溫度、鹽度和pH對多紋錢蝶魚胚胎發(fā)育的影響

孫艷秋 ，劉鑒毅 , ，莊 平 , ，李 琪 ，鄒 雄，馮廣朋 , ，趙 峰 , ，余焱方 ，孫雪娜 ，楊 俊 ，王 妤, ，黃曉榮 ,

（1. 上海海洋大學/水產(chǎn)科學國家級實驗教學示范中心，上海 201306； 2. 中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所；3. 農(nóng)業(yè)農(nóng)村部東海與長江口漁業(yè)資源環(huán)境科學觀測實驗站，上海 200090； 4. 上海長江口漁業(yè)資源增殖和生態(tài)修復(fù)工程技術(shù)研究中心，上海 200090）

多紋錢蝶魚 (Selenotoca multifasciata) 屬于鱸形目、鱸亞目、金錢魚科，俗稱銀鼓魚，與金錢魚 (Scatophagus argus) 屬于同科不同種，主要分布于中國東海南部、南海以及印度尼西亞、菲律賓、泰國等部分區(qū)域。其成魚體長20～40 cm，扁圓形，體表呈銀白色，背部兩側(cè)有數(shù)條黑色橫帶，腹部分布黑色圓斑，因在燈光下反射出銀白色光芒而得名。多紋錢蝶魚是偏植食性的海水雜食性魚類，具有廣溫、廣鹽性，肉質(zhì)細嫩鮮美，深受消費者喜愛，是一種兼具觀賞和食用價值的重要經(jīng)濟魚類，能帶來巨大的經(jīng)濟效益、社會效益和生態(tài)效益。

目前，國內(nèi)外對多紋錢蝶魚的研究資料較少，僅對其胚胎發(fā)育[1]、線粒體基因組[2-3]及致病菌[4]等有少量研究，而對該魚胚胎發(fā)育的適宜溫度、鹽度、pH條件尚未見報道。研究表明，魚類胚胎的孵化出膜主要靠胚體運動和出膜過程中相關(guān)酶的作用，環(huán)境因子對酶活力的影響顯著，是決定水產(chǎn)動物育苗成敗的關(guān)鍵因子[5-7]。其中溫度、鹽度、pH三大因素可以直接影響魚類的胚胎發(fā)育、生長和繁殖，在魚類生長的每個階段均發(fā)揮著至關(guān)重要的作用[8-10]。因此，在人工繁育過程中研究溫度、鹽度和pH對胚胎發(fā)育的影響有助于早期苗種培育適宜條件的選擇和調(diào)控，能夠提高育苗成活率。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

實驗在中國水產(chǎn)科學研究院東海水產(chǎn)研究所海南瓊海研究中心進行。多紋錢蝶魚親魚性腺發(fā)育成熟后經(jīng)人工繁育獲得受精卵。在顯微鏡下觀察受精狀況，選取上層好卵率達80 %的受精卵進行實驗。

1.2 實驗設(shè)計

1.2.1 溫度 設(shè)置 9 個溫度梯度組 (16、20、24、26、28、30、32、34、36 ℃)，每個梯度設(shè)置3個平行。低溫組設(shè)置冰水浴控溫，高溫組設(shè)置熱水浴控溫，實驗開始前使水溫維持在相應(yīng)水平，并進行恒溫孵化，溫控范圍± 0.5 ℃，每半小時用溫度計測定并校準實驗水溫。實驗鹽度為32，pH 8.2。

1.2.2 鹽度 設(shè)置8個鹽度實驗組 (淡水、5、10、15、20、25、30、35)，以自然海水鹽度32為對照，每個鹽度設(shè)置3個平行。使用海水晶和淡水調(diào)配鹽度，每半小時用鹽度計測定并校準實驗鹽度。實驗水溫為26～27 ℃，pH 8.2。

1.2.3 pH 設(shè)置 11 個實驗組 (5.0、5.5、6.0、6.5、7.0、7.5、8.0、8.5、9.0、9.5、10.0)，以自然海水pH 8.2為對照，每個梯度設(shè)置3個平行。用磷酸鹽緩沖液調(diào)配實驗組pH，每半小時用雷磁PH B-4型便攜式pH計測定并校準實驗組pH。實驗水溫為26～27 ℃，鹽度32。

