賀 英,霍治軍,艾海艦,王 梅,霍彥波,王倩茹
(1.榆林學院生命科學學院,陜西 榆林 719000;2.榆林市現(xiàn)代農(nóng)業(yè)培訓中心,陜西 榆林 719000)
馬鈴薯早疫病俗稱夏疫病、輪紋病或干斑病,是一種氣傳的多循環(huán)單年流行病害,主要危害植株葉片,也會感染莖稈和塊莖[1]。馬鈴薯早疫病于1892年在美國的佛蒙特州首次發(fā)現(xiàn),目前世界各地均有分布[2]。榆林市為中國馬鈴薯四大產(chǎn)區(qū)之一,2020年馬鈴薯種植面積全市可達16.92萬hm2[3]。由于氮肥施用量增加和種苗材料品質(zhì)弱等的影響,榆林市早疫病的發(fā)生越來越普遍與嚴重,逐漸成為馬鈴薯產(chǎn)量的限制因素,是僅次于晚疫病的第二大真菌病害。目前化學防治仍是生產(chǎn)上控制馬鈴薯早疫病的重要手段,也是確保馬鈴薯高產(chǎn)、穩(wěn)產(chǎn)的重要措施[4-7]。但是,生產(chǎn)中長期大量使用固定幾種農(nóng)藥,使得病原產(chǎn)生抗藥性,防治效果變差,同時過度使用農(nóng)藥,引起生態(tài)環(huán)境安全問題也亟需解決[8]。植物病原菌的分離與鑒定是病害生物學、流行病學研究以及病害有效防控的基礎[9]。然而,目前尚無文獻報道引起榆林市馬鈴薯早疫病的鏈格孢菌的具體種類。因此,明確榆林市馬鈴薯早疫病病原,篩選高效低毒防治藥劑,是馬鈴薯生產(chǎn)和保護環(huán)境的迫切需求。鑒于此,本研究鑒定榆林市馬鈴薯早疫病病原菌,并通過室內(nèi)毒力試驗,初步確定病原菌株敏感藥劑,為馬鈴薯早疫病田間防治篩選低毒高效藥劑奠定基礎。研究結果可為榆林市馬鈴薯早疫病的科學防治提供參考。
1.1.1 供試材料
對榆林市馬鈴薯種植主產(chǎn)區(qū)進行早疫病的病葉采集,大田采集后置于冰盒密封標記,4℃保存?zhèn)溆谩?/p>
1.1.2 供試藥劑
供試藥劑名稱、劑型、生產(chǎn)廠家及稀釋倍數(shù)見表1。
1.2.1 病原菌種類的鑒定
采用常規(guī)組織培養(yǎng)法分離病原菌株,培養(yǎng)基為馬鈴薯葡萄糖瓊脂培養(yǎng)基(Potato dextrose agar,PDA),28℃培養(yǎng)7 d。將分離純化所得不同真菌進行柯赫氏法則驗證,得到馬鈴薯早疫病病原菌。在光學顯微鏡下對馬鈴薯早疫病病原菌進行形態(tài)觀察鑒定。4℃保存菌種備用,將保存的菌種送至奧維森測序公司進行分子鑒定。
1.2.2 含藥培養(yǎng)基的制備
應用含毒介質(zhì)法配置PDA 培養(yǎng)基。無菌條件下,用無菌水將各供試藥劑按表1 中的稀釋倍數(shù)進行稀釋,并且各取6 mL 加入60 mL 的培養(yǎng)基中搖勻后進行高壓滅菌,無菌操作臺上將各含藥培養(yǎng)基分裝入滅菌后的培養(yǎng)皿中,每個供試藥劑有5 個不同稀釋處理,以無菌水作對照,每個處理重復3 次。
表1 供試藥劑Table 1 Fungicides used in experiment
1.2.3 抑菌活性的測定
采用生長速率法,在無菌條件下,用打孔器在純化的平板菌種菌落邊緣處打直徑為0.8 cm 的菌餅,移至含藥培養(yǎng)基中,放入25℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)8 d,5 d 后使用游標卡尺十字交叉法測量菌落直徑,計算抑菌率。抑菌率(%)=(對照組菌落直徑-試驗組菌落直徑)/對照組菌落直徑×100。
