孫志廣 王寶祥 周振玲 方 磊 遲 銘 李景芳 劉金波 Bello Babatunde Kazeem 徐大勇

連云港市農業(yè)科學院 / 江蘇省現(xiàn)代作物生產協(xié)同創(chuàng)新中心, 江蘇連云港 222006

水稻是世界上最重要的糧食作物之一, 水稻的穩(wěn)產增產事關全球的糧食安全[1-3]。在我國, 傳統(tǒng)的移栽種植模式在長時間里為我國糧食增產、農民增收發(fā)揮了十分重要的作用[4], 但是隨著我國城鎮(zhèn)化的有序推進, 農村勞動力大量減少, 插秧期間對勞動力的高需求阻礙著傳統(tǒng)移栽模式的進行。與傳統(tǒng)移栽模式相比, 直播稻整地用水量少, 連續(xù)淹水天數(shù)少、對灌溉水利用效率高, 而且便于機械化操作[5-7]。在此背景下, 隨著適宜新品種的育成和栽培技術的進步, 資源和勞動力節(jié)約型的輕簡栽培方式—直播稻得到了較大的發(fā)展[8-9]。

出苗率低是水稻直播中面臨的一個主要問題,當種子被水淹沒時, 由于氧氣濃度急劇降低, 種子有氧呼吸受到嚴重抑制, 導致出苗率顯著下降[10]。因此, 在淹水條件下, 選擇出苗能力好的耐淹性水稻品種將在直播稻安全生產中起到十分重要的作用。已有研究表明, 在低氧條件下萌發(fā)的水稻種子胚芽鞘長度與耐淹成苗率呈極顯著的正相關[11-14]。隨著分子標記技術的發(fā)展, 前人以胚芽鞘長度為指標, 利用多種遺傳群體定位到多個萌發(fā)耐淹性QTL, 侯名語等[11]以水淹脅迫下暗發(fā)芽5 d 后的胚芽鞘長為指標, 評價了359 份水稻品種的耐低氧發(fā)芽能力, 其中11%粳稻品種芽鞘長度超過3.0 cm,而芽鞘長度超過3.0 cm 秈稻品種僅占2%, 其認為秈粳稻在耐低氧發(fā)芽能力方面存在差異。隨后其利用Kinmaze/DV85 RIL 群體, 在水稻1 號、2 號、5號和7 號染色體上共檢測到5 個低氧發(fā)芽相關QTL位點, 可解釋表型變異為 10.5%～19.6%。陳孫祿等[15]通過對256 份水稻核心種質進行萌發(fā)耐淹性評估, 認為秈粳稻的萌發(fā)耐淹性差異并不顯著, 與侯名語的結果不一致, 這可能是兩者所用試驗材料和方法不同造成的。隨后其利用R0380/RP2334 回交自交系群體在水稻2 號、3 號、8 號染色體上檢測到4 個QTL, 貢獻率為9.37%～17.34%。Jiang 等[16]利用USSR5/N22 F2分離群體在水稻5 號和11 號染色體上檢測到 2 個萌發(fā)耐淹性 QTL, 貢獻率為10.99%～15.51%。然而以上試驗多是在直接淹水脅迫下進行的, 為了更準確的模擬大田淹水環(huán)境下種子的低氧萌發(fā)狀態(tài), 本研究采用土壤介質下的種子萌發(fā)耐淹性鑒定方法, 以胚芽鞘長度為指標進行萌發(fā)耐淹性種質資源篩選, 并進一步構建分離群體挖掘萌發(fā)耐低氧 QTL, 為培育耐淹萌發(fā)能力強的水稻新品種提供參考。

