粟文婷 於佳楠 賈 軍 王曉民,*

(1. 首都醫(yī)科大學(xué)腦重大疾病研究中心 北京腦重大疾病研究院 北京市腦重大疾病重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室——省部共建國(guó)家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室培育基地 腦重大疾病防治省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 100069； 2. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院神經(jīng)生物學(xué)系，北京 100069； 3. 首都醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生理學(xué)與病理生理學(xué)系，北京 100069)

帕金森病(Parkinson’s disease，PD)是最常見(jiàn)的中老年神經(jīng)退行性疾病之一，其典型的病理特征為黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元的病變?nèi)笔В霈F(xiàn)了肢體震顫、運(yùn)動(dòng)遲緩、肌僵直以及姿勢(shì)異常等運(yùn)動(dòng)障礙[1]。目前，針灸作為一種替代療法，在特定穴位上實(shí)施手針或電針(electroacupuncture，EA)刺激，能緩解PD患者和PD動(dòng)物模型的運(yùn)動(dòng)障礙[2-3]。在筆者團(tuán)隊(duì)多年的EA治療PD的基礎(chǔ)轉(zhuǎn)化研究中，充分證實(shí)了EA能有效改善PD模型的運(yùn)動(dòng)癥狀[4-11]。其中，在雙側(cè)的“足三里”和“三陰交”兩個(gè)穴位實(shí)施4周的100 Hz EA治療，可以有效改善6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA)單側(cè)損傷PD小鼠模型的運(yùn)動(dòng)障礙[9]。然而，外周穴位的EA刺激是否能影響到腦內(nèi)神經(jīng)元的活動(dòng)，以及這種影響是否關(guān)聯(lián)著其對(duì)運(yùn)動(dòng)功能的改善，尚未研究清楚，而這正是闡述EA作用機(jī)制的基本問(wèn)題。原癌基因c-fos是一種早期激活基因，其表達(dá)的蛋白c-Fos被用來(lái)作為神經(jīng)元活性的標(biāo)志[12]。目前在多種疾病模型中已有報(bào)道[13]，EA可以調(diào)控神經(jīng)元c-Fos的表達(dá)；但EA對(duì)與運(yùn)動(dòng)環(huán)路相關(guān)核團(tuán)神經(jīng)元的調(diào)控效應(yīng)目前尚未見(jiàn)報(bào)道，這可能是其對(duì)PD具有調(diào)節(jié)效應(yīng)的神經(jīng)基礎(chǔ)。因此，本研究選取腦內(nèi)涉及運(yùn)動(dòng)調(diào)控的主要輸入核團(tuán)——紋狀體作為研究對(duì)象，通過(guò)“足三里”和“三陰交”穴位實(shí)施電針刺激后，檢測(cè)紋狀體內(nèi)神經(jīng)元c-Fos蛋白的表達(dá)，揭示電針對(duì)PD小鼠紋狀體神經(jīng)元活性的調(diào)控效應(yīng)，試圖闡述EA改善PD運(yùn)動(dòng)障礙的作用基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 主要藥品與試劑

6-羥基多巴胺(6-hydroxydopamine，6-OHDA，H116)、阿撲嗎啡(apomorphine， APO，A4393)、酪氨酸羥化酶(tyrosine hydroxylase，TH，鼠抗， SAB4200699)抗體購(gòu)于美國(guó)Sigma-Aldrich公司；c-Fos (兔抗，ABE457)抗體購(gòu)于美國(guó)Millipore公司；ABC免疫組化試劑盒(PK-4002)購(gòu)于美國(guó)Vector Laboratories公司；DAB顯色液購(gòu)于中國(guó)中杉金橋公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物

