李 岳 張志強(qiáng) 陳 亞 徐 瑤 王 琳*

(1. 佳木斯大學(xué)研究生院，黑龍江 佳木斯154007；2. 佳木斯大學(xué)附屬第一醫(yī)院檢驗(yàn)科，黑龍江 佳木斯 154002)

膠質(zhì)瘤是起源于中樞神經(jīng)系統(tǒng)的惡性腫瘤，可致命損害中樞神經(jīng)系統(tǒng)[1]，通常發(fā)生在顱腦深處，常浸潤(rùn)到鄰近的正常腦組織，治療起來(lái)非常困難[2]?；煻嗖扇∪硐到y(tǒng)給藥，在抗腫瘤的過(guò)程中也會(huì)傷害正常組織細(xì)胞，甚至出現(xiàn)嚴(yán)重的毒副作用，如骨髓抑制、肝腎毒性、過(guò)敏反應(yīng)、脫發(fā)、惡心、嘔吐等[3-5]。單一用藥易使腫瘤細(xì)胞產(chǎn)生耐藥性，因此，臨床上常采用聯(lián)合用藥的方法治療惡性腫瘤[6-8]。尋找安全有效并且耐藥性低的藥物成為現(xiàn)階段腫瘤治療的熱點(diǎn)，同樣，如何低毒、高效的治療腫瘤儼然成為研究的熱點(diǎn)問(wèn)題。阿霉素在與其他抗腫瘤藥物連用過(guò)程中取得不錯(cuò)的效果；天然有機(jī)小分子化合物姜黃素已被證實(shí)具有顯著抗腫瘤、抗炎等多種功效[9]，同時(shí)，姜黃素中所含有的一種活性成分阿魏酸鈉，具有改善腦微循環(huán)的作用，并且毒副作用極低[10]。

1 實(shí)驗(yàn)材料與儀器

U251細(xì)胞(武漢細(xì)胞庫(kù))，CCK-8(碧云天生物)，阿霉素(Dox)、姜黃素(Cur,北京索萊寶科技有限公司)，全自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)Bio-TEK公司)，凝膠成像系統(tǒng)(上海天能科技有限公司)，P53(博士德生物公司)。

2 實(shí)驗(yàn)方法

2.1 CCK-8實(shí)驗(yàn)

將處于對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期的細(xì)胞制成細(xì)胞懸液，調(diào)整細(xì)胞濃度。于96孔板各孔中加入100微升懸液，接種密度為1.25萬(wàn)/孔，置于培養(yǎng)箱48 h。阿霉素濃度梯度為1、2、 3、 4 、5 μg/L；姜黃素濃度梯度為0、25、50、75、100、125 μg/L。將兩藥分別加入96孔板，每個(gè)濃度設(shè)置5個(gè)復(fù)孔，培養(yǎng)24、48 h。然后在每孔加入10 μL CCK-8試劑，繼續(xù)在培養(yǎng)箱中孵育2 h，酶標(biāo)儀檢測(cè)吸光度值。確定最適濃度后，阿霉素和姜黃素按1/4∶1/4、1/2∶1/2、1∶1的濃度比例對(duì)細(xì)胞重復(fù)上述實(shí)驗(yàn)。

2.2 蛋白免疫印跡檢測(cè)

提取細(xì)胞蛋白，進(jìn)行SDS-PAGE凝膠電泳，將凝膠中的蛋白轉(zhuǎn)移到PVDF膜上。PVDF膜在5%脫脂奶粉的溶液中封閉1 h，分別與P53(1∶1 000)，β-actin(1∶2 000)，冰箱4 ℃冷藏過(guò)夜。洗膜，加入辣根過(guò)氧化物酶標(biāo)記的相應(yīng)二抗，37 ℃孵育1 h。最后用全自動(dòng)化學(xué)分析成像系統(tǒng)進(jìn)行檢測(cè)。以β-actin作為蛋白參照，檢測(cè)各目的蛋白條帶灰度值，從而確定相應(yīng)蛋白表達(dá)量。

3 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)采用SPSS 18.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。所有數(shù)據(jù)均采用均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，組間比較采用單因素方差分析。當(dāng)P<0.05，數(shù)據(jù)差異才具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

4 實(shí)驗(yàn)結(jié)果

4.1 阿霉素和姜黃素對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響

阿霉素和姜黃素分別作用細(xì)胞48 h后，不同濃度的兩種藥物對(duì)U251細(xì)胞增殖具有明顯的抑制作用，分別如表1和表2所示。隨著藥物濃度的增高，細(xì)胞存活率明顯降低。當(dāng)阿霉素濃度為1 μmol/L；姜黃素濃度為3 μmol/L時(shí)，細(xì)胞存活率約為50%。

表1 不同濃度阿霉素對(duì)U251細(xì)胞存活率的影響Tab. 1 Effects of different concentrations of doxorubicin on the survival rate of U251 cells

表2 不同濃度姜黃素對(duì)U251細(xì)胞存活率的影響Tab. 2 Effects of different concentrations of curcumin on the survival rate of U251 cells

4.2 阿霉素聯(lián)合姜黃素對(duì)U251細(xì)胞增殖的影響

與正常對(duì)照組和單獨(dú)用藥組相比，兩藥聯(lián)合顯著降低細(xì)胞存活率，如表3所示。U251細(xì)胞在阿霉素和姜黃素濃度為比例為1∶3時(shí)抑制效果最明顯。

表3 DOX聯(lián)合姜黃素對(duì)U251細(xì)胞存活率的影響Tab. 3 Effect of DOX combined with curcumin on the survival rate of U251 cells

4.2 阿霉素和姜黃素對(duì)U251細(xì)胞P53蛋白表達(dá)的影響

如圖1示，與對(duì)照組相比，阿霉素、姜黃素以及兩藥聯(lián)合均可以提高P53蛋白表達(dá)量(p<0.05)，兩藥聯(lián)合治療尤為顯著(p<0.01)。

圖1 不同用藥下P53蛋白表達(dá)情況Fig. 1 P53 protein expression under different medications

5 討論

腦膠質(zhì)瘤屬于人類(lèi)發(fā)病率最高的顱內(nèi)腫瘤，具有多中心發(fā)生、侵襲生長(zhǎng)、富含血管及易轉(zhuǎn)移等生物學(xué)特點(diǎn)[11-12]。目前，腦膠質(zhì)瘤的典型治療手段是手術(shù)為主，輔助放療、化療相結(jié)合。阿霉素作為臨床一線化療藥物因其嚴(yán)重的心肌毒副作用影響其臨床應(yīng)用。本文通過(guò)中西藥聯(lián)合的方式增加藥物的抗腫瘤的作用，為臨床腫瘤治療的新方案提供依據(jù)，在一定程度上防止腫瘤復(fù)發(fā)、轉(zhuǎn)移。本文實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明，阿霉素和姜黃素對(duì)U251細(xì)胞的抑制呈現(xiàn)時(shí)間濃度依賴(lài)性，而且二者聯(lián)用具有協(xié)同作用，比兩者單獨(dú)用藥抑制率更高。