牡蠣酶解產(chǎn)物對超負(fù)荷哺乳大鼠泌乳的影響

諶素華，秦小明, ，章超樺, ，曹文紅, ，鄭惠娜, ，林海生,

（1. 廣東海洋大學(xué)食品科技學(xué)院/國家貝類加工技術(shù)研發(fā)分中心 (湛江)/廣東省水產(chǎn)品加工與安全重點實驗室/廣東省海洋生物制品工程實驗室/水產(chǎn)品深加工廣東普通高等學(xué)校重點實驗室，廣東 湛江 524088； 2. 大連工業(yè)大學(xué)/海洋食品精深加工關(guān)鍵技術(shù)省部共建協(xié)同創(chuàng)新中心，遼寧 大連 116034）

牡蠣屬于軟體動物門、雙殼綱、珍珠貝目，俗稱海蠣子、蠔等，是世界第一大養(yǎng)殖貝類[1]。牡蠣肉鮮味美、營養(yǎng)豐富，富含蛋白質(zhì)，其氨基酸組成和品質(zhì)優(yōu)于人乳和牛乳，有“海底牛奶”之稱[2]。牡蠣具有獨特的食用、藥用價值，是我國首批被列為藥食同源的保健食品之一[3]。據(jù)《神龍本草經(jīng)》和《傅青主女科》記載，蠣肉治虛損，療婦人氣血；治產(chǎn)后汗出煩躁，效果顯著。研究表明，牡蠣酶解產(chǎn)物 (Oyster enzymatic hydrolysate products,OEHP) 具有增強免疫力[4]、抗腫瘤[5]、抗癌[6]、抗氧化[7]、降血壓[8]、降血糖[9]和抗炎[10]等多種生物活性，但有關(guān)OEHP對泌乳的作用和機理等尚未見報道。

母乳含有豐富的免疫物質(zhì)和活性生長因子，能全面滿足嬰兒生長、發(fā)育的需要，母乳喂養(yǎng)是全球公認(rèn)的最佳喂養(yǎng)方式[11-13]。目前受職業(yè)女性增加、剖宮產(chǎn)率增高、母乳喂養(yǎng)知識缺乏、膳食營養(yǎng)不均衡、生活方式改變以及社會環(huán)境等因素的影響，產(chǎn)后缺乳癥逐年攀升，母乳喂養(yǎng)現(xiàn)狀堪憂[14-17]?；谀迪牭乃幨硟捎脙r值，有必要對其促進(jìn)泌乳作用進(jìn)行深入研究。本研究先開展了牡蠣粉對哺乳期超負(fù)荷哺乳母鼠泌乳影響的預(yù)實驗，結(jié)果顯示牡蠣粉能顯著改善哺乳期母鼠泌乳，在此基礎(chǔ)上，采用大鼠超負(fù)荷哺乳模型探索了OEHP對母鼠泌乳的調(diào)節(jié)作用，以期為牡蠣資源的開發(fā)與利用提供參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 動物、材料與試劑

SPF級健康SD大鼠 (49日齡未配種大鼠)，購于北京華阜康生物科技有限公司，動物生產(chǎn)許可號為SCXK [(京) 2019-0008]。其中，雌性60只，雄性30只，雌鼠體質(zhì)量為180～200 g，雄鼠體質(zhì)量為 200～250 g。

香港牡蠣 (Crassostrea hongkongensis) 購于湛江霞山東風(fēng)水產(chǎn)品市場，新鮮開殼清洗干凈，勻漿后冷凍干燥超微粉碎過100目篩制得牡蠣粉(Oyster powder, OP) 備用。OEHP的制備采用常格[18]方法，加入動物蛋白水解酶 (1 000 U·g-1)，53 ℃酶解4 h后離心取上清液濃縮冷凍干燥，得OEHP備用。

