非洲豬瘟病毒及其疫苗研究進(jìn)展

黃 霞， 康喜龍， 孟 闖， 顧 丹， 焦新安， 潘志明

(1.揚(yáng)州大學(xué) 江蘇省人獸共患病學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；2. 揚(yáng)州大學(xué) 江蘇高校動(dòng)物重要疫病與人獸共患病防控協(xié)同創(chuàng)新中心，揚(yáng)州 225009；3. 揚(yáng)州大學(xué) 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部農(nóng)產(chǎn)品質(zhì)量安全生物性危害因子(動(dòng)物源)控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009；4. 揚(yáng)州大學(xué) 農(nóng)業(yè)與農(nóng)產(chǎn)品安全國(guó)際合作聯(lián)合實(shí)驗(yàn)室，揚(yáng)州 225009)

非洲豬瘟(African swine fever, ASF)是由非洲豬瘟病毒(African swine fever virus, ASFV)引起的豬高致死性出血性疾病。高毒力株引起超急性和急性疾病，使豬群在感染后短時(shí)間內(nèi)死亡率達(dá)100%。非洲豬瘟自1921年在肯尼亞被首次報(bào)道后，主要在撒哈拉以南的非洲國(guó)家呈地方流行。1957年ASF首次在歐洲葡萄牙出現(xiàn)，該疫情被撲滅后，又于1960年重現(xiàn)，后蔓延至撒丁島、加勒比等地區(qū)。到20世紀(jì)90年代，除撒丁島外，這些國(guó)家的疫情都被根除[1]。2007年，可能因東非受感染豬肉引入，ASF進(jìn)入格魯吉亞；然后，迅速蔓延到俄羅斯和東歐一些國(guó)家。2018年8月，ASF在我國(guó)沈陽(yáng)首次被發(fā)現(xiàn)[2]。至2019年底，全國(guó)共報(bào)告發(fā)生162起ASF疫情，撲殺生豬近120萬(wàn)頭。由于尚無(wú)針對(duì)ASF的有效疫苗，目前只能采取撲殺的方式控制疫情，給養(yǎng)豬業(yè)帶來(lái)巨大損失。因此，迫切需要研發(fā)安全有效的疫苗應(yīng)對(duì)當(dāng)前的疫情。

1 非洲豬瘟病毒

1.1 結(jié)構(gòu)與理化特性

ASFV是目前已知的唯一由蟲(chóng)媒傳播的雙鏈DNA大型囊膜病毒。ASFV病毒體是大約200 nm的二十面體，結(jié)構(gòu)對(duì)稱(chēng)，由5個(gè)同心層形成，從內(nèi)到外依次為內(nèi)核、內(nèi)核心殼、內(nèi)膜、衣殼和囊膜。內(nèi)核由基因組、核蛋白，以及類(lèi)核形成。內(nèi)核心殼是主要由多聚蛋白pp62和pp220組成的寬蛋白層。內(nèi)膜緊挨核殼，電子顯微鏡下為單一的脂膜，含有p54、p17和p12蛋白。衣殼主要為p72蛋白。囊膜則是在病毒出芽過(guò)程中從細(xì)胞質(zhì)膜獲得[3]。ASFV基因組的長(zhǎng)度為170～194 kb，有150～167 個(gè)開(kāi)放閱讀框(open reading frame, ORF)，可編碼150多種蛋白質(zhì)，其中包括結(jié)構(gòu)蛋白和免疫調(diào)節(jié)蛋白。ASFV編碼的多基因家族(multigene families, MGFs)占基因組的17%～25%，這直接決定了不同毒株基因組之間長(zhǎng)度的變化[4]。

1.2 傳播途徑

ASFV可感染家豬和野豬，包括非洲的疣豬和叢林豬以及歐亞大陸的野豬。軟蜱作為天然的病毒儲(chǔ)存宿主，可通過(guò)叮咬傳播病毒。被感染豬的組織或體液、未煮熟的豬副產(chǎn)品、受污染的材料和受感染的軟蜱是該病傳播的主要途徑。而此次我國(guó)ASF的暴發(fā)，主要是由于感染豬及其副產(chǎn)品的大范圍運(yùn)輸導(dǎo)致的傳播[5]。

