徐瑋 邵穎穎 杜二球

[摘要] 目的 探討氯氰菊酯對青春期雄性大鼠生殖系統(tǒng)的影響及相關(guān)機制。 方法 隨機將40只SD健康青春期雄性大鼠分為正常組和低、中、高劑量組各10只，四組大鼠分別進行干預。采用RT-PCR法檢測miR-409b、miR-30b-3p表達，檢測各組大鼠生殖系統(tǒng)重量，檢測精子生成、存活情況，采用免疫透射比濁法檢測性激素、氧化應(yīng)激指標水平。 結(jié)果 高劑量組miR-409b、miR-30b-3p表達、精囊重量高于低、中劑量組（P<0.05），前列腺、睪丸、附睪重量及精子數(shù)量、每日精子生成量、精子成活率低于低、中劑量組（P<0.05）。高劑量組T、LH水平低于低、中劑量組（P<0.05），F(xiàn)SH、LPO、TAS、ROS水平高于低、中劑量組（P<0.05）。 結(jié)論 氯氰菊酯干預能夠調(diào)控青春期雄性大鼠miR-409b、miR-30b-3p表達，影響大鼠生殖系統(tǒng)發(fā)育、精子生成、存活及性激素水平，其機制可能是氯氰菊酯干預能夠引起睪丸氧化應(yīng)激反應(yīng)。

[關(guān)鍵詞] 氯氰菊酯;生殖系統(tǒng);氧化應(yīng)激;睪丸;性激素;精囊;精子生成

[中圖分類號] R392.5? ? ? ? ? [文獻標識碼] A? ? ? ? ? [文章編號] 1673-9701（2021）28-0027-04

Effect of cypermethrin on reproductive system of adolescent male rats through regulation of miR-409b and mechanisms

XU Wei1? ?SHAO Yingying2? ?DU Erqiu1

1.Department of Obstetrics and Gynecology， Taizhou Central Hospital in Zhejiang Province， Taizhou University Hospital， Taizhou 318000， China; 2.Department of Gastroenterology， Taizhou Hospital of Zhejiang Province affiliated to Wenzhou Medical University， Taizhou? ?317000， China

[Abstract] Objective To explore the effect of cypermethrin on reproductive system of adolescent male rats and related mechanisms. Methods A total of 40 healthy male SD rats were randomly divided into the normal group， the low-dose group， the medium-dose group， and the high-dose group， with 10 rats in each group. The four groups were intervened separately. The RT-PCR method was used to detect the expression of miR-409b and miR-30b-3p. The weights of reproductive system of rats in each group were collected. The spermatogenesis and survival status were recorded. The immunoturbidimetric method was used to detect the levels of sex hormones and oxidative stress indicators. Results The expression of miR-409b and miR-30b-3p and weight of seminal vesicles in the high-dose group were higher than those in the low-and medium-dose groups（P<0.05）. The weight of prostate， testes and epididymis， number of sperm， daily spermatogenesis， and sperm survival rate in the high-dose group were lower than those in the low-and medium-dose groups（P<0.05）. The levels of T and LH in the high-dose group were lower than those in the low-and medium-dose groups（P<0.05）， while the levels of FSH， LPO， TAS， and ROS in the high-dose group were higher than those in the low-and medium-dose groups （P<0.05）. Conclusion Cypermethrin intervention can regulate expression of miR-409b and miR-30b-3p in adolescent male rats， and affect development of reproductive system， spermatogenesis， survival， and sex hormone levels. The mechanism may be that cypermethrin intervention can cause testicular oxidative stress.

[Key words] Cypermethrin; Reproductive system; Oxidative stress; Testes; Sex hormones; Seminal vesicles; Spermatogenesis