C57BL/6小鼠(6～8周齡，20～25 g，雄性)購(gòu)自北京維通利華實(shí)驗(yàn)動(dòng)物技術(shù)有限公司，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物許可證號(hào)：SCXK(京)2016-0008，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用遵循醫(yī)學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理實(shí)施細(xì)則(1998年衛(wèi)生部令第55號(hào))以及首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物管理細(xì)則。小鼠飼養(yǎng)于首都醫(yī)科大學(xué)實(shí)驗(yàn)動(dòng)物部，每籠最多5只，可自由進(jìn)食和飲水，提供12 h/12 h的明/暗飼養(yǎng)環(huán)境。所有涉及實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的實(shí)驗(yàn)流程和操作都經(jīng)過(guò)首都醫(yī)科大學(xué)倫理審查委員會(huì)批準(zhǔn)，倫理審批號(hào)：AEEI-2018-044。

1.3 主要儀器

立體定位儀(Kopf公司，德國(guó))、電針儀(HANS-1008，韓氏疼痛治療儀，中國(guó))、動(dòng)物行為學(xué)分析系統(tǒng)(SuperMaze，上海欣軟信息科技公司)、冰凍切片機(jī)(CM 3050S，Leica公司，德國(guó))、玻片掃描儀(Pannoramic scan，3DHISTECH公司，匈牙利)、正置熒光顯微鏡(BX51, Olympus公司，日本)。

1.4 實(shí)驗(yàn)方法

1.4.1 6-OHDA單側(cè)損傷的PD小鼠模型制備

腹腔注射戊巴比妥鈉麻醉小鼠，將其頭部置于立體定位儀固定。根據(jù)前囟、后囟的位置，在右側(cè)紋狀體內(nèi)進(jìn)行藥物的雙位點(diǎn)注射：AP=+0.5 mm，ML=-2.0 mm，DV=-3.0 mm和-2.0 mm；每個(gè)位點(diǎn)注射6-OHDA 0.78 μL(5.14 g/L)。對(duì)照組小鼠注射等體積的0.9%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))氯化鈉注射液(以下簡(jiǎn)稱(chēng)生理鹽水)。2周后，用APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為來(lái)篩模。凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)為向左側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)減去向右側(cè)旋轉(zhuǎn)圈數(shù)。30分鐘內(nèi)，凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)達(dá)到2 r/min以上的小鼠，視為造模成功的單側(cè)PD模型[14]。

1.4.2 電針?lè)椒?/p>

APO篩模后，將對(duì)照和PD小鼠采用抽簽法隨機(jī)各分為兩組，分別為對(duì)照組(Sham)、對(duì)照電針組(Sham+EA)、模型組(Model)和模型電針組(Model+EA)。Sham+EA組和Model+EA組小鼠于“足三里”(ST36，膝關(guān)節(jié)后外側(cè)、腓骨小頭下約2 mm)和“三陰交”(SP6，內(nèi)踝尖上部2 mm，脛骨后緣)接受電針刺激，刺激頻率為100 Hz，刺激電流強(qiáng)度逐步遞增，分別為1.0、1.2、1.4 mA各10 min，總電針時(shí)間30 min。刺激完成后90 min灌流取材，進(jìn)行后續(xù)的免疫組化實(shí)驗(yàn)。

1.4.3 TH和c-Fos蛋白檢測(cè)

小鼠用戊巴比妥鈉麻醉，依次心尖灌流生理鹽水和4%(質(zhì)量分?jǐn)?shù))多聚甲醛，腦組織經(jīng)脫水處理后OCT包埋，用冰凍切片機(jī)分別選取包含紋狀體和黑質(zhì)的部位進(jìn)行冠狀連續(xù)切片，厚度為40 μm；每隔5張取1張腦片進(jìn)行c-Fos或TH免疫組化實(shí)驗(yàn)，依次經(jīng)c-Fos抗體(1∶1 000)或TH抗體(1∶2 000)、ABC免疫組化試劑盒中的二抗和A、B液孵育后，用DAB顯色液避光顯色。