1.3 致病性

根據(jù)ASFV毒力的不同，ASF的臨床癥狀可表現(xiàn)為長(zhǎng)期持續(xù)感染和高度急性疾病。高毒力株感染后，可引起超急性和急性疾病，伴有高熱、嗜睡、出血性病變等癥狀。血小板及淋巴細(xì)胞減少是其主要特征[6]。由中等毒力株引起的亞急性疾病，死亡率30%～70%。低毒力株一般導(dǎo)致低病死率和無(wú)血管病變的慢性疾病，可能會(huì)出現(xiàn)消瘦、關(guān)節(jié)腫脹和皮膚潰瘍[7]。野豬和疣豬一般呈輕度或持續(xù)感染。長(zhǎng)期持續(xù)感染的豬只可至少排毒70 d[8]，這是病毒持續(xù)存在的原因之一。

1.4 感染與免疫機(jī)制

ASFV進(jìn)入細(xì)胞是一個(gè)依賴(lài)溫度、能量、膽固醇和低pH值的過(guò)程，主要感染單核巨噬細(xì)胞。網(wǎng)格蛋白介導(dǎo)的內(nèi)吞與肌動(dòng)蛋白驅(qū)動(dòng)的巨胞飲是ASFV侵入巨噬細(xì)胞的主要方式[3]。巨噬細(xì)胞作為免疫系統(tǒng)的多功能細(xì)胞，對(duì)感知和殺滅病原體以及隨后激發(fā)先天性和適應(yīng)性免疫反應(yīng)都必不可少。然而，ASFV具有獨(dú)特的免疫逃逸機(jī)制可抵抗巨噬細(xì)胞殺傷，ASFV對(duì)單核吞噬細(xì)胞的細(xì)胞嗜性以及其在體內(nèi)復(fù)制和調(diào)節(jié)巨噬細(xì)胞功能的能力是其致病的關(guān)鍵因素[9]。

ASFV可通過(guò)調(diào)節(jié)細(xì)胞因子和促炎因子的表達(dá)來(lái)實(shí)現(xiàn)免疫逃逸。I型干擾素(interferon I, IFN-I)是先天免疫系統(tǒng)的重要組成部分，可抑制病毒在細(xì)胞內(nèi)的復(fù)制、成熟和細(xì)胞間傳播。有研究表明使用IFN-α預(yù)處理豬巨噬細(xì)胞可顯著抑制ASFV復(fù)制[10]。ASFV還可編碼多種免疫調(diào)節(jié)蛋白，這些蛋白會(huì)干擾并下調(diào)宿主多種免疫調(diào)節(jié)蛋白質(zhì)的表達(dá)。ASFV感染期間，白介素-1(interleukin 1, IL-1)和腫瘤壞死因子α(tumor necrosis factor α, TNFα)等150多種細(xì)胞因子失調(diào)。ASFV編碼的A238L就是一種多功能免疫調(diào)節(jié)蛋白，可通過(guò)抑制核因子κB(nuclear factor kappa-B, NF-κB)的活化來(lái)調(diào)節(jié)促炎因子和細(xì)胞因子的分泌。宿主對(duì)抗ASFV入侵的另一種主要防御策略是通過(guò)凋亡清除受感染的細(xì)胞。然而ASFV可通過(guò)表達(dá)能夠競(jìng)爭(zhēng)和隔離促凋亡蛋白的蛋白質(zhì)(如A179L、A224L和DP71L)逃逸早期凋亡[11]。

2 非洲豬瘟疫苗研究進(jìn)展

20世紀(jì)50年代第一次報(bào)道了從ASFV感染中恢復(fù)的豬能夠免受病毒的再次攻擊[12]。ASFV感染后，存活的豬只可以產(chǎn)生強(qiáng)烈的保護(hù)性免疫應(yīng)答，這表明研制有效的非洲豬瘟疫苗是可能的。雖然在過(guò)去幾十年中，已開(kāi)展了對(duì)ASF滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗等多項(xiàng)研究，但到目前為止仍未獲得一種安全、有效的ASF疫苗。2020年3月，中國(guó)農(nóng)科院哈爾濱獸醫(yī)研究所創(chuàng)制的ASFV疫苗已通過(guò)農(nóng)業(yè)農(nóng)村部評(píng)審，獲準(zhǔn)在黑龍江、新疆和河南三地開(kāi)展臨床試驗(yàn)[13]。

