董世建，許培，章良弼，李增禮，程婷，王榮海，魏兆軍

1.安徽安科生物工程（集團(tuán)）股份有限公司，安徽合肥230088；2.合肥工業(yè)大學(xué)食品與生物工程學(xué)院，安徽合肥230009

干擾素（interferon，IFN）是一類具有抗病毒、抗增殖和免疫調(diào)節(jié)作用的細(xì)胞因子［1］。聚乙二醇化重組人干擾素（PEGgylated-recombinant human interferon，PEG-rhIFN）是將重組人干擾素（recombinant human interferon，rhIFN）分子與聚乙二醇（polyethylene glycol，PEG）通過(guò)共價(jià)鍵鏈接形成的化學(xué)修飾蛋白藥物。PEG-rhIFN 不僅保持了IFN 的抗病毒及免疫調(diào)節(jié)作用等生物活性，并增強(qiáng)了其理化及生物學(xué)穩(wěn)定性，降低了免疫原性和毒性，顯著延長(zhǎng)了半衰期，每周僅需注射1 次，患者依從性更高。目前，國(guó)內(nèi)已上市的PEG-rhIFN 產(chǎn)品有瑞士Roche 公司的派羅欣、美國(guó)Schering-Plough 公司的佩樂能及廈門特寶生物工程股份有限公司的派格賓，主要用于慢性病毒性肝炎的治療［2-8］。

由于PEG 修飾后的蛋白與原型蛋白在質(zhì)量屬性方面存在較大差異，WTO 明確提出，與PEG 有關(guān)的質(zhì)控項(xiàng)目（如修飾率、修飾位點(diǎn)、游離PEG 含量等）需重點(diǎn)關(guān)注［7］。另外，《生物技術(shù)藥物研究開發(fā)和質(zhì)量控制》中也明確規(guī)定，必須進(jìn)行修飾位點(diǎn)確定和產(chǎn)品活性相關(guān)的理化指標(biāo)的研究［9］。本課題組前期采用相對(duì)分子質(zhì)量20 000 的單甲氧基聚乙二醇琥珀酰亞胺碳酸酯（mPEG-succinimidyl carbonate，mPEG-SC）對(duì) rhIFNα2b 進(jìn)行修飾，修飾位點(diǎn)為其肽鏈上 α 或 ε 的氨基，所獲得的 PEG-rhIFNα2b 與天然IFNα2b 氨基酸序列一致，由165 個(gè)氨基酸殘基組成，理論相對(duì)分子質(zhì)量為39 000，無(wú)糖基化修飾。IFNα2b 肽鏈中含有 10 個(gè)賴氨酸（K）殘基（分別為K31、K49、K70、K83、K112、K121、K131、K133、K134和 K136）［10］，理論上，上述 10 個(gè)賴氨酸殘基及 N-末端氨基酸殘基均可與mPEG-SC 結(jié)合，由于修飾位點(diǎn)的位置是影響PEG-rhIFN 空間結(jié)構(gòu)及生物學(xué)活性的關(guān)鍵因素，確定PEG 修飾位點(diǎn)及不同修飾位點(diǎn)異構(gòu)體所占比例對(duì)PEG-rhIFNα2b 質(zhì)量具有重要影響。因此，本實(shí)驗(yàn)建立PEG-rhIFNα2b 位置異構(gòu)體比例的離子交換高效液相色譜（ion-exchange highperformance liquid chromatography，IEC-HPLC）測(cè)定法和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)，以期為PEG-rhIFNα2b 的質(zhì)量控制提供保障。

1 材料與方法

1.1 樣品 rhIFNα2b 原液（批號(hào)：Y20130125）及PEG-rhIFNα2b 原液（批號(hào)：20130222Y、20130227Y、20130306Y、20081224Y）由安徽安科生物工程（集團(tuán)）股份有限公司提供。

1.2 主要試劑及儀器 一水合檸檬酸、十二水合磷酸氫二鈉、檸檬酸三鈉及二水合磷酸二氫鈉均購(gòu)自國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DTT 及IAA 購(gòu)自美國(guó)Amresco公司；TFA 購(gòu)自美國(guó) Sigma 公司；Trypsin 購(gòu)自瑞士Roche 公司；2-氨基乙基異丁烯酸購(gòu)自美國(guó)AEM 公司；LC-10ATvP Plus 型高效液相色譜儀購(gòu)自日本Shimadzu公司；Proteomix SCX-NP10（10.0 mm × 250 mm，10 μm）色譜柱購(gòu)自蘇州賽分科技有限公司；PROCISE491型蛋白質(zhì)測(cè)序儀購(gòu)自美國(guó)AB 公司。

