不同產(chǎn)地蒙藥材多葉棘豆總黃酮的含量測(cè)定*

高士杰，劉 洋，李旻輝，王曉琴

(1.呼和浩特職業(yè)學(xué)院中專部，內(nèi)蒙古 呼和浩特 010050；2.內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)藥學(xué)院；3.內(nèi)蒙古自治區(qū)中醫(yī)藥研究所)

多葉棘豆為豆科棘豆屬多年生草本植物，其干燥全草為蒙醫(yī)常用藥，具有殺“粘”消熱、愈傷、生肌、止血等功效，主治流感、瘀血腫脹、喉嚨腫痛、癰瘡腫毒等[1-2]。通過課題組前期對(duì)多葉棘豆進(jìn)行的化學(xué)成分研究以及結(jié)合相關(guān)文獻(xiàn)表明，多葉棘豆中的主要成分為黃酮類[3-10]，該類成分具有增強(qiáng)免疫、抗炎抗菌、活血化瘀、抑制腫瘤等藥理作用。因此本研究首次采用單因素實(shí)驗(yàn)優(yōu)選了多葉棘豆總黃酮的提取條件，并建立了以蘆丁為對(duì)照品，通過三氯化鋁顯色法進(jìn)行測(cè)定，并計(jì)算總黃酮含量的有效方法，同時(shí)測(cè)定了16批不同產(chǎn)地、不同采集時(shí)間多葉棘豆總黃酮的含量，以期為多葉棘豆藥材的后續(xù)研究提供參考。

1 儀器、試劑與材料

UVmini-1280型紫外-可見分光光度計(jì)(島津蘇州有限公司)；KQ-500E超聲儀(昆山市超聲儀器廠)；Sartorious BT 25S型分析天平(十萬分之一，北京賽多利斯有限公司)。蘆丁標(biāo)準(zhǔn)品(批號(hào)K16D7B26927)購(gòu)買于上海源葉生物試劑公司；實(shí)驗(yàn)用水均為蒸餾水。16批多葉棘豆藥材采集或購(gòu)買信息見表1，由內(nèi)蒙古醫(yī)科大學(xué)渠弼教授鑒定為多葉棘豆Oxytropis myriophylla(Pall)DC.的全草。

表1 多葉棘豆藥材來源

2 方法與結(jié)果

2.1對(duì)照品溶液的制備 取5.02 mg蘆丁對(duì)照品，精密稱定，甲醇定容，配制成0.5020 mg/mL的對(duì)照品溶液，搖勻后于4 ℃冰箱中冷藏備用。

2.2供試品溶液的制備 精密稱取藥材粉末0.15 g，于具塞錐形瓶中，加入25 mL 50 %甲醇溶液，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷后稱重，用相同濃度溶液補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻過濾后取續(xù)濾液即得。

2.3顯色方法 精密吸取待測(cè)溶液1.0 mL，置于10 mL容量瓶中，加入1.0 mL 1 %三氯化鋁溶液，甲醇定容后靜置15 min。

2.4最大吸收波長(zhǎng)的確定 分別精密量取供試品濾液和標(biāo)準(zhǔn)品溶液0.80 mL和1.00 mL，按“2.3”項(xiàng)下方法顯色，以不加樣品的相同溶劑為空白，于200～800 nm波長(zhǎng)范圍內(nèi)掃描，結(jié)果表明二者吸收曲線基本一致，最大吸收波長(zhǎng)均為275 nm，且無干擾，故選擇其作為測(cè)定波長(zhǎng)。

2.5含量測(cè)定方法學(xué)考察

2.5.1線性關(guān)系考察 精密吸取對(duì)照品溶液各0.5、1.0、1.5、2.0、2.5、3.0 mL，顯色后于275 nm處測(cè)定吸光度。以吸光度(A)為縱坐標(biāo)，濃度C(mg·mL)為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，得回歸方程為Y = 0.0377X + 0.0704(r=0.999 2)，結(jié)果表明蘆丁對(duì)照品在0.251 mg/mL～1.506 mg/mL的濃度范圍內(nèi)線性關(guān)系良好，結(jié)果見圖1。

圖1 蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線

2.5.2精密度試驗(yàn) 取多葉棘豆藥材粉末，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，顯色后于275 nm處重復(fù)測(cè)定6次吸光度，計(jì)算得吸光度的RSD為0.02 %，表明儀器精密度良好。