2.1 滅活疫苗

作為控制傳染性疾病的重要措施之一，滅活疫苗通常被優(yōu)先選擇研究。雖然滅活疫苗具有抗原性，但由于物理或化學(xué)滅活手段而喪失了感染能力，無(wú)法產(chǎn)生持久的免疫應(yīng)答是這類(lèi)疫苗的主要缺點(diǎn)之一。

Forman等用戊二醛與洗滌劑分別處理ASFV感染后的豬肺泡巨噬細(xì)胞，并將其免疫豬。結(jié)果發(fā)現(xiàn)攻毒后戊二醛處理組可更快速地產(chǎn)生血清學(xué)反應(yīng)，病毒血癥水平輕微降低；而洗滌劑處理組未觀(guān)察到明顯血清學(xué)反應(yīng)，對(duì)同源攻擊不具有免疫保護(hù)作用[14]。除此之外，也有研究通過(guò)其他方式滅活病毒，如滅活感染細(xì)胞的提取物、純化滅活的病毒粒子等，均不能產(chǎn)生有效的免疫保護(hù)[15]。而B(niǎo)lome等[16]的研究表明加有佐劑PolygenTM與Emulsigen?-D的滅活A(yù)SFV制劑可在豬中誘導(dǎo)產(chǎn)生針對(duì)ASFV p73和p30的特異性抗體，但仍未觀(guān)察到有效的免疫保護(hù)作用。截至投稿時(shí)，未有傳統(tǒng)ASF滅活疫苗研發(fā)成功的報(bào)道。

2.2 減毒活疫苗

2.2.1 傳統(tǒng)減毒活疫苗

通過(guò)病毒在體外或非宿主動(dòng)物中連續(xù)傳代致弱病毒的減毒活疫苗已成功控制多種病毒性疾病。同樣，在A(yíng)SF減毒疫苗的研制中，已進(jìn)行了多種天然或體外減毒的ASFV免疫的實(shí)驗(yàn)。有研究顯示天然減毒的OURT88/3和NH/P68 ASFV毒株可誘導(dǎo)產(chǎn)生良好的免疫保護(hù)，抵抗強(qiáng)毒株的攻擊[17]。雖然使用傳統(tǒng)方法減毒的ASFV毒株免疫豬會(huì)產(chǎn)生針對(duì)同源病毒的長(zhǎng)期抵抗力，但其很少能抵抗異源病毒的攻擊。此外，傳統(tǒng)減毒活疫苗通常會(huì)產(chǎn)生副作用，如瘀斑、壞死灶等，這限制了其在生產(chǎn)中的進(jìn)一步應(yīng)用。傳統(tǒng)減毒活疫苗還可能導(dǎo)致慢性或持續(xù)性感染，并有恢復(fù)毒力的風(fēng)險(xiǎn)。

2.2.2 基因工程減毒活疫苗

目前，通過(guò)比較基因組和功能基因組學(xué)研究已經(jīng)確定了與病毒毒力和宿主應(yīng)答相關(guān)的ASFV基因。TK、UK、9GL是已知與ASFV毒力相關(guān)的基因，而MGF360和505/530基因可抑制宿主產(chǎn)生I型IFN。這些基因的缺失可導(dǎo)致病毒毒力的下降，同時(shí)能夠誘導(dǎo)針對(duì)同源病毒的保護(hù)性免疫應(yīng)答。Monteagudo等[18]將CD2v/EP402R缺失的Ba71 ASFV毒株(基因I型)免疫豬后，其能夠誘導(dǎo)產(chǎn)生保護(hù)性免疫應(yīng)答，抵抗同源Ba71或異源E75(基因I型)和Georgia07(基因II型)ASFV強(qiáng)毒株的攻擊。這種交叉保護(hù)反應(yīng)在眾多基因缺失候選疫苗中比較少見(jiàn)，表明基于CD2v的減毒活疫苗具有較大的開(kāi)發(fā)前景。2019年，軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院軍事獸醫(yī)研究所扈榮良教授團(tuán)隊(duì)[19]以我國(guó)流行ASF毒株SY18為親本構(gòu)建了MGF和CD2v雙基因缺失株，對(duì)豬安全且接種豬能100%抵抗親本毒株的攻擊。此外,近期中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院哈爾濱獸醫(yī)研究所步志高研究員團(tuán)隊(duì)[20]以我國(guó)ASFV HLJ/18株為骨架，構(gòu)建了不同基因缺失的重組病毒。通過(guò)在豬體內(nèi)的多項(xiàng)試驗(yàn)，遴選出一株7基因缺失病毒(HLJ/18-7GD)可在豬體內(nèi)完全減毒，不能轉(zhuǎn)化為強(qiáng)毒株，對(duì)豬的致死性ASFV攻擊有完全的保護(hù)作用。