據(jù)不完全統(tǒng)計，我國農(nóng)業(yè)不斷發(fā)展，農(nóng)藥應(yīng)用范圍較為廣泛，由農(nóng)藥引起的人體健康問題日益增多，引起廣大專家學者的關(guān)注[1-2]?，F(xiàn)階段農(nóng)藥污染已成為我國主要的環(huán)境污染源之一，長期生活于農(nóng)藥污染環(huán)境中會對人體健康造成一定的影響，主要表現(xiàn)為農(nóng)藥對人體生殖系統(tǒng)、神經(jīng)系統(tǒng)、免疫系統(tǒng)的危害。有研究表明，長期、大量氯氰菊酯暴露會對機體造成一定的危害[3]。氯氰菊酯為我國常用的菊酯類農(nóng)藥，應(yīng)用范圍包含林業(yè)、農(nóng)業(yè)、公共衛(wèi)生等各個領(lǐng)域，具有高效、毒性較小的特點。但是，近年來有專家在空氣、土壤中發(fā)現(xiàn)大量的氯氰菊酯殘留[4-5]。基于此，有學者設(shè)計動物實驗探討氯氰菊酯的毒害作用發(fā)現(xiàn)，氯氰菊酯可能對雄性生殖系統(tǒng)造成一定的影響，但其具體作用機制尚未研究透徹[6]。本研究使用氯氰菊酯對青春期雄性大鼠進行干預，探討其機制，現(xiàn)報道如下。

1 材料與方法

1.1 材料來源

選取40只SD健康青春期雄性大鼠[廣東君睿生物技術(shù)研究有限公司，使用許可證號：SYXK（粵）2020-0217]，年齡9～10周，平均（9.5±0.4）周;體重223～247 g，平均（235.2±9.6）g。在相對濕度50%～55%、溫度（22.9±3.1）℃的環(huán)境中喂養(yǎng)1周，光照12 h/d。本研究獲得我院醫(yī)學倫理委員會批準。

主要試劑：氯氰菊酯（成都科利隆生化有限公司，國藥準字H20190901）;小鼠抗兔miR-409b抗體（美國Selleck公司，批號：S8753）;兔抗小鼠miR-30b-3p抗體（美國Invitrogen公司，批號：C1358）;兔抗大鼠LH、FSH抗體（美國Hyclone公司，批號：A25291，A23652）;大鼠抗小鼠T抗體（丹麥Dako公司，批號：D9231）;小鼠抗大鼠LPO抗體（美國Gibco公司，批號：A26135）;兔抗大鼠TAS抗體（美國Sigma公司，批號：D9423）;小鼠抗兔ROS抗體（美國BD公司，批號：N3667）。

1.2 方法

1.2.1 建模及分組干預? 采用隨機數(shù)字表法將40只SD健康青春期雄性大鼠分為正常組和低、中、高劑量組各10只。正常組大鼠平均年齡（9.4±0.5）周，平均體重（236.1±9.9）g;低劑量組大鼠平均年齡（9.5±0.3）周，平均體重（234.6±8.7）g;中劑量組大鼠平均年齡（9.4±0.5）周，平均體重（235.8±9.2）g;高劑量組大鼠平均年齡（9.6±0.4）周，平均體重（236.7±10.3）g。四組大鼠一般資料比較，差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05），具有可比性。取氯氰菊酯，使用玉米油配置20、40、60 mg/kg氯氰菊酯溶液，分別對低、中、高劑量組大鼠灌胃處理，連續(xù)處理15 d，正常組大鼠使用生理鹽水灌胃處理，連續(xù)處理15 d。

1.2.2 檢測方法? ①采用RT-PCR法檢測miR-409b、miR-30b-3p表達。取各組大鼠腹部靜脈血3 mL，使用2000 r/min離心機（湖南凱達科學儀器有限公司，型號：KL05R）離心處理15 min后-40℃保存。取TRIzol試劑（廣州濟恒醫(yī)藥科技有限公司）添加至血清標本，靜置15 min后添加600 μL三氯甲烷進行攪拌，直至混合溶液顏色變?yōu)槿榘咨?，將其置?℃環(huán)境保存15 min后取出進行離心處理，取上清液，等量添加異丙醇后再次離心處理，1 mL 75%乙醇洗滌后提取總RNA，測試完整性，合成cDNA，逆轉(zhuǎn)錄處理后行PCR擴增，2-△△Ct方法計算微小RNA-409b（miR-409b）、微小RNA-30b-3p（miR-30b-3p）表達。

1.2.3 生殖系統(tǒng)重量檢測? 對各組大鼠麻醉處理后，頸椎脫臼法處死，取各組大鼠精囊、前列腺、睪丸、附睪組織，使用5℃生理鹽水清洗血液后將表面水分吸干，稱重并記錄。