1 材料與方法

1.1 種質資源

供試材料包括192 份水稻種質資源, 其中191份為粳稻品種, 來自我國江蘇、安徽、河南、山東、上海等地區(qū), 1 份為秈型常規(guī)水稻黃莉占, 來自廣東省。定位群體來自以連粳15 號(Lianjing 15, LJ15)為父本, 黃莉占(Huanglizhan, HLZ)為母本構建的F2:3分離群體, 該群體包含120 個家系。為減少種子休眠帶來的影響, 所有供試材料均在50℃高溫條件下處理7 d 以打破種子休眠。

1.2 試驗方法

模擬大田萌發(fā)耐淹鑒定: 每品種或家系挑選健康、飽滿和均一的種子90 粒, 分3 次重復, 在2%H2O2中滅菌15 min, 隨后用純水沖洗5 次, 浸種48 h 后, 每重復挑選20 粒吸足水分的種子, 播種于含有50 個方孔的秧盤中, 秧盤中盛滿細土, 播種深度1 cm, 方孔規(guī)格為5.5 cm × 5.5 cm × 5.0 cm, 每個方孔底部均有直徑為0.8 cm 的小圓孔, 以便排水,秧盤置于57 cm × 38 cm × 9 cm 規(guī)格的周轉箱中,隨后向周轉箱中注入純水至水面距離土壤表面5 cm,每天注水以保持此高度不變, 以萌發(fā)7 d 的胚芽鞘長度(coleoptile length, CL)作為萌發(fā)耐淹性的調查指標, 每重復隨機取12 粒種子測量胚芽鞘長度, 精確到1 mm。隨機區(qū)組排列, 剔除極大值和極小值后,取3 次胚芽鞘長度平均值作為表型值進行品種比較分析、遺傳分析和QTL 檢測。

梯度試驗: 分別設置9 個不同的淹水深度對連粳15 號和黃莉占進行萌發(fā)耐淹性測試, 水深分別為10、30、50、70、90、110、130、150 和200 mm, 其余步驟同上。

以上試驗均在溫室中進行, 溫度: (26±2)℃,光∶暗 = 14∶10, 相對濕度80%左右。

1.3 遺傳連鎖圖譜的構建及QTL 分析

根據(jù)連粳15 號/黃莉占F2:3分離群體的分子數(shù)據(jù),利用 Mapmaker/EXP version 3.0 軟件(http://www.softpedia.com/get/Science-CAD/MapMaker.shtml) 構建分子連鎖圖譜, 運用Kosambi 函數(shù)將重組頻率轉換為遺傳距離(cM), 隨后結合表型數(shù)據(jù), 利用Windows QTL Cartographer version 2.5 軟件(http://statgen.ncsu.edu/qtlcart/WQTLCart.htm) 以復合區(qū)間作圖的方法進行QTL 檢測, 以LOD 值3.0 作為閾值判定QTL 是否存在, 同時利用該軟件進行各QTL 的貢獻率和加性效應值的計算。

1.4 數(shù)據(jù)分析

利用Microsoft Excel 2010 進行數(shù)據(jù)整理和頻數(shù)分布直方圖的繪制, SPSS 18.0 軟件進行方差、多重比較分析和KS-檢驗。

2 結果與分析

2.1 萌發(fā)耐淹性種質資源篩選

以萌發(fā)7 d 的胚芽鞘長為指標, 本研究對來自不同年代和地區(qū)的191 份粳稻種質資源進行萌發(fā)耐淹能力測試, 結果見附表1, 191 份種質資源胚芽鞘長頻數(shù)分布直方圖呈偏態(tài)分布的特點(圖1-A), 該群體的胚芽鞘長的變化范圍為0～34.6 mm, 變異系數(shù)為21.8%, 表明這些種質資源在萌發(fā)耐淹性上具有廣泛的遺傳多樣性。群體胚芽鞘長平均值為24.1 mm,其中胚芽鞘長度小于20 mm 種質資源總共有19 份,總占比9.9%, 處于20～25 mm 之間的品種最多, 有90 份, 占比47.1%, 其次為25～30 mm, 有67 份, 占比35.1%, 其中 >30 mm 品種有12 個(表1), 占比6.3%, 這些種質表現(xiàn)出較強的耐低氧萌發(fā)能力, 可作為親本材料進行萌發(fā)耐低氧新品種的培育。其中連云港地區(qū)的半野生稻種質資源 穞稻表現(xiàn)最好, 胚芽鞘長 34.6 mm, 其次為連粳 15 號, 胚芽鞘長34.2 mm。值得注意的是, 連粳15 號(連粳7032/連粳446)的親本之一連粳446也是由 穞稻與連粳3 號的雜交后代中選育而來, 推測連粳15 號的萌發(fā)耐淹性大多來自 穞稻, 因此, 應加大力度深入挖掘野生稻種的有利基因以增強水稻品種對生物脅迫和非生物脅迫的抗性。

