistales、Aeromonadales 和Campylobacterales，5 個科（family）包括Fibrobactera ceae、Enterococcaceae、Synergistaceae、Succinivibrion aceae 和Campylobacteraceae，14 個 屬（genus）包 括Acetanaerobacterium、Anaerobiospirillum、Subdivision5 genera incertae sedis、Veillonella、Sutterella、Fibrobacter、Schwartzia、Enterococcus、Pyramidobacter、Cloacibacillus、Faecalicoccus、Roseburia、Succinivibrio和Campylobacter顯著富集。

2.8 撒壩和長白仔豬盲腸微生物的KEGG 功能預(yù)測 由圖6 可知，撒壩仔豬盲腸中顯著富集了Galactose meta bolism、General function prediction only、Arginine and proline metabolism、Lysine biosynthesis、Glycine serine and threonine metabolism 和Other transporters 共6 個信號通路。

圖6 盲腸微生物富集的信號通路LDA 值分布圖（P＜0.05，LDA＞2）

長白仔豬盲腸中顯著富集了Membrane and intracellular structural molecules、Secretion system、Carbon fixation pathways in prokaryotes、Citrate cycle TCA cycle、Bacterial secretion system、Glutathione metabolism、Vitamin B6 metabolism、Bacterial motility proteins 和Flagellar assembly 共9 個信號通路。

3 討 論

仔豬腸道健康是影響?zhàn)B豬業(yè)發(fā)展的重要因素之一，仔豬消化系統(tǒng)發(fā)育的成熟程度直接影響仔豬的消化吸收[11]。盲腸是豬進行纖維素發(fā)酵和分解的主要場所，盲腸沒有絨毛和環(huán)形皺襞，但其腸腺發(fā)達，腸腺分泌的堿性黏液與食糜發(fā)酵產(chǎn)生的酸性產(chǎn)物不含消化酶，但有溶菌酶[12]。腸腺又稱腸隱窩，隱窩深度影響腸上皮細胞的生成率，補充腸道上皮中脫落的細胞，深度越淺說明成熟細胞越多，腸道吸收能力越強，另外，腸道的肌層厚度影響腸道蠕動能力，腸道蠕動能力強則對食糜消化能力強[13]。本研究中撒壩仔豬盲腸肌層厚度高于長白仔豬，而隱窩深度和隱窩深度/肌層厚度比值低于長白仔豬，表明撒壩仔豬盲腸發(fā)育狀況優(yōu)于長白仔豬。

遺傳（品種）是影響豬腸道微生物的重要因素之一[14-15]。研究發(fā)現(xiàn)240 日齡金華豬盲腸微生物多樣性高于長白豬[6]；然而，本研究發(fā)現(xiàn)35 日齡長白仔豬盲腸微生物豐富度指數(shù)observed species 指數(shù)和多樣性指數(shù)PD whole tree 指數(shù)高于撒壩仔豬，即長白仔豬盲腸微生物Alpha 多樣性高于撒壩仔豬，這與先前的研究結(jié)果不一致，這可能是年齡和品種的差異導(dǎo)致。仔豬的交叉培養(yǎng)模型表明，哺乳母豬會影響仔豬的生長性能[16]和盲腸微生物的組成[17]。本課題組前期研究發(fā)現(xiàn)撒壩仔豬的初生重、35 日齡體重、平均日增重和體尺性狀均顯著低于長白仔豬，35 日齡撒壩仔豬空腸微生物多樣性及組成區(qū)別于長白仔豬[18]；本研究結(jié)果顯示撒壩仔豬的盲腸微生物組成和腸道形態(tài)學(xué)存在較大差異。因此，哺乳期撒壩和長白仔豬生長性能、腸道發(fā)育和腸道微生物組成的差異與宿主遺傳和哺乳母豬相關(guān)。

腸道內(nèi)核心菌群直接影響腸道功能的正常發(fā)揮[19]。研究發(fā)現(xiàn)，金華豬和長白豬盲腸門水平上的優(yōu)勢菌群為Bacteroidetes 和Firmicutes[6]，這與本研究中Firmicutes和Bacteroidetes 是撒壩和長白仔豬盲腸中的優(yōu)勢菌群的結(jié)果一致。Bacteroidetes 菌群具有發(fā)酵碳水化合物、參與糖類代謝、膽汁酸和類固醇代謝等諸多功能[20]。本研究結(jié)果顯示，撒壩仔豬的Bacteroidetes 顯著高于長白仔豬，且KEGG 功能預(yù)測結(jié)果顯示撒壩仔豬盲腸微生物與半乳糖代謝（Galactose metabolism）相關(guān)。提示撒壩仔豬通過盲腸微生物調(diào)控糖類代謝的能力可能優(yōu)于長白仔豬。