1.2.4 免疫組化染色? 取大鼠睪丸組織，并切做2 mm×2 mm小塊，反復清洗后浸泡于福爾馬林溶液。脫水后石蠟包埋、切片、脫蠟水化。檸檬酸修復液煮沸后加入切片，2 min后開蓋，PBS液清洗3次。滴加POD阻斷劑，30 min后PBS液清洗，滴加一抗4℃過夜。次日吸除一抗后PBS液清洗，滴加二抗，常溫孵育30 min后PBS液清洗，DAB染色，并使用顯微鏡觀察。蘇木精染核、反藍、脫水處理后封片。

1.2.5 精子生成、存活情況檢測? 取部分睪丸組織，添加25 mL SMT溶液（上海尚寶生物有限公司）后制作勻漿液，使用細胞計數(shù)板（廣州濟恒醫(yī)藥科技有限公司）對精子數(shù)量進行統(tǒng)計，并計算每日精子生成量及精子成活率，每日精子生成量=精子計數(shù)池均值×方格系數(shù)×細胞計數(shù)板系數(shù)×稀釋倍數(shù)/（勻漿重量×精子平均生成時間）。

1.2.6 免疫透射比濁法檢測性激素、氧化應(yīng)激指標水平? 取各組大鼠血清標本進行稀釋，準備3個潔凈試管標記為對照管、標準管、檢測管，均添加350 μL緩沖液，之后3管分別添加20 μL蒸餾水、標準液、血清標本震蕩均勻，置于37℃保溫箱（北京福意電器有限公司，型號：FYL-YS-150L）中保存15 min，比色，于340 nm、700 nm波長處測定免疫復合物濁度，根據(jù)吸光度計算睪酮（T）、促黃體生成素（LH）、促卵泡生成素（FSH）及過氧化脂（LPO）、總抗氧化態(tài)（TAS）、活性氧（ROS）水平。

1.3 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 26.0統(tǒng)計學軟件進行數(shù)據(jù)分析，計量資料以（x±s）表示，多組比較進行方差分析，組間比較采用獨立樣本t檢驗，P<0.05為差異有統(tǒng)計學意義。

2 結(jié)果

2.1 各組大鼠miR-409b、miR-30b-3p表達比較

低、中、高劑量組miR-409b、miR-30b-3p表達高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;高劑量組miR-409b、miR-30b-3p表達高于低、中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表1、封三圖3。

2.2 各組大鼠生殖系統(tǒng)重量比較

低、中、高劑量組大鼠精囊重量高于正常組，前列腺、睪丸、附睪重量低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;高劑量組大鼠精囊重量高于低、中劑量組，前列腺、睪丸、附睪重量低于低、中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表2。

2.3 各組大鼠精子生成、存活情況比較

低、中、高劑量組大鼠精子數(shù)量、每日精子生成量、精子成活率低于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;高劑量組大鼠精子數(shù)量、每日精子生成量、精子成活率均低于低、中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表3。

2.4 各組大鼠性激素水平比較

低、中、高劑量組大鼠T、LH水平低于正常組，F(xiàn)SH水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;高劑量組大鼠T、LH水平低于低、中劑量組，F(xiàn)SH水平高于低、中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表4。

2.5 各組大鼠氧化應(yīng)激指標水平比較

低、中、高劑量組大鼠LPO、TAS、ROS水平高于正常組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）;高劑量組大鼠LPO、TAS、ROS水平高于低、中劑量組，差異有統(tǒng)計學意義（P<0.05）。見表5。