多基因缺失株盡管在安全水平上有所提高，但與單基因缺失株相比，喪失了原有的保護(hù)作用。Abrams等[21]同時(shí)缺失了天然減毒株OURT88/3中的UK和NL毒力基因后，免疫保護(hù)效力由100%降至66%。這可能是由于多種基因缺失使得病毒復(fù)制受到了極大的影響，而免疫保護(hù)的實(shí)現(xiàn)需要一定程度的病毒復(fù)制水平。

此外，研究表明不同毒株缺失相同基因后的免疫保護(hù)效果也不一定相同。例如，Sanford等[23]通過(guò)缺失Malawi毒株中的TK基因使之減毒，并成功誘導(dǎo)產(chǎn)生了對(duì)同源病毒攻擊的保護(hù)[22]。但同樣缺失Georgia07強(qiáng)毒株中的TK基因則喪失了免疫保護(hù)效力。

2.3 亞單位疫苗、核酸疫苗及病毒載體疫苗

與減毒活疫苗相比，基于抗原和單個(gè)或小部分基因的疫苗具有更高的安全性。一些與ASFV病毒附著和內(nèi)化相關(guān)的蛋白，如p54、p30、p72和CD2v等，已用于亞單位疫苗、核酸疫苗及病毒載體疫苗的研制(表1)。研究表明這些疫苗可以誘導(dǎo)機(jī)體產(chǎn)生特異性的抗體反應(yīng)，但大部分只能提供部分的免疫保護(hù)。以下對(duì)研究較多的p54、p30、p72和CD2v蛋白的特性及相關(guān)疫苗進(jìn)展進(jìn)行概述。

2.3.1 p30與p54

p30由ASFV的ORFCP204L基因編碼，蛋白大小約為23.6 ku。 p30在A(yíng)SFV感染早期表達(dá)，通常于感染后2～4 h產(chǎn)生，12 h后合成減少，在整個(gè)感染期間均能檢測(cè)到，與病毒入侵細(xì)胞密切相關(guān)[24]。作為ASFV重要的結(jié)構(gòu)蛋白，p30也是最具抗原性的蛋白之一，可誘導(dǎo)感染動(dòng)物產(chǎn)生中和抗體。目前，p30被廣泛應(yīng)用于A(yíng)SFV的血清學(xué)檢測(cè)。

p54由E183L基因編碼，是ASFV表達(dá)的早期膜蛋白，大小為19.9 ku。p54位于病毒顆粒的內(nèi)囊膜，在病毒的吸附和入侵中發(fā)揮重要作用。研究表明p54可直接與動(dòng)力蛋白C-末端的輕鏈8(LC8)結(jié)合，形成病毒跨膜結(jié)構(gòu)域，實(shí)現(xiàn)病毒在胞質(zhì)內(nèi)的轉(zhuǎn)運(yùn)。ASFV感染后，p54-LC8復(fù)合物利用一個(gè)含13個(gè)氨基酸殘基的序列，與抗凋亡蛋白Bcl-2結(jié)合，消除其對(duì)細(xì)胞凋亡的抑制作用，同時(shí)caspase 3和caspase 9被激活，進(jìn)而誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡[25]。

p30和p54在病毒感染過(guò)程中具有相似作用，常聯(lián)合用于亞單位疫苗的研制。 Gómez-puertas等[26]單獨(dú)用p30或p54蛋白免疫豬后，可以誘導(dǎo)產(chǎn)生中和抗體，但免疫的豬不能抵抗強(qiáng)毒株的攻擊。然而，采取同時(shí)免疫p54和p30的策略，攻毒后，豬臨床癥狀有所延緩，病毒血癥也得到緩減，50%的豬可免受E75毒株的攻擊。