黑質(zhì)和紋狀體的TH染色用正置熒光顯微鏡拍攝。c-Fos染色切片用玻片掃描儀掃描，用CaseViewer 2.1.2 (3DHISTECH公司，匈牙利)軟件分別在雙側(cè)紋狀體的背側(cè)和腹側(cè)截取一個(gè)長(zhǎng)方形區(qū)域(0.85 mm×0.46 mm)，在雙側(cè)的扣帶回皮質(zhì)也截取一個(gè)長(zhǎng)方形區(qū)域(0.46 mm×0.24 mm)，再用Image-Pro Plus 6.0(Media Cybernetics公司，美國(guó))統(tǒng)計(jì)各截取區(qū)域內(nèi)c-Fos的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)。

1.5 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

2 結(jié)果

2.1 6-OHDA右側(cè)損傷PD小鼠模型的建立

造模手術(shù)實(shí)施2周后，用APO誘導(dǎo)的旋轉(zhuǎn)行為篩選出的Model組小鼠凈旋轉(zhuǎn)圈數(shù)顯著高于Sham組小鼠(P<0.001，圖1A)。同時(shí)TH免疫組化的結(jié)果表明，Model小鼠右側(cè)的黑質(zhì)多巴胺能神經(jīng)元及紋狀體內(nèi)TH陽(yáng)性纖維的表達(dá)與左側(cè)相比均減少(圖1B)，以上結(jié)果表明6-OHDA單側(cè)損傷的PD小鼠模型建立成功。

圖1 小鼠單側(cè)損傷PD模型的建立Fig.1 Establishment of the unilateral lesioned mice model of PDA: APO-induced rotation test； B: Representative tyrosine hydroxylase immunostaining images of striatum (up) and SNc (down) from a 6-OHDA unilaterally lesioned PD Model mouse. Scale bar=1 mm. The data were presented as unpaired t-test, ***P<0.001 vs Sham group, n=6. PD: Parkinson’s disease; SNc: substantia nigra pars compacta; APO: apomorphine; 6-OHDA: 6-hydroxydopamine.

2.2 EA對(duì)PD小鼠背側(cè)紋狀體c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的影響

在左側(cè)紋狀體部位，Model組背側(cè)紋狀體內(nèi)c-Fos陽(yáng)性數(shù)目較Sham組有降低的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖2)；而EA刺激對(duì)Sham和Model組小鼠的c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目未產(chǎn)生明顯的調(diào)控作用。在右側(cè)紋狀體，Model組背側(cè)紋狀體區(qū)域內(nèi)c-Fos陽(yáng)性數(shù)目較Sham組明顯降低(P<0.001，圖2B)，EA刺激有效地增加了Model組小鼠此區(qū)域內(nèi)c-Fos表達(dá)的陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)目(P<0.05，圖2B)，卻并未影響Sham小鼠該區(qū)域內(nèi)c-Fos的表達(dá)。

圖2 EA對(duì)背側(cè)紋狀體c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的影響Fig.2 The effect of EA on the c-Fos positive profiles in dorsal striatumA: Up, the schematic diagram of coronal slice containing striatum and cingulate cortex, the black box represents the selected area in dorsal striatum (gray region). Down, representative c-Fos immunostaining images of left and right dorsal striatum from Sham,Sham+EA,Model and Model+EA group mice. Scale bar=50 μm. B: c-Fos positive profiles per mm2 in left and right dorsal striatum. The data were presented as one-way ANOVA analysis, ***P<0.001 vs Sham group, #P<0.05 vs Model group, n=16 slices/3 mice. EA: electroacupuncture.