3 討論

本研究結(jié)果顯示，使用氯氰菊酯干預的青春期雄性大鼠精囊重量上升，前列腺、睪丸、附睪重量下降，且隨著氯氰菊酯干預劑量的上升，這種變化趨勢更明顯?，F(xiàn)階段農(nóng)藥污染已成為我國主要的環(huán)境污染源之一，人體長期生活于農(nóng)藥污染環(huán)境中會對其健康造成一定的影響，其中主要體現(xiàn)在對機體生殖系統(tǒng)的危害[7-9]。有研究表明，氯氰菊酯暴露下的雄性大鼠生殖系統(tǒng)受到一定程度的影響，主要體現(xiàn)在前列腺、睪丸、附睪等組織重量出現(xiàn)明顯變化[10]。本研究結(jié)果表明，在氯氰菊酯干預下，青春期雄性大鼠生殖系統(tǒng)受到一定的影響，且這種影響程度與氯氰菊酯劑量具有一定相關(guān)性。上述實驗發(fā)現(xiàn)，氯氰菊酯能夠影響青春期雄性大鼠生殖系統(tǒng)，本研究推測其機制可能是氯氰菊酯干預能夠調(diào)控生殖相關(guān)基因表達，從而起到影響機體生殖系統(tǒng)的作用。本研究結(jié)果顯示，使用氯氰菊酯干預的青春期雄性大鼠miR-409b、miR-30b-3p表達上調(diào)，隨著氯氰菊酯干預劑量的上升，miR-409b、miR-30b-3p表達上調(diào)幅度更加明顯。微小RNA（miRNA）廣泛存在于大多數(shù)生物中，具有組織特異性、穩(wěn)定性、保守性等特點，與機體多種生物學行為密切相關(guān)。有研究表明，大量miRNA在機體生殖系統(tǒng)損傷中發(fā)揮重要作用[11-14]，其中miR-409b、miR-30b-3p表達變化與機體生殖系統(tǒng)狀況具有密切聯(lián)系。本研究結(jié)果表明，氯氰菊酯干預能夠調(diào)控miR-409b、miR-30b-3p表達，從而導致大鼠生殖系統(tǒng)損傷，為機體生殖系統(tǒng)損傷的治療提供新的靶點和研究方向。

本研究結(jié)果顯示，使用氯氰菊酯干預的青春期雄性大鼠精子數(shù)量、每日精子生成量、精子成活率均出現(xiàn)下降。本研究前期實驗顯示，在氯氰菊酯的干預下，青春期雄性大鼠睪丸發(fā)育受到嚴重影響，由此推測在氯氰菊酯的影響下，大鼠精子生成、成活情況會受到一定的影響。有研究表明，氯氰菊酯干預下會影響雄性大鼠生殖系統(tǒng)，從而對大鼠精子生成造成一定的影響。本研究結(jié)果表明，氯氰菊酯干預對青春期雄性大鼠精子生成、存活造成一定的影響，這一情況的出現(xiàn)原因與氯氰菊酯干預影響雄性大鼠睪丸發(fā)育具有密切聯(lián)系。

本研究結(jié)果顯示，使用氯氰菊酯干預的青春期雄性大鼠T、LH水平下降，F(xiàn)SH水平上升。前期實驗顯示，在氯氰菊酯的干預下，青春期雄性大鼠生殖系統(tǒng)發(fā)育受到一定的影響，由此推測氯氰菊酯干預可能會對大鼠性激素分泌造成一定的影響。T、LH、FSH為常用的性激素指標，三者水平變化與機體生殖系統(tǒng)狀況具有密切聯(lián)系[15-17]。本研究結(jié)果表明，氯氰菊酯干預能夠影響青春期雄性大鼠的性激素分泌。

本研究結(jié)果顯示，使用氯氰菊酯干預的青春期雄性大鼠LPO、TAS、ROS水平上升。生殖系統(tǒng)損傷的發(fā)生發(fā)展伴隨著機體生殖系統(tǒng)氧化應(yīng)激反應(yīng)，LPO、TAS、ROS為廣譜的氧化應(yīng)激指標，三者水平變化與氧化應(yīng)激反應(yīng)嚴重程度具有密切聯(lián)系[18-20]。本研究結(jié)果表明，氯氰菊酯干預能夠調(diào)控LPO、TAS、ROS水平，導致青春期雄性大鼠睪丸組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)，從而對大鼠生殖系統(tǒng)造成一定的損傷。

綜上所述，氯氰菊酯干預能夠調(diào)控青春期雄性大鼠miR-409b、miR-30b-3p表達，并對大鼠生殖系統(tǒng)造成一定的影響，主要表現(xiàn)為影響大鼠前列腺、睪丸、附睪、精囊發(fā)育，影響精子生成、存活及性激素水平，其作用機制可能是氯氰菊酯干預能夠引起大鼠睪丸組織發(fā)生氧化應(yīng)激反應(yīng)。

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（收稿日期：2021-05-21）