1.3 實驗方法

實驗容器為500 mL的燒杯，多紋錢蝶魚卵受精后，立即將其移至實驗容器中，每個容器放受精卵50粒，微充氣靜水培養(yǎng)。實驗開始后在顯微鏡下觀察并記錄胚胎發(fā)育特點，當視野中半數(shù)胚胎發(fā)生形態(tài)變化時判定進入下一發(fā)育時期。在仔魚半數(shù)破膜時計算出膜時間，仔魚全部出膜后計算孵化率，實驗過程中觀察胚胎及初孵仔魚的畸形狀況，并拍照記錄其形態(tài)。

1.4 數(shù)據(jù)處理

2 結(jié)果

2.1 溫度影響結(jié)果

多紋錢蝶魚的受精卵呈圓球形、澄清透明，卵中央有一個較大的同心油球。溫度對多紋錢蝶魚胚胎發(fā)育的影響結(jié)果見表1。除16、20 ℃外，其他組胚胎均可完成發(fā)育歷程并順利孵出仔魚。

表1 溫度對多紋錢蝶魚胚胎發(fā)育的影響Table 1 Effect of temperature on hatchability and deformity rate of S. multifasciata

2.1.1 溫度對孵化率和畸形率的影響 研究結(jié)果顯示，28 ℃組多紋錢蝶魚的孵化率最高[(81.55±0.84)%]，顯著高于其他組 (P＜0.05)；26 ℃ 組畸形率最低 [(1.46±1.36)%]，顯著低于其他組 (P＜0.05)。32、34和36 ℃組的孵化率均顯著低于其他組 (P＜0.05)，畸形率均顯著高于其他組 (P＜0.05)。

對水溫、孵化率、畸形率進行曲線擬合和回歸性分析，結(jié)果見圖1。孵化率和畸形率與水溫具有顯著相關(guān)性，隨水溫的升高，孵化率 (ya, %) 呈先升高后降低的趨勢，畸形率 (yb, %) 則相反。兩者的回歸方程分別為：ya=-0.66x2+35.23x-410.62 (R2=0.707,P＜0.05)，yb= 0.97x2-52.35x+719.76 (R2=0.910,P＜0.05)。由方程計算可得 26.7 ℃時孵化率最高，27.0 ℃時畸形率最低。

圖1 多紋錢蝶魚孵化率、畸形率與溫度的關(guān)系Figure 1 Relationship among hatching rate, deformity rate and hatching temperature of S. multifasciata

2.1.2 溫度對出膜時間的影響 溫度對多紋錢蝶魚的出膜時間有顯著影響，隨著水溫的升高，出膜時間逐漸縮短(表1)。36 ℃組的出膜時間最短 [(9.66±0.16) h]，顯著低于其他組 (P＜0.05)，24 ℃ 組出膜時間最長 [(23.07±0.08) h]，顯著高于其他組 (P＜0.05)。水溫低于20 ℃時，胚胎發(fā)育中途停止，無法破膜。16 ℃時，胚胎經(jīng)過 (5.05±0.50) h至多細胞期發(fā)育停止；20 ℃時，胚胎經(jīng)過(6.00±0.45) h至桑椹胚期發(fā)育停止；24 ℃時，有半數(shù)胚胎經(jīng)過8 h至原腸中期發(fā)育停止，最后夭亡。

2.1.3 溫度對胚胎形態(tài)的影響 圖2-a為正常胚胎多細胞期，細胞明顯分層，開始重疊。16 ℃組胚胎 (圖2-e)與之相比分裂團皺褶夭亡并逐漸變得混濁；圖2-b為正常胚胎桑椹胚期，胚胎分裂界限逐漸不清晰，20 ℃組胚胎與正常胚胎桑椹胚期相比分裂團皺褶 (圖2-g) 并逐漸變混濁，最終夭亡。一般多紋錢蝶魚的胚胎在顯微鏡下呈圓球形，澄清透明，可清晰看到胚胎形態(tài)變化，但30～36 ℃組胚胎表面容易黏附臟污 (圖2-f)，影響觀察。正常初孵仔魚見圖2-c，30～36 ℃組初孵仔魚畸形率較高，畸形個體見圖2-g、2-h，脊柱呈“之”字形彎曲、尾鰭彎折，較正常仔魚心跳速度快，存活時間短，活力弱。

