劉東梅，楊雯娜，肖雪莉，呂玉婷，高晶晶，趙一歡，楊淼，劉晨鳴，劉曉凡

蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司質(zhì)量保證部，甘肅蘭州730046

統(tǒng)計(jì)過(guò)程控制限度是指示符合法規(guī)及注冊(cè)要求的工藝操作范圍與異常工藝操作范圍的界限，通過(guò)歷史操作數(shù)據(jù)計(jì)算獲得，用于監(jiān)測(cè)工藝的穩(wěn)定性，若超出統(tǒng)計(jì)控制范圍，則提示工藝性能漂移，與數(shù)值波動(dòng)大小有關(guān)。快速發(fā)現(xiàn)偏離正常工藝操作范圍有助于及時(shí)進(jìn)行回顧，定期回顧能夠加深對(duì)工藝的理解，并改進(jìn)工藝。產(chǎn)品質(zhì)量質(zhì)控相關(guān)的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)、質(zhì)量?jī)?nèi)控放行標(biāo)準(zhǔn)、趨勢(shì)范圍、警戒限、行動(dòng)限等均屬于統(tǒng)計(jì)控制限［1-3］。在疫苗生產(chǎn)的質(zhì)量管理過(guò)程中，為確保產(chǎn)品安全有效及生產(chǎn)過(guò)程穩(wěn)定受控，各類控制限的制定成為全面質(zhì)量控制的重要因素?！端幤飞a(chǎn)質(zhì)量管理規(guī)范（2010 年修訂）》（簡(jiǎn)稱《規(guī)范》）及其附錄1 中規(guī)定，物料、中間產(chǎn)品、待包裝產(chǎn)品和成品必須按照質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行檢查和檢驗(yàn)，應(yīng)制定適當(dāng)?shù)膽腋×Ｗ雍臀⑸锉O(jiān)測(cè)警戒限和糾偏限［3］；《藥品GMP指南：質(zhì)量控制實(shí)驗(yàn)室與物料系統(tǒng)》中表明，制藥企業(yè)用閾值法計(jì)算行動(dòng)限和警戒限是一種常用方法，但《規(guī)范》中對(duì)計(jì)算產(chǎn)品質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)及其他控制限度的統(tǒng)計(jì)學(xué)方法并未具體規(guī)定［4-5］。人用藥品技術(shù)要求國(guó)際協(xié)調(diào)理事會(huì)（International Conference on Harmonization，ICH）要求，質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)需結(jié)合生產(chǎn)工藝、中間品的穩(wěn)定性、臨床研究分析方法等因素進(jìn)行建立，必要時(shí)還應(yīng)對(duì)定量的數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析，詳盡敘述分析方法及其依據(jù)原理［6-7］。美國(guó)注射劑協(xié)會(huì)（Parenteral Drug Association，PDA）第 59 號(hào)技術(shù)報(bào)告表明，統(tǒng)計(jì)方法為持續(xù)生產(chǎn)符合預(yù)定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的產(chǎn)品提供了客觀證據(jù)，也可對(duì)工藝進(jìn)行持續(xù)改進(jìn)和開(kāi)發(fā)，但文件中提供的過(guò)程控制統(tǒng)計(jì)方法不適用于非正態(tài)分布，非參數(shù)工具不在文件的討論范圍內(nèi)［1-2］。

生物制品生產(chǎn)階段需進(jìn)行病毒滴度、活菌數(shù)、多糖分子大小等指標(biāo)的檢測(cè)，檢測(cè)方法涉及動(dòng)物檢測(cè)，精度差異較大，易受主觀因素影響。每種統(tǒng)計(jì)分析方法均具有自身的特點(diǎn)和局限，需滿足一定的假設(shè)前提，在計(jì)算統(tǒng)計(jì)過(guò)程控制限時(shí)，應(yīng)避免隨意引用統(tǒng)計(jì)數(shù)字及套用各類公式［8-10］。本研究以A 群C 群腦膜炎球菌多糖疫苗成品各質(zhì)量屬性的檢測(cè)結(jié)果及其生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的各數(shù)值型質(zhì)量指標(biāo)為例，對(duì)質(zhì)量屬性的檢定結(jié)果按其分布類型進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)分析，以期為疫苗生產(chǎn)中質(zhì)量屬性控制限的制定方法提供依據(jù)。

1 資料與方法

1.1 數(shù)據(jù)來(lái)源 2019 年生產(chǎn)的182 批A 群C 群腦膜炎球菌多糖疫苗（每批包含2 個(gè)亞批）的關(guān)鍵質(zhì)量屬性的檢測(cè)結(jié)果由蘭州生物制品研究所有限責(zé)任公司提供，包括多糖含量（A 群多糖磷含量、C 群多糖N-乙酰神經(jīng)氨酸含量）及水分指標(biāo)。