2.3 EA對(duì)PD小鼠腹側(cè)紋狀體c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的影響

在左側(cè)紋狀體， Model組腹側(cè)部位的c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與Sham組相比差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，EA刺激雖有增加Model組小鼠該部位c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。在右側(cè)紋狀體，Model組腹側(cè)部的c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量較Sham組有下降的趨勢(shì)，同樣差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但EA刺激適度上調(diào)了Model組小鼠此區(qū)域內(nèi)的c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量(P<0.05，圖3)。

圖3 EA對(duì)腹側(cè)紋狀體c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的影響Fig.3 The effect of EA on the c-Fos positive profiles in ventral striatumA: Up, the schematic diagram of coronal slice containing striatum and cingulate cortex, the black box represents the selected area in ventral striatum (gray region). Down, representative c-Fos immunostaining images of left and right ventral striatum from Sham, Sham+EA, Model and Model + EA group mice. Scale bar=50 μm. B: c-Fos positive profiles per mm2 in left and right ventral striatum. The data were presented as one-way ANOVA analysis, #P<0.05 vs Model group, n=16 slices/3 mice. EA: electroacupuncture.

2.4 EA對(duì)PD小鼠扣帶回皮質(zhì)的c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的影響

實(shí)驗(yàn)顯示，無(wú)論是左側(cè)還是右側(cè)，Model組小鼠c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量與Sham組相比差異均無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，EA刺激雖然對(duì)Sham和Model組小鼠均有上調(diào)c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的趨勢(shì)，但差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(圖4)。

圖4 EA對(duì)扣帶回皮質(zhì)c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞數(shù)量的影響Fig.4 The effect of EA on the c-Fos positive profiles in cingulate cortexA: Up, the schematic diagram of coronal slice containing striatum and cingulate cortex, the black box represents the selected area in cingulate cortex (gray region). Down, representative c-Fos immunostaining images of left and right cingulate cortex from Sham, Sham+EA， Model and Model+EA group mice. Scale bar=50 μm. B: c-Fos positive profiles per mm2 in left and right cingulate cortex. The data were presented as one-way ANOVA analysis, n=16 slices/3 mic. EA: electroacupuncture.

3 討論

經(jīng)典的基底節(jié)(basal ganglia, BG)環(huán)路放電模型常用于解釋PD運(yùn)動(dòng)癥狀的發(fā)生[15-16]。該理論認(rèn)為，PD病變中從黑質(zhì)輸入到紋狀體內(nèi)DA投射的丟失，使得紋狀體內(nèi)直接通路與間接通路活動(dòng)失衡而導(dǎo)致了PD運(yùn)動(dòng)障礙的發(fā)生。紋狀體作為基底節(jié)的主要輸入核團(tuán)，主要接受黑質(zhì)的多巴胺以及運(yùn)動(dòng)皮質(zhì)的谷氨酸投射;同時(shí)，核團(tuán)內(nèi)的中型棘突神經(jīng)元又通過(guò)γ-氨基丁酸將整合的信號(hào)分別沿直接通路和間接通路向下游傳遞。因此，紋狀體是負(fù)責(zé)運(yùn)動(dòng)控制的基底神經(jīng)節(jié)中“承上啟下”的關(guān)鍵核團(tuán)，也是PD發(fā)病和治療機(jī)制研究中的重要靶點(diǎn)[17-18]。

EA在治療PD的臨床和基礎(chǔ)研究中都顯示出良好的療效。臨床研究[3]顯示，針灸能夠有效地緩解PD患者的臨床癥狀，包括EA治療可促進(jìn)PD患者主觀癥狀的好轉(zhuǎn)及客觀運(yùn)動(dòng)評(píng)分的增加[19]，并可降低藥物的服用劑量[20]?；A(chǔ)研究[4-10]也證實(shí)，EA能有效改善PD動(dòng)物模型的運(yùn)動(dòng)癥狀，涉及的治療機(jī)制包括增強(qiáng)神經(jīng)營(yíng)養(yǎng)因子表達(dá)[4]、抑制炎癥反應(yīng)[8]、抗氧化應(yīng)激[5,7]，以及調(diào)整遞質(zhì)平衡[6, 9-10]等。然而，這些研究尚未直接探究EA對(duì)運(yùn)動(dòng)控制密切相關(guān)的紋狀體神經(jīng)元的反應(yīng)性。因此，本研究通過(guò)考察單次EA對(duì)紋狀體神經(jīng)元活性的影響有利于闡述EA治療PD的作用機(jī)制。