動物蛋白水解酶 (酶活為18×104U·g-1，南寧龐博生物工程有限公司)；硼酸、無水碳酸鈉、無水乙醇、濃硫酸、濃鹽酸、硫酸鉀、葡萄糖、正丁醇、五水合硫酸、三氯乙酸、二甲苯 (分析純，廣東光華科技股份有限公司)；蘇木精伊紅染色劑(＞200 T)、水合氯醛、乙酸鋅、福林酚、牛血清蛋白 (97%純度)、PRL試劑盒 (廣州鼎國生物技術(shù)有限責(zé)任公司)。

1.2 主要儀器與設(shè)備

UX42OH電子天平、HC10002小動物電子秤、ATY1124電子天平 (日本島津公司)；RM2016石蠟切片機、KD-H烘片機、DMI4000B智能型倒置熒光顯微鏡 (德國Leica公司)；Varioskan Flash全自動酶標(biāo)儀 (美國Thermo公司)。

1.3 方法

1.3.1 一般營養(yǎng)成分測定 水分按照GB 5009.3—2010采用常壓干燥法測定；灰分按照GB 5009.4—2010采用高溫灼燒法測定；脂肪按照GB 5009.6—2003采用索氏抽提法測定；蛋白質(zhì)按照GB 5009.5—2010采用凱氏定氮法測定，轉(zhuǎn)換系數(shù)為6.25；總糖采用蒽酮比色法測定，測得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.005 9x+0.000 6 (R2=0.998 6)。

1.3.2 牡蠣粉和OEHP的灌胃量確定 參考胡培麗等[19]的方法，開展牡蠣粉對哺乳期母鼠泌乳的預(yù)實驗，灌胃劑量參考1 800 mg·kg-1；結(jié)合牡蠣酶解粉蛋白質(zhì)含量及動物實驗實際情況確定本實驗的灌胃劑量，按照1∶2∶4選擇高、中、低劑量，確定OEHP的灌胃高、中、低劑量為1 250、625、312.5 mg·kg-1。

1.3.3 大鼠同籠交配 雌雄比2∶1，連續(xù)同籠7 d，交配后的雌鼠合籠飼養(yǎng)，每籠5只。妊娠20 d后，將雌孕鼠單籠飼養(yǎng)，做好分娩準(zhǔn)備，每日觀察2次，及時了解大鼠分娩及分娩的胎仔數(shù)量，分娩結(jié)束后，清點仔鼠數(shù)。

1.3.4 超負(fù)荷哺乳模型建立 參考胡培麗等[19]和汪琴等[20]的方法，建立大鼠超負(fù)荷哺乳模型，取產(chǎn)仔前后相差不超過24 h的40只母鼠作為研究對象，每窩仔鼠調(diào)整為14只。在哺乳期前5 d一旦發(fā)現(xiàn)仔鼠死亡，記為仔鼠自然死亡，立即補充仔鼠到14只；超過5 d后仔鼠死亡，則不再補充異窩仔鼠。將母鼠按體質(zhì)量隨機分為對照組和OEHP高、中、低劑量組，每組10只。自分娩第二日起，對照組每日以蒸餾水灌胃，給藥組分別以不同濃度的OEHP灌胃，每日1次，各組均灌胃21 d，各組動物均正常飲水。哺乳母鼠和仔鼠每天稱體質(zhì)量1次，分別計算期間哺乳母鼠泌乳量和仔鼠平均體增重。每日觀察仔鼠死亡情況。