用MEGA 7 軟件進行序列分析,鄰接法(Neighbor-joining, NJ)構 建 系 統(tǒng) 發(fā) 育 樹 ,Bootstrap 設置為1 000;試驗數(shù)據(jù)用Excel 2019 進行整理分析,用IBM SPSS Statistic 23.0 進行單因素方差分析并計算EC50和EC95的值。
2.1.1 馬鈴薯早疫病病原菌形態(tài)學鑒定
馬鈴薯早疫病葉片病斑為褐色圓形斑點,逐漸擴大至近圓形,褐色至暗褐色,病斑邊緣明顯,有清晰的同心輪紋,病斑上可產(chǎn)生少許黑色霉狀物(圖1a、圖1b)。采用組織分離法分離馬鈴薯早疫病病原菌,將分離純化所得不同真菌進行柯赫氏法則驗證,得到馬鈴薯早疫病病原菌,記作真菌-1,PDA 培養(yǎng)病原菌真菌-1 菌落呈暗黑色(圖1c、圖1d)。顯微觀察,成熟菌絲呈暗褐色,菌絲有隔膜和分枝(圖1e)。分生孢子自分生孢子梗頂端產(chǎn)生,通常為單生,很少有兩個成串,倒棍棒形,黃褐色,2~8 個橫隔膜,0~4 個縱隔膜,隔膜處有縊縮,大小43~90 μm × 10~15 μm。喙細長,與孢體等長或略短,淡色,有2~7 個橫隔膜,孢身至喙逐漸變細(圖1e、圖1f)。根據(jù)中國真菌志及其相關文獻查詢,結合形態(tài)學特征,鑒定榆林市馬鈴薯早疫病病原菌屬鏈格孢屬(Alternaria)。
圖1 馬鈴薯早疫病癥狀及病原菌落、分生孢子Figure 1 Symptoms, colonies and conidial morphology of potato early blight
2.1.2 馬鈴薯早疫病病原菌分子鑒定及系統(tǒng)發(fā)育樹
以分離純化的馬鈴薯早疫病病原菌樣本(真菌-1)的基因組DNA 為模板,選擇真菌通用引物ITS1/ITS4 進行PCR 擴增,產(chǎn)物經(jīng)測序后得到該病原菌株的rDNA-ITS 序列,經(jīng)NCBI 數(shù)據(jù)庫比對(BLAST)分析發(fā)現(xiàn),真菌-1 的 rDNA-ITS 序列與NCBI 庫中的多種鏈格孢屬(Alternaria)真菌高度同源。基于比對結果,選擇相似種真菌的rDNA-ITS序列進行系統(tǒng)發(fā)育樹構建(圖2),結果表明,供試菌株真菌-1 在系統(tǒng)發(fā)育樹中與A.alternata(登錄號:KX987252.1)聚為一枝,結合病原菌菌絲、分生孢子梗及分生孢子形態(tài)(圖1),因此推測真菌-1 為 A.alternata。
圖2 真菌-1 與相似種的ITS 序列的系統(tǒng)發(fā)育樹(Phytophthora infestans 為外群)Figure 2 Phylogenetic tree of fungi-1 rDNA-ITS compared to similar species (Phytophthora infestans as outgroup)
通過菌絲生長速率法測定9 種殺菌劑對A.alternata 的室內(nèi)毒力,測定結果見表2。
由表2 中可知,供試殺菌劑對該病原的抑菌活性按照毒力由大到小的順序依次為:噁酮·氟噻唑(SC)>異菌·氟啶胺(SC)>苯甲·百菌清(SC)>烯?!み吝蝓ィ╓G)>氟菌·霜霉威(SC)>72%霜脲·錳鋅(WP)>69%烯?!ゅi鋅(WP)>75%代森錳鋅(WG)>70%丙森鋅(WP);噁酮·氟噻唑(SC)、異菌·氟啶胺(SC)、苯甲·百菌清(SC)、烯?!