2.2 不同年代種質資源萌發(fā)耐淹性比較分析

根據(jù)品種審定年份將83 份種質資源按照5 年一個階段劃分為6 組, 分別為1990 年前、1991—1995 年、1996—2000 年、2001—2005 年、2006—2010 年和2010年后, 通過萌發(fā)耐淹性鑒定, 6 個時間段品種的平均胚芽鞘長分別為24.8、24.7、25.3、26.7、25.4 和28.8 mm(圖1-B), 經過多重比較分析發(fā)現(xiàn), 前5 個時間段, 品種之間的胚芽鞘長沒有顯著性差異, 但均與2010 年以后品種的胚芽鞘長達到顯著性差異, 這表明育種家們已開始加強對萌發(fā)耐淹性品種的選育。

表1 12 份萌發(fā)耐淹性強的種質資源Table 1 Top 12 germplasm resources with high germinability under submerged condition

2.3 連粳15 號萌發(fā)耐淹性驗證

通過對191 份種質資源進行篩選鑒定, 粳稻品種連粳15 號在淹水脅迫下的胚芽鞘長為34.2 mm,表現(xiàn)出較強的耐低氧發(fā)芽力, 為了驗證該表型,我們重新對其進行鑒定, 連粳 15 號胚芽鞘長為33.1 mm, 秈稻品種黃莉占胚芽鞘長為8.6 mm, 顯著低于連粳15 號(圖2-A, B); 同時, 梯度試驗表明, 在水深10 mm 時, 連粳15 號與黃莉占的胚芽鞘長無顯著性差異, 因為此時淹水深度較淺, 2 個品種的胚芽鞘均能很快伸出水面接觸到氧氣, 完成正常生長, 而在其他淹水處理下, 連粳15 號的胚芽鞘長均顯著高于黃莉占(圖2-C)。因此, 連粳15 號和黃莉占可作為理想的材料進行萌發(fā)耐淹性QTL 檢測。

2.4 萌發(fā)耐淹性QTL 檢測

利用512 對分布于12 條水稻染色體上的SSR(simple sequence repeat, SSR)標記進行分離群體雙親間的多態(tài)性分析, 其中在連粳15 號與黃莉占之間呈現(xiàn)良好多態(tài)性的SSR 標記共有146 對, 占所有檢測標記的28.5%, 隨后利用這些標記構建連粳15 號/黃莉占 F2:3群體的分子連鎖圖譜, 圖譜全長為1262.4 cM, 標記之間的平均遺傳距離為8.6 cM, 符合QTL 檢測要求。