1.3 色譜條件 采用Proteomix SCX-NP10（10.0 mm×250 mm，10 μm）色譜柱。流動(dòng)相 A：1.8 mmol ／ L 一水合檸檬酸-3.3 mmol ／ L 十二水合磷酸氫二鈉（pH 5.3），流動(dòng)相 B：30 mmol／L 檸檬酸三鈉-35 mmol／L二水合磷酸二氫鈉（pH 6.0）；線性梯度洗脫：0 ~180 min：0%B → 12%B，180 ~ 220 min：12%B →15% B；流速：0.4 mL ／ min；柱溫：25 ℃；進(jìn)樣量：不低于 100 μg。

1.4 方法的驗(yàn)證

1.4.1 專屬性 分別取rhIFNα2b（批號(hào)：Y20130125）及 PEG-rhIFNα2b 原液（批號(hào)：20130222Y），超濾濃縮至終濃度約1 mg／mL，同時(shí)設(shè)空白對(duì)照（流動(dòng)相A），按1.3 項(xiàng)色譜條件檢測(cè)。

1.4.2 重復(fù)性 取PEG-rhIFNα2b 原液（批號(hào)：2013-0227Y），按 1.3 項(xiàng)色譜條件檢測(cè)，每天測(cè)定3 次，連續(xù)測(cè)定3 d，記錄主要色譜峰所占比例（面積歸一化法），并計(jì)算相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差（RSD）。

1.5 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立 取3 批PEG-rhIFNα2b 原液（批號(hào)為：20130222Y、20130227Y、20130306Y），按1.3 項(xiàng)色譜條件檢測(cè)，每個(gè)樣品平行測(cè)定3 次。應(yīng)用SPSS 19.0 軟件對(duì)測(cè)定結(jié)果進(jìn)行分析，根據(jù)5 個(gè)位置異構(gòu)體所占比例均值（n = 9）的95%可信限制定各位置異構(gòu)體質(zhì)控標(biāo)準(zhǔn)。

1.6 修飾位點(diǎn)分析 取PEG-rhIFNα2b 原液（批號(hào)：20081224Y），按1.3 項(xiàng)色譜條件進(jìn)樣，分別富集各位置異構(gòu)體洗脫峰，委托蛋白質(zhì)藥物國(guó)家工程研究中心對(duì)各位置異構(gòu)體進(jìn)行Trypsin 酶解，再經(jīng)15%SDS-PAGE 分離，收集 PEG 肽，通過(guò) EDMAN 降解蛋白質(zhì)N-末端氨基酸序列分析法［11］，采用蛋白質(zhì)測(cè)序儀測(cè)定PEG 肽序列，并與理論肽進(jìn)行匹配，對(duì)修飾位點(diǎn)進(jìn)行分析。

2 結(jié) 果

2.1 方法的驗(yàn)證

2.1.1 專屬性 空白對(duì)照與rhIFNα2b 原液無(wú)色譜峰出現(xiàn)，對(duì)PEG-rhIFNα2b 位置異構(gòu)體比例測(cè)定無(wú)干擾；PEG-rhIFNα2b 可見5 個(gè)主要特征峰，按保留時(shí)間先后依次命名為峰 1、2、3、4、5，保留時(shí)間分別為106.198、146.598、158.598、178.598、192.598 min，各峰之間分離度分別為 5.166、1.288、1.903、1.016，分離度良好。見圖1。表明方法具有良好的專屬性。

圖1 專屬性的驗(yàn)證結(jié)果Fig.1 Verification for specificity

2.1.2 重復(fù)性 批號(hào)為20130227Y 的PEG-IFNα2b原液連續(xù)測(cè)定 3 d，峰 1、2、3、4 和 5 面積的總 RSD分別為1.96%、2.53%、2.54%、1.05%和1.86%，各峰面積日間RSD 分別為1.70%、2.21%、2.69%、0.65%、1.91%，均 < 3.0%，見表1。表明該方法具有良好的重復(fù)性。

表1 重復(fù)性驗(yàn)證結(jié)果（%）Tab.1 Verificatin for reproducibility（%）

2.2 質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn) 3 批 PEG-rhIFNα2b 原液（批號(hào)為：20130222Y、20130227Y、20130306Y）的 5 個(gè)主要位置異構(gòu)體色譜峰所占面積百分比均值的95%可信限區(qū)間分別為5.757% ~ 8.058%、14.396% ~ 20.315%、7.850%~9.200%、30.904%~33.774%和31.362%~38.073%，見表2。經(jīng)統(tǒng)計(jì)分析，5 個(gè)位置異構(gòu)體色譜峰質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可擬定為：峰1 為5% ~ 9%、峰2 為14% ~ 21%、峰 3 為 7% ~ 10%、峰 4 為 30% ~ 34%、峰 5 為 31% ~ 39%。