1.2 統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法 個(gè)體分布識(shí)別提供14 種分布及Johnson 變換和Box-Cox 變換，用于尋找最佳的分布方式擬合數(shù)據(jù)及確定變換對(duì)數(shù)據(jù)擬合至正態(tài)分布是否有效，計(jì)算出每個(gè)分布和變換的Anderson-Darling 統(tǒng)計(jì)量及P 值，其過(guò)程中使用的似然比檢驗(yàn)用以確定所選分布中添加一個(gè)額外參數(shù)對(duì)顯著改善分布擬合的影響。

應(yīng)用Minitab 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析軟件，采用分布識(shí)別、正態(tài)概率檢驗(yàn)、閾值法等統(tǒng)計(jì)分析方法對(duì)2019 年生產(chǎn)的A 群C 群腦膜炎球菌多糖疫苗的多糖含量（A群多糖磷含量、C 群多糖N-乙酰神經(jīng)氨酸含量）及水分的質(zhì)量屬性控制限的制定方法進(jìn)行分類匯總，每個(gè)質(zhì)量屬性選擇擬合度最高的4 個(gè)不同分布的概率圖作為結(jié)果，以P < 0.05 為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) 果

2.1 A 群多糖磷含量

2.1.1 擬合優(yōu)度檢驗(yàn) 結(jié)合輸出的P 和概率圖，當(dāng)選擇分布為正態(tài)分布、Box-Cox 變換、對(duì)數(shù)正態(tài)、3 參數(shù)Weibull 時(shí)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（AD 分別為0.573、0.666、0.666、0.589，P 分別為 0.136、0.081、0.081、0.094），見(jiàn)表1；這些點(diǎn)均在擬合分布線附近分布，數(shù)據(jù)擬合良好，見(jiàn)圖1。選擇P 最大（0.136）的正態(tài)分布為其最優(yōu)擬合分布。

圖1 A 群多糖磷含量的概率圖Fig.1 Probability plot of phosphorus content in group A polysaccharide

表1 A 群多糖磷含量的擬合優(yōu)度檢驗(yàn)及分布參數(shù)的極大似然估計(jì)Tab.1 Goodness of fit test of polysaccharide phosphorus content in group A and maximum likelihood estimation of distribution parameters

2.1.2 控制限制定 A 群多糖磷含量服從正態(tài)分布。單值圖及移動(dòng)極差圖中均有檢測(cè)結(jié)果違反判異準(zhǔn)則1，即均有1 個(gè)點(diǎn)距離中心線超過(guò)3.00 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，該點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果為 4.77 μg ／ 劑，在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)（3.75 ~ 4.88 μg ／ 劑），見(jiàn)圖 2。根據(jù)判穩(wěn)準(zhǔn)則（連續(xù)100 個(gè)點(diǎn)至多2 個(gè)點(diǎn)落在控制界限外）和判異準(zhǔn)則，當(dāng)前生產(chǎn)過(guò)程處于穩(wěn)定狀態(tài)。A 群多糖磷含量的工藝過(guò)程能力指數(shù)Cpk = 1.20，當(dāng)前過(guò)程能力一般，可能與檢測(cè)結(jié)果（4.77 μg ／ 劑）接近標(biāo)準(zhǔn)上限有關(guān)，見(jiàn)圖3。因此A 群多糖磷含量的控制限應(yīng)該在 μ ± 2σ（3.991，4.596）基礎(chǔ)上適當(dāng)延長(zhǎng)作為其警戒限，在 μ ± 3σ（3.840，4.748）基礎(chǔ)上適當(dāng)延長(zhǎng)作為其行動(dòng)限。

圖2 A 群多糖磷含量控制圖Fig.2 I-MR control chart of phosphorus content in group A polysaccharide

圖3 A 群多糖磷含量工藝能力指數(shù)報(bào)告Fig.3 Process capability index report of phosphorus content in group A polysaccharide

在疫苗的各階段生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的質(zhì)量屬性，若其結(jié)果服從正態(tài)分布，可按上述方法計(jì)算其警戒限和行動(dòng)限等各控制限。

2.2 C 群多糖N-乙酰神經(jīng)氨酸含量

2.2.1 擬合優(yōu)度檢驗(yàn) 當(dāng)選擇分布為正態(tài)分布時(shí)，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（AD = 0.866，P = 0.026），當(dāng)選擇的變換為 Box-Cox 變換、3 參數(shù) Weibull、Johnson變換時(shí)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（AD 分別為0.703、0.621、0.462，P 分別為 0.066、0.067 和 0.257），見(jiàn)表 2；選擇P 最大（0.257）的Johnson 變換為其最優(yōu)的擬合變換，見(jiàn)圖4。Johnson 變換函數(shù)為：-0.607 114 +1.792 75 × Ln［（X - 34.520 6）／（51.199 7 - X）］。