1.3.5 相關(guān)指標(biāo)測定 1) 母鼠泌乳量測定。母鼠產(chǎn)仔后第二日起，每日08:00時將仔鼠與母鼠分離，待仔鼠饑餓4 h后，即12:00時對仔鼠進(jìn)行哺乳前稱量，之后將仔鼠放回鼠窩中哺乳1 h，然后再次分離仔鼠與母鼠，并對哺乳1 h后的仔鼠進(jìn)行稱量，仔鼠哺乳1 h前后的體質(zhì)量差值即為這一小時的泌乳量。2) 仔鼠平均體增重測定。仔鼠從產(chǎn)后第二日起，每日08:00時將仔鼠與母鼠分離后立即稱量每窩仔鼠體質(zhì)量，持續(xù)稱量21 d，記錄數(shù)據(jù)，計算21 d仔鼠前后體質(zhì)量差。3) 乳腺器官指數(shù)、臟器指數(shù)測定。處死母鼠后剪取第三對乳腺稱質(zhì)量；分別剪取母鼠心臟、胸腺、脾臟、肝臟、腎臟等稱質(zhì)量并計算。乳腺指數(shù)=乳腺組織質(zhì)量/母鼠體質(zhì)量×100%，臟器指數(shù)=臟器組織質(zhì)量/母鼠體質(zhì)量×100%。4) 泌乳素 (Prolactin, PRL) 測定。PRL測定方法按試劑盒說明操作，酶標(biāo)儀檢測，以標(biāo)準(zhǔn)物濃度為橫坐標(biāo)，標(biāo)準(zhǔn)物的OD值為縱坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線，計算出直線回歸方程，再將樣品的OD值代入直線回歸方程中，計算樣品濃度，即為母鼠血清PRL濃度，測得標(biāo)準(zhǔn)曲線為y=0.001 6x-0.032 2(R2=0.998 2)。5) HE染色法觀察乳腺組織結(jié)構(gòu)。實驗結(jié)束時處死母鼠，剪取第三對乳腺，固定后染色鏡檢進(jìn)行組織病理學(xué)觀察。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計分析

所有實驗數(shù)據(jù)采用SPSS 22.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計和分析，利用獨立性t檢驗進(jìn)行差異顯著性分析，結(jié)果均以“平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤”表示。P＜0.05為差異顯著，P＜0.01為差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 一般營養(yǎng)成分測定

牡蠣粉和OEHP一般營養(yǎng)成分測定結(jié)果見表1，兩者的蛋白質(zhì)質(zhì)量分?jǐn)?shù)最高，其次是總糖，而脂肪質(zhì)量分?jǐn)?shù)較低。

表1 牡蠣及其酶解產(chǎn)物一般營養(yǎng)成分 (干基)Table 1 General nutrition indices and enzymatic hydrolysate products of oyster (dry mass basis) %

2.2 OEHP對超負(fù)荷哺乳母鼠泌乳量的影響

對超負(fù)荷哺乳大鼠持續(xù)灌胃21 d的每天每小時泌乳量和總平均泌乳量進(jìn)行分析，結(jié)果見表2和表3。與對照組比較，OEHP高劑量組母鼠的每天每小時泌乳量有顯著性差異 (P＜0.05) 的天數(shù)是第3、第4、第5、第6、第10、第11、第14、第15和第18天，有極顯著差異 (P＜0.01) 的天數(shù)是第1、第2、第7、第9、第12、第13、第16、第17、第20和第21天；中劑量組母鼠的每小時泌乳量有顯著性差異 (P＜0.05) 的是第2、第3、第4、第11和第16天，有極顯著差異 (P＜0.01) 的天數(shù)是第9、第12、第13、第14、第18、第20和第21天；僅第8和第19天各劑量組母鼠每小時泌乳量無顯著差異；低劑量組母鼠每小時泌乳量有顯著性差異 (P＜0.05) 的是第3、第16和第18天。與中劑量組相比，高劑量組母鼠每小時泌乳量在第6和第10天有顯著性差異 (P＜0.05)，在第1和第17天有極顯著差異 (P＜0.01)；與低劑量組相比，高劑量組在第5、第6、第7、第12和第16天有顯著差異 (P＜0.05)，在第1、第2、第9、第13、第17和第21天有極顯著差異 (P＜0.01)；與低劑量組相比，中劑量組在第5、第12和第14天有顯著性差異 (P＜0.05)，在第20天有極顯著差異 (P＜0.01)。本結(jié)果表明，OEHP高劑量組可顯著增加哺乳期母鼠的泌乳量，中劑量組的影響次之，低劑量組的影響最小且效果不顯著，OEHP對超負(fù)荷哺乳母鼠泌乳的影響與灌胃劑量呈正相關(guān)。