圖2 不同溫度下多紋錢蝶魚胚胎發(fā)育觀察a. 正常胚胎多細胞期；b. 正常胚胎桑椹胚期；c. 正常初孵仔魚；d. 16 ℃組多細胞期；e. 20 ℃組桑椹胚期；f. 30～36 ℃組胚胎表面黏附臟污；g、h. 30～36 ℃組初孵仔魚畸形。Figure 2 Observation of embryo development of S. multifasciata under different temperature conditionsa. Multicellular stage of normal embryo; b. Morula of normal embryo; c. Normal newly hatched larvae; d. Multicellular stage of 16 ℃;e. Eorula of 20 ℃; f. Surface of embryo was dirty at 30-36 ℃; g, h. Malformation of newly hatched larvae at 30-36 ℃.

2.2 鹽度影響結(jié)果

2.2.1 鹽度對受精卵狀態(tài)的影響 不同鹽度下多紋錢蝶魚受精卵的狀態(tài)不同。鹽度0～20組，發(fā)育早期受精卵表現(xiàn)為完全沉性；鹽度25組為懸浮狀態(tài)，隨著時間延長，受精卵均逐漸上浮，最終漂浮于水面；鹽度30～35組受精卵始終漂浮在水面上。

2.2.2 鹽度對孵化率和畸形率的影響 不同鹽度下多紋錢蝶魚的孵化率和畸形率見表2。除淡水組外，其他組均能孵出仔魚。鹽度5仔魚畸形率最高 [(100.00±0.00)%]，顯著高于其他組 (P＜0.05)。鹽度25時孵化率最高 [(84.92±5.88)%]，顯著高于對照組和其他組 (P＜0.05)，畸形率最低(0)。鹽度30組孵化率與對照組之間無顯著差異 (P＞0.05)，其他組與對照組之間均有顯著差異 (P＜0.05)。

表2 鹽度對多紋錢蝶魚胚胎發(fā)育的影響Table 2 Effect of salinity on embryonic development of S. multifasciata

對鹽度、孵化率、畸形率進行擬合的關(guān)系曲線見圖3。孵化率和畸形率與鹽度具有顯著相關(guān)性，隨著鹽度的升高，孵化率呈先升高后降低的趨勢，畸形率則相反。兩者的回歸方程分別為：ya=-0.12x2+6.20x-11.09 (R2=0.730,P＜0.05)，yb=0.25x2-12.83x+168.62 (R2=0.892,P＜0.05)。由方程計算可得鹽度25.8時孵化率最高，25.7時畸形率最低。

圖3 多紋錢蝶魚孵化率、畸形率與鹽度的關(guān)系Figure 3 Relationship among salinity, hatching rate and deformity rate of S. multifasciata

2.2.3 鹽度對出膜時間的影響 淡水組胚胎無法破膜，經(jīng)過8 h發(fā)育至原腸后期即夭亡(表2)。鹽度15和20組的出膜時間最短，分別為 (17.94±0.28) 和 (17.87±0.40) h，顯著低于其他鹽度組 (P＜0.05)。鹽度25～35組出膜時間逐漸縮短，但差異均不顯著 (P＞0.05)。

2.2.4 鹽度對胚胎發(fā)育形態(tài)的影響 正常胚胎原腸末期(圖4-a) 囊胚層下包卵黃至 3/4 處，并逐漸向下包裹；隨后胚孔閉合，胚體出現(xiàn)，進入胚體形成期 (圖4-b)。與正常原腸期胚胎相比，淡水組胚胎原腸期卵黃囊萎縮 (圖4-c)，顏色逐漸混濁，最終夭亡。鹽度5～15組部分胚胎原腸末期還未結(jié)束就進入胚體形成期，2個時期共存，并繼續(xù)向后發(fā)育 (圖 4-d)。

圖4 不同鹽度下多紋錢蝶魚胚胎發(fā)育觀察a. 正常胚胎原腸后期；b. 正常胚體形成期；c. 淡水組胚胎原腸后期；d. 鹽度5～15組部分胚胎胚體形成期。Figure 4 Observation of embryonic development of S. multifasciata at different salinitiesa. Late-gastrula period of normal embryo; b. Normal embryogenesis period; c. Late-gastrula period of fresh water;d. Embryogenesis of partial embryos at salinity 5-15.