原癌基因c-fos是中樞神經(jīng)系統(tǒng)中廣泛存在的一種即刻早期基因，其編碼的c-Fos蛋白常被用來(lái)表征神經(jīng)元的活性[12]。在本研究的 PD模型中，筆者發(fā)現(xiàn)Model組小鼠未損傷側(cè)紋狀體c-Fos表達(dá)較Sham小鼠差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，但在損傷側(cè)紋狀體背側(cè)的c-Fos表達(dá)表現(xiàn)為顯著的下降，表明其神經(jīng)元活性的下調(diào)。

EA能調(diào)節(jié)神經(jīng)元c-fos基因的表達(dá)，已經(jīng)在多種疾病模型中得到了證實(shí)[21-24]，這可能是EA發(fā)揮功效的最基本的生理基礎(chǔ)。本研究所建立的PD模型中，背側(cè)及部分腹外側(cè)是右側(cè)紋狀體主要損傷的部位，此區(qū)域c-Fos表達(dá)的降低，而EA有效增加了Model小鼠損傷背側(cè)和腹側(cè)紋狀體c-Fos的表達(dá)，表明神經(jīng)元活性被EA激活。因此,本實(shí)驗(yàn)提示了PD模型小鼠紋狀體內(nèi)由于多巴胺投射減少而引起紋狀體區(qū)域內(nèi)神經(jīng)元的活性降低，電針可以特異性地提高紋狀體背側(cè)和腹側(cè)神經(jīng)元的活動(dòng)，促使其功能狀態(tài)的改善，進(jìn)而可能通過(guò)蓄積效應(yīng)在慢性的電針治療中得以緩解PD的運(yùn)動(dòng)障礙。但是，對(duì)未損傷側(cè)紋狀體c-Fos陽(yáng)性細(xì)胞的檢測(cè)卻并未發(fā)現(xiàn)明顯異常，EA刺激也未見(jiàn)明顯的調(diào)節(jié)作用，進(jìn)一步提示EA可以選擇性改善損傷區(qū)紋狀體神經(jīng)元的功能活動(dòng)。

為了全面比較電針的效應(yīng)，本團(tuán)隊(duì)也檢測(cè)了EA對(duì)扣帶回皮質(zhì)的c-Fos表達(dá)?？蹘Щ氐墓δ苤饕桥c認(rèn)知和情感相關(guān)[25]。在本實(shí)驗(yàn)中筆者發(fā)現(xiàn)該區(qū)域內(nèi)的表達(dá)未出現(xiàn)明顯改變，而EA刺激也沒(méi)有對(duì)扣帶回的神經(jīng)元產(chǎn)生明顯的調(diào)控。因此，EA刺激呈現(xiàn)出一種與損傷相關(guān)聯(lián)的區(qū)域調(diào)控。此外，有報(bào)道[26-28]顯示，APO和L-dopa可以增加6-OHDA模型損傷側(cè)紋狀體內(nèi)神經(jīng)元的活動(dòng)，同時(shí)也明顯的特異性增強(qiáng)了損傷側(cè)紋狀體c-Fos蛋白的表達(dá)水平，與EA的作用相似。

綜上所述，本研究以紋狀體內(nèi)神經(jīng)元的c-Fos反應(yīng)性為研究切入點(diǎn)，證明了EA能對(duì)損傷區(qū)域神經(jīng)元活性進(jìn)行特異性調(diào)控，此研究結(jié)果有利于更深入地理解EA對(duì)PD的治療機(jī)制。但是，EA對(duì)紋狀體內(nèi)神經(jīng)元活性的調(diào)控在直接通路和間接通路上是否存在差異，還有待更進(jìn)一步的研究。