為了檢測萌發(fā)耐淹性QTL, 本研究于2018年對連粳15號、黃莉占及其F2:3群體進行萌發(fā)耐淹性鑒定, 連粳15 號和黃莉占的胚芽鞘長分別為31.9 mm 和5.0 mm, 兩者之間存在極顯著差異(圖3-A), 連粳15 號/黃莉占 F2:3分離群體胚芽鞘長的變化范圍為0～31.5 mm, 在20～25 mm 處出現(xiàn)1 個峰值, 呈典型的正態(tài)分布特征(KS-檢驗,P> 0.05), 表明該群體的萌發(fā)耐淹性由多個QTL 共同控制。以平均胚芽鞘長為表型值, 利用Windows QTL Cartographer 2.5 軟件采用復合區(qū)間作圖法進行分析, 在水稻1 號、3 號、9 號和10 號染色體上各檢測到1 個QTL, 分別命名為qGS1、qGS3、qGS9和qGS10, 分別坐落于標記RM11307～RM7341、RM15283～RM5626、RM24085～RM24271 和RM474～RM6404 之間, LOD 值分別為6.7、3.6、3.3 和6.1, 貢獻率分別為24.0%、14.7%、11.7%和20.5%, 共解釋表型變異的70.9% (表2 和圖4), 加性效應分析表明, 這些增強萌發(fā)耐淹性的QTL 均來自粳稻品種連粳15 號。

2.5 萌發(fā)耐淹性QTL 的驗證

為進一步驗證以上QTL 的真實性, 本研究于2019 年再次對120 個連粳15 號/黃莉占F2:3家系及其雙親進行表型鑒定(圖3-B), 結合分子連鎖圖譜,利用Windows QTL Cartographer 2.5 軟件對以上位點進行了重新檢測, 結果表明,qGS1、qGS3和qGS10均能夠被重新檢測到, LOD 值分別為5.1、3.0 和5.6, 貢獻率分別為19.2%、12.6%和19.1%(表2 和圖4), 以上結果證明這些QTL 是穩(wěn)定表達真實存在的。

表2 連粳15 號/黃莉占F2:3 群體中檢測到的萌發(fā)耐淹性QTLTable 2 QTLs for germinability under submerged condition (GS) detected in the LJ15/HLZ F2:3 population

3 討論

水稻直播作為一種輕簡、高效、節(jié)水、省工的栽培方式, 越來越受到種植者的歡迎[17]。然而, 在淹水脅迫下, 特別是當種子播在較深土層時, 由于氧氣濃度過低導致出苗率急劇下降, 嚴重制約著直播稻的發(fā)展[18]。多項研究表明, 種子萌發(fā)耐淹性存在著品種間差異[19-21], 選擇低氧萌發(fā)能力強的稻種是直播稻生產中提高出苗率的一個關鍵問題。因此,篩選萌發(fā)耐淹性強的種質資源, 挖掘低氧耐受基因,并解析其低氧適應機制已迫在眉睫。本研究通過對191 份粳稻種質資源進行萌發(fā)耐淹性鑒定, 發(fā)現(xiàn)該性狀的頻率分布直方圖呈現(xiàn)偏態(tài)分布特點, 說明該性狀受到育種家的人工選擇, 其中胚芽鞘長為20～25 mm 的種質資源占比最多, 達到47.1%, 該群體變異系數(shù)為21.8%, 表明粳稻品種的萌發(fā)耐淹性存在廣泛的遺傳變異, 與前人研究結果一致[12,16,22]。經過篩選, 最終獲得12 份萌發(fā)耐淹性強的水稻種質(胚芽鞘長>30 mm) (表1), 這些資源可作為親本材料用來選育萌發(fā)耐低氧的水稻品種。

通過不同年代品種間的比較分析, 我們發(fā)現(xiàn)2010年后審定的品種平均胚芽鞘長度為28.8 mm,相對于前期品種, 在低氧脅迫下的萌發(fā)能力顯著性提高, 這表明隨著耕作栽培制度的改變, 育種家們?yōu)榱诉m應以直播稻為主的輕簡栽培的需要, 已開始加強對品種的萌發(fā)耐淹性狀的選擇。同時我們也比較了不同種植區(qū)域種質資源的耐淹萌發(fā)能力, 發(fā)現(xiàn)并沒有達到顯著的地域性差異, 這說明在不同區(qū)域環(huán)境條件下, 萌發(fā)耐淹性是水稻在馴化擴散過程中的一個基本特性。