2.3 pH影響結(jié)果

2.3.1 pH對孵化率和畸形率的影響 由表3可見，pH 5.5～8.5均能孵出仔魚，其他4組孵化率為0。pH 5.5時，孵化率較低，僅為 (12.41±4.67)%，畸形率高達 (97.67±2.52)%，與其他各組差異顯著 (P＜0.05)。pH 6.0～8.0組與對照組孵化率均較高，高于60%，各組間無顯著性差異，但pH 6.0、6.5組畸形率較高，分別為(23.41±5.04)%、(14.60±0.56)%，顯著高于其他3組 (P＜0.05)。

表3 pH對多紋錢蝶魚胚胎發(fā)育的影響Table 3 Effects of pH on embryonic development and newly hatched larvae of S. multifasciata

對pH、孵化率、畸形率進行擬合的關(guān)系曲線見圖5。隨著pH的升高，胚胎孵化率呈先升高后降低的趨勢，畸形率相反。兩者的回歸方程分別為：ya=-16.91x2+247.45x-812.98 (R2=0.794,P＜0.05)，yb=21.47x2-324.05x+1 216.3 (R2=0.879,P＜0.05)。由方程計算可得pH 7.3時孵化率最高，pH 7.0～8.0時畸形率均為0。

圖5 多紋錢蝶魚孵化率、畸形率與pH的關(guān)系Figure 5 Relationship among pH, hatching rate and deformity rate of S. multifasciata

2.3.2 pH對出膜時間的影響 pH對多紋錢蝶魚的出膜時間具有顯著影響，隨著pH的升高，出膜時間逐漸縮短(表3)。pH 8.5組出膜時間最短 [(17.93±0.16) h]，顯著低于其他組 (P＜0.05)；pH 5.5 組出膜時間最長 [(26.51±0.09) h]，顯著高于其他組 (P＜0.05)；pH 7.5、8.0組的出膜時間差異不顯著 (P＞0.05)。

2.3.3 pH對胚胎發(fā)育形態(tài)的影響 pH 5.0、5.5組，胚胎進入水體10 min后即由澄清透明變混濁，胚胎仍然繼續(xù)向后發(fā)育，但色素逐漸堆積。pH 5.0組無法破膜。正常胚胎耳石形成期耳囊輪廓明顯，耳囊內(nèi)可見耳石, 初孵仔魚形態(tài)清晰，活力強 (圖6-a)；pH 5.5組耳石形成期顏色暗沉，且脊椎呈螺旋狀扭曲 (圖6-c)，破膜前幾乎無法觀察到心跳，初孵仔魚均為畸形，且無游動能力 (圖6-d)。

圖6 不同pH下胚胎多紋錢蝶魚發(fā)育觀察a. 正常胚胎耳石形成期；b. 正常初孵仔魚；c. pH 5.5組胚胎耳石形成期；d. pH 5.5組初孵仔魚。Figure 6 Observation of embryo development of S. multifasciata at different pHa. Appearance of statolith of mormal embryo; b. Normal newly hatched larvae; c. Appearance of statolith of embryo in pH 5.5 group;d. Malformation of newly hatched larvae in pH 5.5 group.

3 討論

3.1 溫度對胚胎發(fā)育的影響

本研究顯示24～36 ℃下多紋錢蝶魚可以孵化出膜，其胚胎孵化率和畸形率與水溫顯著相關(guān)，變化趨勢與斑馬魚(Brachydanio rerio var)[11]、日本黃姑魚 (Nibea japonica)[8]等海水魚類的研究結(jié)果一致。從孵化率、畸形率和初孵仔魚的游動活力3方面綜合分析，多紋錢蝶魚的最適孵化水溫為26～28 ℃，與同科金錢魚的最適孵化水溫28～30 ℃[12]相近。