み吝蝓ィ╓G)和氟菌·霜霉威(SC)的EC50值 分 別 為 3.601, 7.493, 21.113, 27.555 和51.874 μg/mL,EC50值在 3~52 μg/mL,EC95值分別為 124.987,489.168,1 338.277,3 011.257 和2 325.134 μg/mL,這表明以上5 種藥劑抑菌效果較好,可供進一步田間試驗使用,其中噁酮·氟噻唑、異菌·氟啶胺、烯?!み吝蝓ズ头に雇S著有效成分濃度的增加,各藥劑濃度的抑制作用顯著增加,可見在生產(chǎn)中可提高這些藥劑濃度以取得較好的防治效果,苯甲·百菌清隨著有效成分濃度的增加,藥劑濃度對抑菌率影響不顯著,可見在生產(chǎn)中提高藥劑濃度不能大幅度提升防治效果;75%代森錳鋅和70%丙森鋅的EC50值分別為 1 525.580 和 3 969.600 μg/mL,EC50值在1 500~ 4 000 μg/mL,可見 A. alternata 已對這 2種殺菌劑產(chǎn)生抗藥性,在田間不可單獨使用。
表2 9 種化學試劑對馬鈴薯早疫病病原菌的室內(nèi)毒力Table 2 Toxicity measurement of different concentrations of fungicides to A. alternata
國際上已報道的能引起馬鈴薯早疫病的鏈格孢菌有8 種,中國已報道的病原菌只有茄鏈格孢(A. solani)和鏈格孢(A. alternata)兩種[2],本研究通過形態(tài)學和分子生物學方法鑒定分離所得菌種,首次明確榆林市馬鈴薯早疫病病原菌為鏈格孢(A.alternata)。
本試驗通過室內(nèi)藥敏試驗篩選了5 種效果較好的藥劑,分別是噁酮·氟噻唑(SC)、異菌·氟啶胺(SC)、苯甲·百菌清(SC)、烯?!み吝蝓ィ╓G)和氟菌·霜霉威(SC),可供進一步田間試驗使用。在當?shù)伛R鈴薯早疫病防治上并未見使用噁酮·氟噻唑(SC)和異菌·氟啶胺(SC)。噁酮·氟噻唑(SC)通過對氧化固醇結合蛋白(OSBP)抑制達到抑菌效果,對卵菌綱病原菌具有獨特的作用位點,具有內(nèi)吸向頂傳導、保護新生組織的特點,同時可以快速被蠟質(zhì)層吸收,具有優(yōu)秀的耐雨水沖刷作用,對病原菌具有預防、治療和抑制產(chǎn)孢作用,其具有治療高效、速效、持效、用量低、藥效穩(wěn)定的特點[10]。本試驗中,噁酮·氟噻唑(SC)的EC50值為3.601 μg/mL,EC95值為124.987 μg/mL,對A. alternata 室內(nèi)毒力測定在9 種藥劑中效果較好,建議在生產(chǎn)中推廣使用。氟啶胺是目前唯一的線粒體氧化磷酸化解偶聯(lián)劑,在ATP 合成酶上有多個作用位點,由多基因控制,抗性風險極低,全球至今無抗性報道,殺菌速度與活性領先于同類化合物[11]。本試驗中,測定異菌·氟啶胺(SC)對A. alternata 的毒力效果,EC50值為7.493 μg/mL,EC95值為 489.168 μg/mL,是毒力僅此于噁酮·氟噻唑(SC)的藥劑。
本試驗測定得出75%代森錳鋅(WG)和70%丙森鋅(WP)對馬鈴薯早疫病病原菌的毒力較差。這可能是近幾年來,榆林市普遍使用75%代森錳鋅(WG)和70%丙森鋅(WP)兩種試劑對馬鈴薯早疫病進行化學防治,使馬鈴薯早疫病對75%代森錳鋅(WG)和70%丙森鋅(WP)產(chǎn)生了抗性,因此不建議在田間單獨使用這兩種農(nóng)藥。
室內(nèi)毒力測定是田間防效試驗的基礎,各藥劑的真實防效需在本試驗的基礎上進一步進行田間防效試驗,在田間防治使用時,建議結合馬鈴薯早疫病病原菌流行的關鍵時期設置多次噴藥,發(fā)病中心重點施藥等方法,以便取得最好的防治效果;田間防治亦可混合其他藥劑使用,克服和延緩早疫病對農(nóng)藥的抗藥性,從而保證防治效果。