前人研究已經表明, 萌發(fā)耐淹性是由多基因控制的數(shù)量性狀[14,16,23-24], 本研究通過資源鑒定, 發(fā)現(xiàn)粳稻品種連粳15號表現(xiàn)出較強的低氧萌發(fā)能力,利用其與秈稻品種黃莉占的F2:3群體共檢測到4個QTL, 再次驗證了該觀點。孫凱等[14]利用全基因組關聯(lián)分析, 在水稻3 號、4 號、5 號、6 號、8 號、10 號和11 號染色體上共檢測到15 個與胚芽鞘長度顯著關聯(lián)的位點, 其中位于3 號染色體上的位點在本研究檢測位點qGS3兩端標記區(qū)間內, 這2 個QTL很可能是同一個位點, 隨后其通過轉錄組測序發(fā)現(xiàn)該位點區(qū)間內基因Os03g0592500對氧氣處理敏感,該基因編碼一個葉綠素a-b結合蛋白, 并推測該基因對水稻種子耐淹生長具有正調控作用。王洋等[24]利用粳稻Nipponbare 與秈稻Kasalath BIL 群體也在水稻3 號染色體上檢測到1 個耐低氧發(fā)芽能力QTL,qSAT-3-B, 與qGS3的物理位置十分接近, 是否為同一個QTL 尚需進一步確認。目前前人已克隆2 個耐淹基因,CIPK15和Sub1, 其中,CIPK15在種子萌發(fā)階段通過糖信號途徑產生更多能量促使胚芽鞘快速生長以應對淹水脅迫[25], 而Sub1則通過調節(jié)乙烯和赤霉素介導的反應, 抑制水稻淹水期的營養(yǎng)生長,以節(jié)約能量促進去淹沒后的恢復生長來達到提高水稻耐淹性的目的[26]。通過比對分析, 這2 個基因均在水稻9 號染色體上著絲粒附近, 與本研究檢測到的qGS9在染色體上的距離超過1700 kb, 三者為不同的基因。王洋等[24]也在水稻9 號染色體上檢測到1 個QTL,qSAT-9-B, 貢獻率為9.5%, 與本研究檢測到的qGS9有部分重疊區(qū)域, 可能為同一個QTL, 值得注意的是,qGS9未在連續(xù)的2 年試驗中重復檢測到, 這可能是由于qGS9本身效應較小, 且受到環(huán)境影響, 表達不穩(wěn)定造成。通過比對分析, 本研究檢測到的位于水稻第1 和10 染色體上的QTL, qGS1 和qGS10, 與前人報道萌發(fā)耐淹性QTL 沒有重疊區(qū)域,是2 個新的萌發(fā)耐淹性QTL 位點, 而且這2 個QTL都能被重復檢測到, 2 次檢測中LOD 值均大于5, 分別解釋表型變異的19.2～24.0%, 19.1～20.5%, 是穩(wěn)定表達的QTL。因此, 利用與之緊密連鎖的分子標記,通過分子標記輔助選擇的手段聚合這些萌發(fā)耐淹性QTL, 將有助于加快培育耐低氧萌發(fā)水稻新品種。

4 結論

從191 份粳稻中篩選獲得12 份萌發(fā)耐淹性強的種質資源, 并利用連粳15 號/黃莉占F2:3群體, 共檢測到4 個萌發(fā)耐淹性QTL,qGS1、qGS3、qGS9和qGS10, 分別位于水稻1 號、3 號、9 號和10 號染色體上, 貢獻率分別為24.0%、14.7%、11.7%和20.5%,其中qGS1和qGS10真實可靠, 且貢獻率較高, 這些QTL 的定位為進一步開展相關基因的圖位克隆和分子輔助育種奠定基礎。

附表1 191 份種質資源的萌發(fā)耐淹性表現(xiàn)Table S1 Germinability of 191 germplasm resources under submerged condition

(續(xù)附表1)

(續(xù)附表1)