溫度會影響魚類胚胎的發(fā)育時數(shù)，溫度過低則代謝活動降低，能量積累慢，從而抑制胚胎發(fā)育進程[13]。本研究中，溫度降低，出膜時間延長，低于20 ℃時胚胎畸形，甚至過早夭亡；隨著溫度的升高，胚胎出膜時間持續(xù)縮短。這與半滑舌鰨 (Cynoglossus semilaevis)[5]、鮸狀黃姑魚(N. miichthioides)[14]、真鯛 (Pagrus major)[15]、軍曹魚(Rachycentron canadum)[16]等多數(shù)暖水性海洋魚類相同。水溫升高雖然可以縮短多紋錢蝶魚的出膜時間，促進胚胎發(fā)育，但對其生長發(fā)育并非絕對有利。本研究中34、36 ℃組畸形率較高，且初孵仔魚活力低。Kamler[13]的研究表明，當溫度過高，超過魚類的自身調(diào)節(jié)范圍時，魚的代謝強度增大，能量消耗大于能量積累，從而影響仔魚的出膜，導(dǎo)致畸形。對軍曹魚[17]、真鯛[15]、青鳉 (Oryzias latipes)[18]等研究表明，親魚性腺發(fā)育所處的溫度條件會影響魚類胚胎發(fā)育的溫度。本研究中，溫度降低至20 ℃時胚胎孵化率為0，明顯低于30 ℃時的孵化率，這是因為多紋錢蝶魚成魚主要生活于印度-西太平洋海域，屬于暖水性海洋魚類，因此其胚胎對高溫的耐受性強于低溫，不適宜在北方低溫環(huán)境中培育。

3.2 鹽度對胚胎發(fā)育的影響

多紋錢蝶魚受精卵中央的大油球能使受精卵漂浮于水中，具有典型硬骨魚類浮性卵的特性，其受精卵在不同鹽度水體中的沉浮狀態(tài)與日本黃姑魚[8]、軍曹魚[17]的受精卵稍有不同。低鹽度使受精卵發(fā)育早期沉底，胚胎難以得到足夠的氧氣，同時還會受死亡胚胎影響，導(dǎo)致孵化率降低，畸形率升高，對生產(chǎn)不利。鹽度25時多紋錢蝶魚孵化率高達(84.92±5.88)%，畸形率為0，因此在多紋錢蝶魚苗種培育時，若海水鹽度低于25，可適當調(diào)高孵化用水鹽度，并保持連續(xù)充氣，使受精卵處于懸浮狀態(tài)。

鹽度顯著影響多紋錢蝶魚的孵化率和畸形率，這與大黃魚 (Larimichthys crocea)[19]、雜交石斑魚[20]、日本黃姑魚[8]等大多數(shù)魚類一樣，隨著鹽度的升高，孵化率呈先升高后降低的趨勢，而畸形率則相反。低鹽條件下海水魚胚胎細胞骨架解體，無法順利孵化，淡水條件下多紋錢蝶魚胚胎僅能發(fā)育至原腸期，最終全部夭亡；青島文昌魚(Branchiostoma tsingdauertse)[21]胚胎僅能發(fā)育至4或8細胞期，鹽度為4時全部夭亡；條斑星鰈 (Verasper moseri)[22]、日本黃姑魚[8]胚胎則在鹽度10時全部夭亡。因此判斷海水魚類胚胎的孵化也需要一定的鹽度，Ciapa和Philippe[23]的研究證實了這一發(fā)現(xiàn)：當胚胎孵化環(huán)境中缺少鈉離子 (Na+)時，有絲分裂促進因子激活量減少，代謝成本增加，酶活性減弱，從而導(dǎo)致生物發(fā)育停滯。鹽度介于25～32時受精卵一直保持著較高孵化率 (高于60%)，而畸形率低于10%，表明多紋錢蝶魚胚胎孵化最適鹽度范圍較廣，與其廣鹽性的特點相吻合。然而，當鹽度低于25或高于32時，孵化率急劇降低，畸形率急劇升高。從孵化率、畸形率及初孵仔魚活力綜合分析，認為鹽度25～32是多紋錢蝶魚胚胎發(fā)育的最適鹽度范圍。