表2 PEG-rhIFNα2b 位置異構(gòu)體比例的測(cè)定結(jié)果（%）Tab.2 Determination of positional isomer ratio in PEG-rhIFNα2b（%）

2.3 修飾位點(diǎn)分析 確定PEG-rhIFNα2b 位置異構(gòu)體峰1 修飾位點(diǎn)主要為K31，峰2 主要為K134，峰3主要為 K131 和 K164，峰 4 主要為 K83，峰 5 主要為K121，未檢測(cè)到N-末端PEG 修飾。

3 討 論

本研究采用PEG 修飾劑對(duì)rhIFNα2b 進(jìn)行修飾，修飾位點(diǎn)為其肽鏈上的α 或ε 的氨基，理論修飾位點(diǎn)有11 個(gè)，所獲修飾產(chǎn)物修飾位點(diǎn)的鑒定及不同修飾位點(diǎn)的位置異構(gòu)體含量對(duì)該類產(chǎn)品質(zhì)量控制至關(guān)重要。本研究建立了PEG-rhIFNα2b 中位置異構(gòu)體峰含量的IEC-HPLC 測(cè)定法，該方法可分離出6 個(gè)位置異構(gòu)體峰，在保留時(shí)間約為210 min 色譜峰峰面積較低，在空白對(duì)照?qǐng)D譜中，200 ~ 220 min基線存在一定波動(dòng)，影響該色譜峰的含量測(cè)定，因此本研究對(duì)分離出的5 個(gè)主要位置異構(gòu)體峰進(jìn)行了研究，由于PEG-rhIFNα2b 的位置異構(gòu)體性質(zhì)非常接近，很難達(dá)到基線完全分離，會(huì)導(dǎo)致測(cè)定結(jié)果與實(shí)際結(jié)果存在一定誤差，綜合考慮方法本身的特點(diǎn)和其他影響因素（如不同色譜系統(tǒng)、不同廠家色譜柱等）可能造成的變異，應(yīng)用SPSS 19.0 統(tǒng)計(jì)軟件對(duì)多批原液主要位置異構(gòu)體檢測(cè)結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，5 個(gè)位置異構(gòu)體色譜峰質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)可擬定為：峰 1 為 5% ~ 9%、峰 2 為 14% ~ 21%、峰 3 為7% ~ 10%、峰 4 為 30% ~ 34%、峰 5 為 31% ~ 39%，該結(jié)果為該產(chǎn)品今后質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的制定提供了依據(jù)。另外，對(duì)5 個(gè)主要位置異構(gòu)體雜質(zhì)進(jìn)行了收集，酶解每個(gè)位置異構(gòu)體，對(duì)所獲的酶解肽段進(jìn)行N-末端測(cè)序，結(jié)果顯示，位置異構(gòu)體峰1 修飾位點(diǎn)主要為K31，峰 2 主要為 K134，峰 3 主要為 K131 和 K164，峰 4 主要為 K83，峰 5 主要為 K121，共推斷出 6 個(gè)位置異構(gòu)體的修飾位點(diǎn)，其他5 個(gè)理論修飾位點(diǎn)可能由于空間位阻的原因未發(fā)現(xiàn)PEG 修飾。位置異構(gòu)體的分離與鑒定為今后開展不同修飾位點(diǎn)PEG-rhIFNα2b 的生物學(xué)活性和穩(wěn)定性等質(zhì)量研究奠定了基礎(chǔ)。

對(duì)于非定點(diǎn)PEG 化修飾藥物，不同修飾位點(diǎn)的位置異構(gòu)體性質(zhì)較接近，分離這些位置異構(gòu)體需要根據(jù)其性質(zhì)的微小差異，采用分辨率較高的分析方法。近年，毛細(xì)管電泳技術(shù)及超高效液相色譜技術(shù)快速發(fā)展，在PEG 化修飾藥物質(zhì)量研究方面應(yīng)用較多［12-14］。另外，為了獲取均一性高的修飾產(chǎn)物，采用定點(diǎn)修飾技術(shù)開發(fā)PEG 化藥物也必將成為研究者的首選策略。在修飾位點(diǎn)鑒定方面，采用N-末端測(cè)序法對(duì)修飾位點(diǎn)進(jìn)行鑒定首先要獲取純度較高的位置異構(gòu)體雜質(zhì)，若純度較低易引起錯(cuò)誤推斷，隨著高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用技術(shù)的發(fā)展，開發(fā)高分辨率質(zhì)譜法鑒定和定量位置異構(gòu)體也是今后的重點(diǎn)發(fā)展方向［15-16］。