同樣，p54和p30也是DNA疫苗的靶標(biāo)抗原。Argilaguet等[27]使用編碼p54和p30融合蛋白的重組質(zhì)粒免疫仔豬，并不能產(chǎn)生中和抗體和T細(xì)胞應(yīng)答。然而將p54和p30與ASFV血凝素蛋白的胞外可溶性結(jié)構(gòu)域(sHA)融合，構(gòu)建重組質(zhì)粒免疫豬后可誘導(dǎo)特異性的體液和細(xì)胞免疫應(yīng)答，但未發(fā)揮免疫保護(hù)作用[28]。最近，Lacasta等[29]的研究使用編碼泛素蛋白的基因序列與上述構(gòu)建的p54/p30/sHA質(zhì)粒融合表達(dá)時(shí)，不僅可誘導(dǎo)體液與細(xì)胞免疫應(yīng)答，也可抵御少量病毒的攻擊。

2.3.2 p72

p72產(chǎn)生于病毒感染晚期，是ASFV主要的衣殼蛋白，由B646L基因編碼。p72序列高度保守，且具有高度抗原性和免疫原性，常用于病毒檢測(cè)和疫苗的研制。使用基于桿狀病毒表達(dá)的ASFV蛋白p30、p54、p72和p22免疫豬，雖然在感染動(dòng)物體內(nèi)檢測(cè)到了高滴度的中和抗體，但不能提供免疫保護(hù)[30]。陳新新等[31]利用反向遺傳技術(shù)構(gòu)建表達(dá)p72 的重組新城疫病毒免疫BALB/c小鼠后，可產(chǎn)生較高滴度的p72特異性抗體，還可引發(fā)T細(xì)胞增殖和IFN-γ、IL-4等細(xì)胞因子的分泌。盡管p72已與多種蛋白聯(lián)合制作疫苗，但都缺乏相關(guān)的動(dòng)物實(shí)驗(yàn)來(lái)驗(yàn)證其保護(hù)效力。

2.3.3 CD2v

CD2v由ORFEP402R基因編碼，是ASFV唯一的糖蛋白，與T淋巴細(xì)胞表面黏附受體CD2類(lèi)似。研究表明CD2v協(xié)助紅細(xì)胞結(jié)合到感染細(xì)胞和胞外病毒粒子以促進(jìn)病毒擴(kuò)散。由于豬紅細(xì)胞表面具有CD2受體，因此ASFV病毒極易吸附到紅細(xì)胞上[25]。此外，缺失了CD2v的Ba71減毒株可產(chǎn)生針對(duì)同源病毒和異源病毒的交叉免疫保護(hù)，且能產(chǎn)生特異性 CD8+T 淋巴細(xì)胞應(yīng)答，證實(shí)了CD2v還可抑制淋巴細(xì)胞增殖[15]，這使得CD2v成為亞單位疫苗研發(fā)的主要抗原蛋白之一。使用重組CD2v蛋白免疫豬只，然后利用強(qiáng)毒E75株進(jìn)行攻毒，豬只可產(chǎn)生CD2v特異性IgG抗體，盡管有兩只動(dòng)物檢測(cè)到攜帶病毒，但免疫保護(hù)效率高達(dá)100%[32]。最近，Sunwoo等[33]使用組合的ASFV質(zhì)粒DNA(CD2v、p72、p32和p17)和重組蛋白(p15、p35、p54和p17)聯(lián)合免疫豬，進(jìn)行免疫效果評(píng)價(jià)。結(jié)果顯示接種疫苗后只檢測(cè)到少量的抗原特異性T細(xì)胞，未檢測(cè)到中和抗體，同時(shí)不能提供免疫保護(hù)。由于CD2v相關(guān)亞單位、核酸等疫苗的研究相對(duì)較少且缺少對(duì)強(qiáng)毒攻擊的免疫保護(hù)評(píng)價(jià)，所以后續(xù)需要進(jìn)一步對(duì)其研究。