3.3 pH對胚胎發(fā)育的影響

pH對多紋錢蝶魚胚胎的孵化率、畸形率及出膜時間的影響結(jié)果與葉爾羌高原鰍 (Triplophysa yarkandensis)[24]、斑馬魚[11]、斜帶石斑魚 (Epinephelus coioides)[25]、黃鰭東方鲀(Takifugu xanthopterus)[26]等研究一致。這種影響機制可以從兩方面分析：1) 胚胎發(fā)育階段的酸堿調(diào)節(jié)機制尚未發(fā)育完全，遭到了極端pH環(huán)境的破壞[27]；2) pH通過改變胚胎孵化過程中酶與底物的結(jié)合或改變酶的構(gòu)象[28-30]2種途徑來影響酶活力大小，pH過高或過低，均會引起酶活力下降，從而降低孵化率。綜合分析pH對多紋錢蝶魚孵化率、畸形率的影響，pH 7.0～8.2時，多紋錢蝶魚胚胎孵化率較高，畸形率較低，游動活力較強，為其胚胎發(fā)育的最適pH范圍。多數(shù)海水魚類適應(yīng)于中性或偏弱堿性的水環(huán)境，本研究結(jié)果顯示多紋錢蝶魚與大多數(shù)海水魚類的適宜pH條件一致。

極端的pH會顯著影響胚胎形態(tài)。研究表明，低pH可致鰱 (Hypophthalmichthys molitrix)[31]胚胎畸形，絕大多數(shù)畸形個體為背腹方向的彎體，腹部呈膨大狀，少數(shù)畸形胚出現(xiàn)小頭，這與本研究pH 5.5組表現(xiàn)相似。pH 5.0組多紋錢蝶魚受精卵的卵黃囊皺縮；pH 9.0～10.0，胚胎夭亡，無法出膜。這是因為魚類早期生命階段酸堿調(diào)節(jié)機制還未發(fā)育完全[28,30-33]，極端的pH引起胚胎卵膜軟化，卵球塌陷失去彈性，并且卵膜極易提前破裂，仔魚無法正常孵出，或出膜后即大批量死亡。還有研究表明，pH不僅對魚類早期生命階段產(chǎn)生影響，還會干擾魚類的性別決定過程，引起海水魚類種群的性別失調(diào)，進而對魚類的繁育也造成一定影響[34]。

3.4 溫度、鹽度、pH影響對比

溫度、pH均顯著影響多紋錢蝶魚的出膜時間，但鹽度對出膜時間的影響不顯著 (P＞0.05)，各鹽度組多紋錢蝶魚的孵化出膜時間大致相同。對比發(fā)現(xiàn)，鹽度對多紋錢蝶魚胚胎發(fā)育的影響不及溫度和pH顯著，這與黃姑魚 (N. albiflora)[35]、棘頰雀鯛 (Premnas Biaculeatus)[36]等海水魚和尖鰭鯉 (Cyprinus carpio)[37]、倒刺鲃 (Spinibarbus denticulatus)[38]、似刺鳊(Paracanthobrama guichenoti Bleeker)[39]等淡水魚類胚胎發(fā)育的研究結(jié)果一致。

多紋錢蝶魚胚胎發(fā)育過程中，原腸期到胚體形成期對環(huán)境溫度、鹽度條件較為敏感。溫度影響實驗中，24 ℃半數(shù)胚胎發(fā)育至原腸中期便夭亡；鹽度影響實驗中，淡水條件下胚胎發(fā)育至原腸期便夭亡，鹽度5～15部分胚胎原腸末期還未結(jié)束便進入胚體形成期，2個時期共存；而能順利渡過原腸期進入胚體形成期的胚胎一般可以完成胚胎發(fā)育并出膜。邵鑫斌等[40]研究發(fā)現(xiàn)，綠鰭馬面鲀 (Thamnaconus septentrionalis)在胚胎發(fā)育到胚體形成期時對溫度條件更為敏感，胚胎畸形率升高。陳漪等[41]對比海水和淡水青鳉的胚胎發(fā)育發(fā)現(xiàn)，淡水青鳉原腸期至胚體形成期的發(fā)育時序與本研究中多紋錢蝶魚相同，原腸末期與胚體形成期共存。

4 結(jié)論

本文通過研究多紋錢蝶魚胚胎發(fā)育的適宜條件發(fā)現(xiàn)多紋錢蝶魚的胚胎發(fā)育容易受外界環(huán)境的影響，其最適孵化溫度為 26～28 ℃，鹽度為 25～32，pH 為 7.0～8.2，此研究結(jié)果可為多紋錢蝶魚苗種培育及生產(chǎn)提供科學依據(jù)。