圖4 C 群多糖N-乙酰神經(jīng)氨酸含量的概率圖Fig.4 Probability plot of N-acetylneuraminic acid content in group C polysaccharide

表2 C 群多糖N-乙酰神經(jīng)氨酸含量擬合優(yōu)度檢驗(yàn)及分布參數(shù)的極大似然估計(jì)Tab.2 Goodness of fit test of N-acetylneuraminic acid content in group C polysaccharide and maximum likelihood estimation of distribution parameters

2.2.2 控制限制定 C 群多糖N-乙酰神經(jīng)氨酸含量的檢測(cè)結(jié)果按Johnson 變換時(shí)，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（AD = 0.462，P = 0.257），數(shù)據(jù)服從正態(tài)分布。單值圖及移動(dòng)極差圖中均有檢測(cè)結(jié)果違反判異準(zhǔn)則1，即均有1 個(gè)點(diǎn)距離中心線超過(guò)3.00 個(gè)標(biāo)準(zhǔn)差，該點(diǎn)檢測(cè)結(jié)果為 39.1 μg ／ 劑，在標(biāo)準(zhǔn)范圍內(nèi)（37.5 ~ 48.8 μg ／ 劑），見(jiàn)圖 5。根據(jù)判穩(wěn)準(zhǔn)則和判異準(zhǔn)則，當(dāng)前生產(chǎn)過(guò)程處于穩(wěn)定狀態(tài)，見(jiàn)圖6。C 群多糖含量N-乙酰神經(jīng)氨酸的標(biāo)準(zhǔn)范圍經(jīng)Johnson變換函數(shù)變換后，其上下限變?yōu)椋?1.79，0.78），工藝過(guò)程能力指數(shù)Cpk = 0.37，工藝能力指數(shù)較低，這可能與個(gè)別批次接近標(biāo)準(zhǔn)下限有關(guān)，但從整體來(lái)看，C群多糖含量N-乙酰神經(jīng)氨酸工藝能力保持相對(duì)穩(wěn)定，過(guò)程處于穩(wěn)定狀態(tài)，見(jiàn)圖7?；谝陨蟽牲c(diǎn)，C 群多糖含量N-乙酰神經(jīng)氨酸含量經(jīng)Johnson變換后的數(shù)據(jù)應(yīng)該在 μ ± 2σ（-1.445，1.431）基礎(chǔ)上適當(dāng)延長(zhǎng)作為其警戒限，μ ± 3σ（-2.164，2.150）適當(dāng)延長(zhǎng)作為其行動(dòng)限。

圖5 C 群多糖N-乙酰神經(jīng)氨酸的Johnson 變換Fig.5 Johnson transformation of N-acetylneuraminic acid content in group C polysaccharide

圖6 C 群多糖含量N-乙酰神經(jīng)氨酸的控制圖Fig.6 I-MR control chart of N-acetylneuraminic acid content in group C polysaccharide

圖7 C 群多糖含量N-乙酰神經(jīng)氨酸的工藝能力指數(shù)報(bào)告Fig.7 A report on the process capability index of N-acetylneuraminic acid content in group C polysaccharide

在疫苗的各階段生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的質(zhì)量屬性，若其結(jié)果服從非正態(tài)分布，可通過(guò)其分布擬合的情況計(jì)算其概率函數(shù)，再根據(jù)其分布規(guī)律制定相應(yīng)的警戒限或行動(dòng)限，最常見(jiàn)的變換有Johnson 轉(zhuǎn)換和Box-Cox 變換。

2.3 水分 水分檢測(cè)結(jié)果經(jīng)分布擬合及數(shù)據(jù)變換差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（AD=3.444~125.048，P 均 <0.05），數(shù)據(jù)不能擬合任何一種分布，且不能執(zhí)行Johnson 變換和Box-Cox 變換，見(jiàn)表3。選取P 最大的水分概率圖（見(jiàn)圖8），數(shù)據(jù)點(diǎn)并未沿著擬合分布線附近分布，離開(kāi)直線，表明擬合是不可接受的。不考慮分布擬合情況，可使用公差限制法，即根據(jù)公差范圍的95%或99%作為警戒限和行動(dòng)限，當(dāng)前水分的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)為< 3%，其警戒限可制定為<2.85%，行動(dòng)限可制定為<2.97%。

圖8 水分的概率圖Fig.8 Probability plot of moisture

表3 水分?jǐn)M合優(yōu)度檢驗(yàn)及分布參數(shù)的極大似然估計(jì)Tab.3 Test of moisture goodness of fit and maximum likelihood estimation of distribution parameters