表2 母鼠哺乳21 d每天每小時泌乳量Table 2 Maternal milk production per hour per day for female rats lactated for 21 d g·h-1

對灌胃21 d的各組母鼠總平均泌乳量進(jìn)行分析，結(jié)果見表3。與對照組相比，OEHP高劑量組差異極顯著 (P＜0.01)，泌乳量增加57.85%；中劑量組差異顯著 (P＜0.05)，泌乳量增加38.02%；低劑量組差異不顯著，但泌乳量增加17.69%。以上結(jié)果表明OEHP使超負(fù)荷哺乳母鼠泌乳量顯著增加，可有效促進(jìn)超負(fù)荷哺乳母鼠泌乳。

表3 母鼠哺乳21 d每小時泌乳量總平均值Table 3 Total average maternal milk production per hour per day for female rats lactated for 21 d g

2.3 OEHP對哺乳期仔鼠體增重的影響

本實驗對哺乳21 d的仔鼠進(jìn)行觀察記錄，未發(fā)現(xiàn)死亡現(xiàn)象。并對其體增重進(jìn)行分析 (表4)。母鼠哺乳21 d后，OEHP高、中、低劑量組仔鼠體增重與對照組相比均有增加，分別增長13.62%、12.28%、11.99%，且差異極顯著 (P＜0.01)，高劑量組與中低劑量組相比有顯著差異 (P＜0.05)。本結(jié)果表明OEHP能明顯增加超負(fù)荷哺乳母鼠的泌乳量，從而使其窩仔鼠的體增重顯著增加，這一評價指標(biāo)也表明OEHP對哺乳期母鼠有促進(jìn)泌乳作用，可減少仔鼠的死亡。

表4 21 d仔鼠體增重Table 4 Total average body weight gain of newborn rats in 21 d g

2.4 OEHP對超負(fù)荷哺乳母鼠乳腺器官指數(shù)和臟器指數(shù)的影響

對灌胃21 d母鼠的乳腺器官指數(shù)和臟器指數(shù)進(jìn)行分析，結(jié)果見表5和表6。OEHP高劑量組的乳腺器官指數(shù)與對照組差異極顯著 (P＜0.01)，中劑量組與低劑量組差異顯著 (P＜0.05)。本結(jié)果顯示各組乳腺器官指數(shù)由大到小的順序為高劑量組＞中劑量組＞低劑量組＞對照組。乳腺器官指數(shù)能從側(cè)面反映哺乳期母鼠乳腺的生長、發(fā)育與泌乳情況，說明OEHP可以促進(jìn)超負(fù)荷哺乳母鼠乳腺發(fā)育。

表5 母鼠乳腺器官指數(shù)Table 5 Mammary gland organ indexes of female rats

與對照組相比，灌胃OEHP各劑量組的母鼠心臟指數(shù)有顯著差異 (P＜0.05)，其中高劑量組差異極顯著 (P＜0.01)，說明OEHP能促進(jìn)哺乳期母鼠的心臟發(fā)育，使其泵血更有力，從而增強哺乳期母鼠的負(fù)荷能力 (表6)。高劑量組母鼠的脾臟指數(shù)與對照組相比差異顯著 (P＜0.05)，且腎臟指數(shù)差異極顯著 (P＜0.01)。各組母鼠的臟器指數(shù)與對照組相比均有不同程度的增加，說明OEHP能增強超負(fù)荷哺乳母鼠的臟器負(fù)荷能力，有利于其哺育仔鼠。