腸道微生物存在3 種腸型，分別為以Bacteroides為指示類群的腸型1（ETB）；以Prevotella為驅(qū)動的腸型2（ETP），其豐度通常與擬桿菌的豐度成反比；Firmicutes（Ruminococcus為主）占比高的腸型3（ETF）[21]。ETB 菌群結(jié)構(gòu)與富含動物蛋白和飽和脂肪酸飲食相關(guān)，并且具有Bacteroides特異的碳水化合物酶（CAZymes），與此相反ETP 腸型分解脂肪和蛋白的能力較低[22]。本研究中，撒壩仔豬盲腸的Bacteroides豐度高于長白仔豬，而長白仔豬盲腸的Prevotella豐度高于撒壩仔豬，表明撒壩仔豬為ETB 腸型，而長白仔豬為ETP 腸型，提示撒壩仔豬盲腸微生物對脂肪和蛋白的利用能力可能強于長白仔豬。

豬的盲腸是微生物發(fā)酵碳水化合物的主要場所。微生物通過發(fā)酵碳水化合物產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFAs），主要為乙酸、丙酸和丁酸。Firmicutes 菌群中的大部分細菌屬于發(fā)酵型細菌，具有更高的從飲食中獲取能量的能力，發(fā)酵出更多的SCFAs，從而促進脂肪沉積[23]。本研究結(jié)果顯示富集在撒壩仔豬盲腸中的Megasphaera、Mitsuokella、Acidaminococcus、Gemmiger和Blautia均屬于Firmicutes 菌群。其中，Megasphaera和Mitsuokella也能夠利用乳酸和琥珀酸酯產(chǎn)生短鏈脂肪酸（SCFAs）[24-25]。乙酸是膽固醇和脂肪酸的潛在前體物質(zhì)，丁酸常常作為結(jié)腸上皮細胞的能量底物，丙酸是肝臟糖異生的底物[26]。此外，SCFAs 能降低pH 進而維持腸道微生態(tài)系統(tǒng)穩(wěn)定[27]。因此，作為腸道微生物菌群產(chǎn)生的非直接營養(yǎng)物質(zhì)，SCFAs 在調(diào)節(jié)能量代謝、免疫、腸道發(fā)育方面有著重要的作用。本研究結(jié)果表明撒壩仔豬可能通過盲腸的Megasphaera、Mitsuokella等Firmicutes 菌群產(chǎn)生SCFAs 調(diào)節(jié)機體的能量代謝、免疫和腸道發(fā)育。

人們普遍認為地方豬的抗病能力強于外來品種，推測可能與豬腸道中的微生物有關(guān)[28]。Proteobacteria 是細菌中最大、最多樣化的一門，在動物胃腸道疾病的臨床診斷中具有重要的意義，研究發(fā)現(xiàn)腸道炎性疾病發(fā)生會導(dǎo)致腸道中Proteobacteria 數(shù)目增加[29]。而Bifidobacterium是動物腸道內(nèi)的優(yōu)勢菌群之一，具有免疫調(diào)節(jié)、抗腫瘤、抗致病、抗炎癥等多種生物學(xué)功能，是重要的益生菌，Bifidobacterium可通過特殊的雙歧支路代謝途徑分解糖類碳水化合物最終生成乙酸和乳酸[30-31]。并且Bifidobacterium還可分泌a、β-半乳糖苷酶、α、β-葡萄糖苷酶及人體不能消化的寡糖的肽酶、磷蛋白磷酸酶、膽酸代謝酶、結(jié)合膽酸水解酶、降解N-亞硝酸的酶等許多種酶類參與代謝[32]。本研究中長白仔豬盲腸Proteobacteria 豐度高于撒壩仔豬以及撒壩仔豬盲腸Bifidobacterium豐度高于長白仔豬，提示撒壩仔豬的強抗病能力可能與盲腸中低豐度的Proteobacteria 和高豐度Bifidobacterium有關(guān)。

Mitsuokellasp.和Megasphaeraelsdenii-like是繼代培養(yǎng)中利用賴氨酸、蘇氨酸、精氨酸和谷氨酸的優(yōu)勢菌[33]。本研究中，Megasphaera、Mitsuokella顯著富集在撒壩仔豬盲腸中，且KEGG 功能預(yù)測結(jié)果顯示撒壩仔豬盲腸微生物主要與氨基酸代謝相關(guān)（精氨酸和脯氨酸代謝、賴氨酸的生物合成、甘氨酸、絲氨酸和蘇氨酸代謝），因此，撒壩仔豬可能通過Mitsuokella.和Megasphaera促進精氨酸、脯氨酸代謝和賴氨酸等多種氨基酸的合成與代謝，這為進一步解釋不同品種豬在氨基酸利用上的差異研究提供了思路。

4 結(jié) 論

本試驗結(jié)果顯示，撒壩仔豬盲腸發(fā)育較好，食糜消化能力更強；撒壩仔豬盲腸微生物多樣性低于長白仔豬，撒壩仔豬傾向于ETB 腸型，撒壩仔豬通過盲腸微生物對能量的吸收和儲存能力可能優(yōu)于長白仔豬并且撒壩仔豬可能通過Mitsuokella和Megasphaera促進精氨酸、脯氨酸代謝和賴氨酸等多種氨基酸的合成與代謝。