安 陽,王 莉,張俊迪,楊江濤,王 立

(河北燕達(dá)醫(yī)院呼吸與危重癥醫(yī)學(xué)科，河北 廊坊 065201)

隨著年齡的增長，機(jī)體免疫抵抗能力逐漸下降，同時(shí)由于呼吸系統(tǒng)防御功能的降低，導(dǎo)致老年人群成為肺部感染的高危人群[1]。老年人肺炎的發(fā)生率約為青年人的10倍，在肺炎患者中，約90%的患者為65歲以上老年人，且肺炎已經(jīng)成為80歲以上老年人死亡的第1大原因[2-3]。隨著抗菌藥物在臨床上的廣泛使用，多重耐藥菌(multidrug resistance organism,MDRO)所引發(fā)的肺炎的發(fā)生率逐年升高，MDRO是對3種或3種以上抗菌藥物同時(shí)呈現(xiàn)耐藥性的細(xì)菌[4]。MDRO所導(dǎo)致的老年肺炎病情不易控制，病死率極高，成為臨床診療的重點(diǎn)和難點(diǎn)[5]。微RNA(microRNA，miRNA)是廣泛存在于真核細(xì)胞生物中的非編碼RNA，其長度為21～23個(gè)核苷酸，有研究顯示，miRNA可靶向調(diào)控信使RNA的穩(wěn)定性及翻譯效率，從而參與機(jī)體免疫功能的調(diào)節(jié)[6]。免疫細(xì)胞因子γ-干擾素(interferon-γ，IFN-γ)、白細(xì)胞介素(interleukin，IL)-4、IL-7及轉(zhuǎn)化生長因子-β(transforming growth factor-β，TGF-β)在機(jī)體炎癥反應(yīng)階段發(fā)揮著重要作用。基于此，本研究檢測了MDRO感染肺炎老年患者外周血中miR-127-5p、輔助性T細(xì)胞(helper T cell,Th)和調(diào)節(jié)性T細(xì)胞(regulatory T cell,Treg)及細(xì)胞因子水平，旨在探討miR-127-5p對MDRO感染肺炎老年患者免疫功能及細(xì)胞因子的影響，現(xiàn)將結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1 一般資料選擇2018年3月至2019年11月河北燕達(dá)醫(yī)院收治的MDRO感染肺炎老年患者57例作為MDRO肺炎組，其中男34例,女23例；年齡60～85(73.28±13.44)歲。選擇同期收治的普通肺炎老年患者50例作為肺炎組，其中男29例，女21例；年齡60～86(72.91±14.52)歲。另選擇同期行健康體檢者50例作為對照組，其中30例，女20例；年齡60～85(72.75±15.21)歲。3組受試者性別、年齡比較差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。納入標(biāo)準(zhǔn)：(1)MDRO肺炎組和肺炎組患者均經(jīng)臨床、血常規(guī)、胸部CT檢查、X線胸片以及病原學(xué)檢查確診，患者均符合《中國成人醫(yī)院獲得性肺炎與呼吸機(jī)相關(guān)性肺炎診斷和治療指南(2018年版)》[7]肺炎診斷標(biāo)準(zhǔn)；(2)3組受試者年齡≥60歲；(3)受試者或其家屬自愿簽署知情同意書。排除標(biāo)準(zhǔn)：(1)合并惡性腫瘤、自身免疫性疾病者；(2)入組時(shí)使用重組IFN-γ和中性粒細(xì)胞集落刺激因子治療。本研究經(jīng)醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)時(shí)熒光定量聚合酶鏈反應(yīng)(quantitative real-time polymerase chain reaction，qRT-PCR)法檢測外周血中miR-127-5p相對表達(dá)量抽取MDRO組和肺炎組患者于確診后次日及對照組受試者于健康體檢當(dāng)日清晨空腹靜脈血5 mL，加入外周血淋巴細(xì)胞分離液，然后加入TRIzol置于-80 ℃冰箱備用。采用RNA提取試劑盒(北京索萊寶科技有限公司)提取總RNA，酶標(biāo)儀(深圳邁瑞生物醫(yī)療電子股份有限公司)檢測RNA濃度，反轉(zhuǎn)錄cDNA合成試劑盒(北京全式金生物技術(shù)有限公司)反轉(zhuǎn)錄為cDNA。采用qRT-PCR儀對miR-127-5p及內(nèi)參U6進(jìn)行擴(kuò)增，引物由上海生工生物工程有限公司合成。miR-127-5p上游引物序列為5′-TCCCACCTGCGGGGTGGAAATT-3′，下游引物序列為5′-TCTAGAGAAATCTTTGAATGCCAAG-3′； U6上游引物序列為5′-ATTGGAACGATACAGAGAAGATT-3′，下游引物序列為5′-GGAACGCTTCACGAATTTG-3′。qRT-PCR反應(yīng)體系：AceQ qPCR SYBR Green Master Mix 10 μL，cDNA 1 μL，上下游引物各0.5 μL，ddH2O 8.0 μL。反應(yīng)條件：95 ℃預(yù)變性60 s，95 ℃變性30 s，62 ℃退火30 s，72 ℃延伸15 s，共進(jìn)行45個(gè)循環(huán)。以U6為內(nèi)參基因，采用2-△△Ct法計(jì)算miR-127-5p相對表達(dá)量。