2.5.3穩(wěn)定性試驗(yàn) 取多葉棘豆藥材粉末，按“2.2”項(xiàng)下的方法制備供試品溶液，顯色后分別于0、2、4、6、8、12、24 h內(nèi)于275 nm處測(cè)定吸光度，按“2.5.1”項(xiàng)下方法計(jì)算得總黃酮含量的RSD為1.76 %，說明溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.5.4重復(fù)性試驗(yàn) 取多葉棘豆藥材粉末，按“2.2”項(xiàng)下方法平行制備供試品溶液6份，顯色后于275 nm處測(cè)定吸光度，按“2.5.1”項(xiàng)下方法計(jì)算得總黃酮含量的RSD為1.01 %，說明本方法重復(fù)性良好。

2.5.5加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取多葉棘豆藥材粉末0.15 g，平行稱定9份，分別精密加入相當(dāng)于藥材中已知總黃酮含量的80 %、100 %、120 %倍量的蘆丁對(duì)照品溶液，平行3份，測(cè)定吸光度。計(jì)算結(jié)果見表2。

表2 加樣回收率試驗(yàn)

2.6總黃酮提取條件單因素試驗(yàn)

2.6.1提取溶劑的選擇 精密稱取多葉棘豆粉末0.15 g，取不同濃度提取溶劑各25 mL，置于具塞錐形瓶中，稱定質(zhì)量，超聲提取30 min，放冷后用相應(yīng)溶劑補(bǔ)足減失質(zhì)量，搖勻并過濾，按“2.5.1”項(xiàng)下方法計(jì)算，結(jié)果顯示50 %甲醇溶液提取后所測(cè)得的含量最高，見圖2。

圖2 提取溶劑的選擇

2.6.2提取方法的選擇 精密稱取2份藥材粉末各0.15 g用于考察回流提取和超聲提取的效果。兩份分別按“2.5.1”項(xiàng)下方法計(jì)算，結(jié)果顯示兩種提取方法下測(cè)得的總黃酮含量無顯著差異，故選擇超聲提取法。

2.6.3提取時(shí)間的選擇 精密稱取藥材粉末0.15 g，加入25 mL 50 %甲醇，分別超聲提取不同時(shí)間。按“2.5.1”項(xiàng)下方法計(jì)算，結(jié)果顯示超聲提取30 min時(shí)制備的供試品液總黃酮含量測(cè)定值最高，見圖3。

圖3 提取時(shí)間的選擇

2.6.4浸泡時(shí)間的選擇 精密稱取藥材粉末約0.15 g，加入25 mL 50 %甲醇，分別采用不浸泡、浸泡30 min、浸泡60 min的處理，超聲提取30 min，按“2.5.1”項(xiàng)下方法計(jì)算，結(jié)果顯示不浸泡直接提取所得的總黃酮含量最高。見圖4。

圖4 浸泡時(shí)間的選擇

2.6.5取樣量的選擇 分別精密稱取不同質(zhì)量的藥材粉末，按“2.2”項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下方法計(jì)算，結(jié)果顯示取樣量為0.15 g時(shí)總黃酮含量最高。見圖5。

圖5 取樣量的選擇

因此，本研究在單因素優(yōu)選的基礎(chǔ)上確定多葉棘豆總黃酮的最佳提取條件為：取樣量0.5 g，加入25 mL的50 %甲醇溶液，超聲提取30 min。在該提取條件下總黃酮提取效果較為理想。

2.7總黃酮的含量測(cè)定 精密稱取不同批次的多葉棘豆藥材粉末0.15 g，平行3份，制備得供試品溶液，按“2.5.1”項(xiàng)下方法進(jìn)行計(jì)算，結(jié)果見表3。

表3 樣品含量測(cè)定結(jié)果

3 小結(jié)

本文首次采用單因素實(shí)驗(yàn)確定了多葉棘豆中總黃酮的最佳提取條件，并建立了多葉棘豆中總黃酮含量測(cè)定的方法。本方法穩(wěn)定可靠，可用于多葉棘豆總黃酮的含量測(cè)定。

首次測(cè)定了產(chǎn)自內(nèi)蒙古地區(qū)的16批多葉棘豆蒙藥材中總黃酮的含量，結(jié)果表明多葉棘豆總黃酮含量在8.60～36.01 mg/g范圍內(nèi)，由于采集地不同，采集時(shí)間不同，差異較大；采集時(shí)發(fā)現(xiàn)有些樣品明顯為多年生、但是沒有開花，如S9和S11樣品中總黃酮含量較低。