除上述4種熱點(diǎn)蛋白外，pp62、A151R、K205R及B602L等也都可作為靶抗原，用于疫苗研制的研究，但較少的細(xì)胞免疫保護(hù)以及保護(hù)效率方面數(shù)據(jù)的缺乏不足以支撐疫苗的研發(fā)。因此，為了進(jìn)一步建立ASF亞單位疫苗研發(fā)平臺(tái)，需要更深入地探究相關(guān)的ASFV保護(hù)性抗原與現(xiàn)有病毒株多樣性之間的關(guān)系。

表1 ASFV亞單位疫苗、核酸疫苗及病毒載體疫苗

3 我國(guó)非洲豬瘟疫苗研發(fā)的挑戰(zhàn)

盡管目前針對(duì)ASF滅活疫苗、減毒活疫苗、亞單位疫苗等進(jìn)行了多方面嘗試研究，但結(jié)果并不盡如人意，所以ASF疫苗的研發(fā)還面臨許多挑戰(zhàn)。其一，研究所得疫苗大多只能提供同源保護(hù)，只有極少數(shù)能提供小部分的異源保護(hù)。而ASF具有24種基因型，這使得對(duì)疫苗的交叉保護(hù)能力的要求有進(jìn)一步提高。其二，由于A(yíng)SFV的生物安全等級(jí)較高，需要在生物安全三級(jí)及以上實(shí)驗(yàn)室才可開(kāi)展病毒分離鑒定、活病毒培養(yǎng)、動(dòng)物接種(感染)等實(shí)驗(yàn)活動(dòng)，目前我國(guó)批準(zhǔn)開(kāi)展ASFV相關(guān)實(shí)驗(yàn)的實(shí)驗(yàn)室有中國(guó)動(dòng)物衛(wèi)生與流行病學(xué)中心、國(guó)家外來(lái)動(dòng)物疫病診斷中心等8家單位，這在一定程度上限制了ASF疫苗多樣發(fā)展。其三，在研發(fā)過(guò)程中，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物的使用也存在一定問(wèn)題。小鼠模型常用于疫苗研制的前期工作，以證明疫苗的安全性和免疫原性，但這些結(jié)果很難復(fù)制到豬上。如p54/p30核酸疫苗在小鼠模型中具有較強(qiáng)免疫原性，但免疫豬后并不能產(chǎn)生免疫原性，表明了使用豬模型評(píng)估ASF疫苗顯得尤為重要。

4 總結(jié)與展望

ASF在許多國(guó)家和地區(qū)呈現(xiàn)地方性或流行性能通過(guò)各種傳播途徑擴(kuò)散到無(wú)ASF的國(guó)家，這對(duì)全球養(yǎng)豬業(yè)構(gòu)成了巨大威脅。目前ASF控制策略在很大程度上依賴(lài)于嚴(yán)格的生物安全措施和撲殺，但這些措施所起的作用是有限的，所以急需安全有效的疫苗來(lái)控制疾病，并從野豬和家豬中根除病毒。目前，盡管已經(jīng)嘗試了不同類(lèi)型的疫苗，但是尚無(wú)市售的ASF有效疫苗。滅活疫苗不能提供保護(hù)，亞單位疫苗也通常是部分保護(hù)，而減毒活疫苗已顯示可以提供同源保護(hù)，是目前最有望投入生產(chǎn)的，但仍存在安全性問(wèn)題。然而由于A(yíng)SFV結(jié)構(gòu)復(fù)雜，我們對(duì)其免疫機(jī)理和免疫逃逸機(jī)制認(rèn)識(shí)的缺乏嚴(yán)重阻礙了疫苗的研發(fā)進(jìn)展。因此，需要繼續(xù)努力揭示ASFV致病與免疫機(jī)理以及與宿主細(xì)胞相互作用的機(jī)制，為疫苗的研發(fā)帶來(lái)新的認(rèn)識(shí)和途徑。