1.2.2 流式細(xì)胞術(shù)檢測外周血中Th、Treg水平MDRO 組及肺炎組患者于確診后次日檢查，對照組于健康體檢當(dāng)日檢查，抽取3組受試者外周靜脈血，抗凝處理后，細(xì)胞培養(yǎng)板中加入200 μL抗凝全血、1640完全培養(yǎng)基100 μL和 4 μL白細(xì)胞刺激劑，混合均勻后于37 ℃下孵育過夜；然后轉(zhuǎn)移至流式管中，使用100 μL 染色緩沖液重懸細(xì)胞后加入適量雙馬來酰亞胺-烯丙基雙酚熒光標(biāo)記表面抗體，室溫下避光放置20～30 min。采用BD FACSCalibur流式細(xì)胞儀(美國BD公司)檢測Th1、Th2、Th17及Treg的數(shù)量，嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。

1.2.3 酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)(enzyme linked immunosorbent assay，ELISA)檢測血清中細(xì)胞因子水平抽取各組受試者外周靜脈血3 mL，3 000 r·min-1離心10 min后分離血清，將其置于-20 ℃冰箱內(nèi)保存待測。采用ELISA檢測受試者血清中IFN-γ、IL-4、IL-7及TGF-β水平，嚴(yán)格按照ELISA試劑盒說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1 3組受試者外周血中miR-127-5p相對表達(dá)量比較結(jié)果見表1。對照組、肺炎組、MDRO肺炎組患者外周血中miR-127-5p相對表達(dá)量分別為1.271±0.318、 0.884±0.225、0.652±0.197，3組受試者外周血中miR-127-5p相對表達(dá)量比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(F=67.512，P<0.05)。MDRO肺炎組患者外周血中miR-127-5p相對表達(dá)量顯著低于肺炎組和對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肺炎組患者外周血中miR-127-5p相對表達(dá)量顯著低于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 3組受試者外周血中Th、Treg細(xì)胞數(shù)量比較結(jié)果見表1。MDRO肺炎組患者外周血中Th1、Treg數(shù)量顯著低于肺炎組和對照組，Th2、Th17數(shù)量顯著高于肺炎組和對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肺炎組患者外周血中Th1、Treg細(xì)胞數(shù)量顯著低于對照組，Th2、Th17細(xì)胞數(shù)量顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

表1 3組受試者外周血中Th、Treg數(shù)量比較Tab.1 Comparison of the numbers of Th,Treg in peripheral blood of subjects among the three groups

2.3 3組受試者血清中IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β水平比較結(jié)果見表2。MDRO肺炎組患者血清中IFN-γ水平顯著低于肺炎組和對照組，IL-4、IL-17及TGF-β水平顯著高于肺炎組和對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)；肺炎組患者血清中IFN-γ水平顯著低于對照組， IL-4、IL-17及TGF-β水平顯著高于對照組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)

表2 3組受試者血清中IFN-γ、IL-4、IL-17及TGF-β水平比較Tab.2 Comparison of the levels of serum IFN-γ，IL-4，IL-17，TGF-β of subjects among the three groups

2.4 MDRO肺炎組患者外周血中miR-127-5p相對表達(dá)量與Th、Treg及其細(xì)胞因子水平的相關(guān)性MDRO肺炎組患者外周血中miR-127-5p相對表達(dá)量與外周血中Th1、Treg數(shù)量及血清中IFN-γ水平呈顯著正相關(guān)(r=0.297、0.302、0.331，P<0.05)，與外周血中Th2、Th17數(shù)量及血清中IL-4、IL-17、TGF-β水平呈顯著負(fù)相關(guān)(r=-0.311、-0.338、-0.289、-0.347、-0.362，P<0.05)。