在疫苗的各階段生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的質(zhì)量屬性，若其結(jié)果數(shù)據(jù)不能擬合任何分布時(shí)，可采用公差限制法或閾值法制定其控制限。

3 討 論

統(tǒng)計(jì)方法在制藥行業(yè)中具有重要作用，可確保持續(xù)生產(chǎn)符合預(yù)定質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)。目前，ICH、PDA、歐洲聯(lián)盟（European Union，EU）已有針對(duì)生物制藥行業(yè)統(tǒng)計(jì)分析方法的指南，國(guó)際標(biāo)準(zhǔn)化組織（International Organization for Standardization，ISO）也建立了一些通用的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法指南，旨在幫助生產(chǎn)公司識(shí)別和正確使用統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法。合理的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法可用于提高決策質(zhì)量，是達(dá)到預(yù)期結(jié)果的一種手段。任何有意義的統(tǒng)計(jì)分析均有前提，首先，數(shù)據(jù)完整性應(yīng)有保證，檢測(cè)方法應(yīng)可靠，分析方法獲得合理的驗(yàn)證如分析方法應(yīng)有充分的準(zhǔn)確性、精密度、重復(fù)性、專屬性、檢測(cè)限及定量限［11］；其次，使用統(tǒng)計(jì)學(xué)工具需要滿足一定的假設(shè)前提，如滿足一定的統(tǒng)計(jì)分布特征（通常是正態(tài)）和取樣的代表性［12-13］，否則用正確的公式計(jì)算出來(lái)的數(shù)字缺乏說(shuō)服力。

本研究采用分布識(shí)別、正態(tài)概率檢驗(yàn)及閾值法等統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法，以質(zhì)量一致性良好的A 群C 群腦膜炎球菌多糖疫苗成品各質(zhì)量屬性的檢測(cè)為例［14］，討論不同分布狀態(tài)下質(zhì)量屬性檢定結(jié)果制定控制限的方法，在疫苗各階段生產(chǎn)過(guò)程中產(chǎn)生的質(zhì)量屬性，若服從正態(tài)分布，均可按照A 群多糖磷含量計(jì)算控制限的方法計(jì)算其警戒限和行動(dòng)限等各類控制限，用以監(jiān)控日常的生產(chǎn)是否處于穩(wěn)定受控狀態(tài)；對(duì)于服從非正態(tài)分布的質(zhì)量屬性，要通過(guò)其分布擬合的情況計(jì)算其概率函數(shù)，再根據(jù)其分布規(guī)律制定相應(yīng)的警戒限或行動(dòng)限，包括最常見(jiàn)的變換有Johnson 轉(zhuǎn)換和Box-Cox 變換。對(duì)于不能擬合任何分布的質(zhì)量屬性，可利用閾值法或公差限制的方法制定其控制限度，閾值法是制藥企業(yè)環(huán)境監(jiān)測(cè)中規(guī)定行動(dòng)限和警戒限常用的一個(gè)方法［3］，行動(dòng)值的規(guī)定應(yīng)符合GMP 的規(guī)定。無(wú)論使用哪種統(tǒng)計(jì)分析方法制定質(zhì)量屬性的控制限，當(dāng)限度確立后，應(yīng)定期進(jìn)行產(chǎn)品質(zhì)量回顧分析，以確認(rèn)工藝穩(wěn)定可靠及現(xiàn)行質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的適用性，及時(shí)發(fā)現(xiàn)不良趨勢(shì)，若歷史數(shù)據(jù)表明檢測(cè)結(jié)果有異常趨勢(shì)，則限度也應(yīng)當(dāng)進(jìn)行相應(yīng)調(diào)整以反映實(shí)際情況。使用合理的統(tǒng)計(jì)分析方法制定控制限后，其控制限的延長(zhǎng)需結(jié)合《中國(guó)藥典》三部（2020 版）［15］、注冊(cè)標(biāo)準(zhǔn)及實(shí)際生產(chǎn)情況而決定。

采用科學(xué)規(guī)范的統(tǒng)計(jì)學(xué)分析方法制定疫苗生產(chǎn)過(guò)程中各類質(zhì)量屬性的控制限才具有合理性，才能對(duì)生產(chǎn)產(chǎn)生良好的指導(dǎo)意義。目前，本公司已按照本研究的方法制定了不同質(zhì)量屬性的控制限度，并才能對(duì)各批次產(chǎn)品關(guān)鍵質(zhì)量屬性檢驗(yàn)結(jié)果進(jìn)行動(dòng)態(tài)I-MR 控制圖趨勢(shì)分析，以期及時(shí)發(fā)現(xiàn)過(guò)程中的異常情況并積極采取相應(yīng)的預(yù)防措施，確保上市產(chǎn)品安全有效。