3 討論

MDRO感染是老年人發(fā)生重癥肺炎的主要原因，患者臨床治療難度大、病死率高，成為學(xué)者們關(guān)注的焦點(diǎn)[8]。有報(bào)道顯示，MDRO肺炎患者大多合并多種基礎(chǔ)性病變及結(jié)構(gòu)性肺病，患者臨床預(yù)后較差，可能與機(jī)體強(qiáng)烈的炎癥反應(yīng)及免疫功能低下有關(guān)[9-10]。miRNA是一種調(diào)控真核細(xì)胞基因表達(dá)的單鏈小片段RNA，對炎癥細(xì)胞及炎癥介質(zhì)的表達(dá)起調(diào)控作用[11]。有研究顯示，miRNA主要通過調(diào)節(jié)Toll樣受體以及細(xì)胞因子的應(yīng)答參與先天性免疫調(diào)控過程，從而在機(jī)體先天性免疫應(yīng)答、特異性免疫應(yīng)答中扮演重要角色[12]。謝丹等[13]研究顯示，miR-127可通過調(diào)控IgG Fcg受體Ⅰ基因表達(dá)參與肺部炎癥反應(yīng)過程。王昭君等[14]通過分析重癥肺炎患者外周血miRNA差異表達(dá)譜，共篩選出43個(gè)miRNA表達(dá)上調(diào)以及113個(gè)miRNA表達(dá)下調(diào)。

本研究結(jié)果顯示，MDRO肺炎組患者外周血中miR-127-5p相對表達(dá)量顯著低于肺炎組和對照組，肺炎組患者外周血中miR-127-5p相對表達(dá)量顯著低于對照組。本研究結(jié)果與其他學(xué)者[15]的研究結(jié)果相似，進(jìn)一步證實(shí)miR-127-5p可能參與肺炎及MDRO肺炎的發(fā)生、發(fā)展過程，推測miR-127-5p對肺炎的調(diào)控作用可能與機(jī)體免疫功能調(diào)節(jié)有關(guān)。

T淋巴細(xì)胞是參與機(jī)體特異性免疫反應(yīng)的重要免疫性細(xì)胞，其中CD4+T淋巴細(xì)胞發(fā)揮著重要的抗感染作用，而CD4+T淋巴細(xì)胞又分為Th和Treg[16]。Th主要包括Th1、Th2、Th17 3個(gè)細(xì)胞亞群，其中Th1主要分泌IL-2和IFN-γ細(xì)胞因子，而IL-2及IFN-γ可激活巨噬細(xì)胞吞噬病原體，從而介導(dǎo)細(xì)胞免疫反應(yīng)；Th2主要分泌IL-4細(xì)胞因子，IL-4可介導(dǎo)速發(fā)型超敏反應(yīng)，從而參與機(jī)體的體液免疫反應(yīng)過程；Th17與自身免疫性疾病的發(fā)生、發(fā)展密切相關(guān)[17-18]。Th17主要分泌IL-17細(xì)胞因子，IL-17細(xì)胞因子可誘導(dǎo)活化T細(xì)胞，同時(shí)促進(jìn)促炎遞質(zhì)的釋放，是一種前炎癥細(xì)胞因子以及促炎癥細(xì)胞因子[19]。Treg作為一類調(diào)控抗體免疫功能的細(xì)胞，可抑制機(jī)體過強(qiáng)的免疫反應(yīng)，Treg主要通過分泌IL-17、TGF-β等來抑制炎癥因子的表達(dá)，從而維持機(jī)體的免疫穩(wěn)態(tài)[20]。本研究結(jié)果顯示，MDRO肺炎組患者外周血中Th1數(shù)量及血清中IFN-γ水平顯著低于對照組和肺炎組，外周血中Th2、Th17、Treg及血清中IL-4、IL-17、TGF-β水平顯著高于對照組和肺炎組。MDRO患者可能由于Th1所介導(dǎo)的細(xì)胞免疫受到明顯抑制，導(dǎo)致其不能正常分泌IFN-γ，使吞噬殺傷病原體功能受到抑制；而MDRO肺炎患者Th17占CD4+T細(xì)胞比例增加，出現(xiàn)Th17/Treg失衡，從而導(dǎo)致患者炎癥反應(yīng)及組織損傷加重，使肺炎患者病情進(jìn)一步加重。此外，學(xué)者研究認(rèn)為，Th1、Th17及Treg的功能狀態(tài)與腦卒中相關(guān)性肺炎患者疾病進(jìn)程及臨床轉(zhuǎn)歸有一定的相關(guān)性[21]。

此外，本研究分析了MDRO肺炎老年患者外周血中miR-127-5p與Th、Treg細(xì)胞及其細(xì)胞因子水平的相關(guān)性，結(jié)果顯示，MDRO肺炎組患者外周血miR-127-5p相對表達(dá)量與Th1、Treg細(xì)胞數(shù)量及血清中IFN-γ水平呈顯著正相關(guān)，與外周血中Th2、Th17細(xì)胞數(shù)量及血清中IL-4、IL-17、TGF-β水平呈顯著負(fù)相關(guān)。提示老年MDRO肺炎患者外周血中miR-127-5p表達(dá)與Th、Treg及其相關(guān)細(xì)胞因子有關(guān)。

綜上所述，MDRO感染肺炎老年患者外周血miR-127-5p水平異常降低，且miR-127-5p表達(dá)水平與Th1、Treg介導(dǎo)的免疫反應(yīng)有關(guān)，值得臨床進(jìn)一步關(guān)注。