表6 母鼠臟器器官指數(shù)Table 6 Organ indexes of female rats

2.5 OEHP對超負(fù)荷哺乳母鼠血清PRL濃度的影響

對灌胃21 d的各組哺乳母鼠的血清PRL進(jìn)行分析，結(jié)果見表7。與對照組相比，高劑量組PRL質(zhì)量濃度增加了41.67%，有極顯著性差異(P＜0.01)；中劑量組增加26.39%，有顯著性差異(P＜0.05)；低劑量組增加11.11%；OEHP高劑量組的PRL質(zhì)量濃度比低劑量組高27.50%，有顯著差異 (P＜0.05)。由此可以得出OEHP高、中劑量組促進(jìn)超負(fù)荷哺乳期母鼠泌乳的效果顯著，且存在一定的劑量依賴性。

表7 母鼠血清催乳素質(zhì)量濃度Table 7 Serum PRL mass concentrations of female rats ng·mL-1

2.6 OEHP對超負(fù)荷哺乳母鼠乳腺組織結(jié)構(gòu)的影響

對灌胃21 d各組母鼠的乳腺組織結(jié)構(gòu)進(jìn)行觀察，結(jié)果見圖1。與對照組相比，OEHP各劑量組的母鼠乳腺組織腺泡較多，且集中，泡腔充盈，導(dǎo)管數(shù)量多，導(dǎo)管腔較粗，腺泡有明顯擴大增生，OEHP高劑量組的效果最明顯，說明OEHP能促進(jìn)超負(fù)荷哺乳母鼠乳腺發(fā)育，改善其乳腺結(jié)構(gòu)，提高哺乳母鼠泌乳量，促進(jìn)泌乳。

圖1 各組乳腺組織結(jié)構(gòu)Figure 1 Tissue structure of mammary gland in each group

3 討論

大鼠泌乳調(diào)節(jié)方式同人類相似，在血漿PRL的調(diào)節(jié)下啟動和維持泌乳。在動物實驗中，雖然不易觀察正常哺乳的催乳作用，但能觀察到乳汁分泌不足情況[21]，所以在進(jìn)行泌乳實驗時首先要建立乳汁不足的動物模型。常用的大鼠缺乳模型有2種：1) 用化學(xué)藥物處理大鼠，使母鼠缺乳，建立病理模型；2) 通過調(diào)整每只母鼠所哺育的仔鼠數(shù)量，使母鼠在哺乳一定數(shù)量的仔鼠時不能滿足仔鼠的哺乳需求，為超負(fù)荷大鼠模型。產(chǎn)后缺乳是指產(chǎn)后哺乳期內(nèi)產(chǎn)婦乳汁甚少或無乳可下，不夠喂養(yǎng)嬰兒，乳房檢查松軟無痛，乳汁點滴而出[22]。為了能更好地貼合臨床實際，本研究采用正常大鼠超負(fù)荷哺乳模型來研究OEHP對母鼠泌乳的影響。

關(guān)于牡蠣促進(jìn)泌乳的研究報道較少，有種含牡蠣粉的營養(yǎng)品和組合物能促進(jìn)產(chǎn)婦泌乳和恢復(fù)[23-24]，其主要通過添加一定量的牡蠣營養(yǎng)品來促進(jìn)泌乳作用，而有關(guān)牡蠣促進(jìn)泌乳作用及其機制的研究未見報道。本文通過開展牡蠣粉對哺乳期超負(fù)荷哺乳母鼠泌乳的預(yù)實驗，確定牡蠣粉能有效改善超負(fù)荷母鼠泌乳，結(jié)合牡蠣粉在酶解后富含活性多肽且更容易被吸收利用的特點，對OEHP進(jìn)行促進(jìn)泌乳效果研究，為下一步對OEHP中促進(jìn)泌乳的活性成分的研究奠定基礎(chǔ)。

乳腺是泌乳的前提，乳腺由乳腺組織和分布期間的結(jié)締組織構(gòu)成[25]，其發(fā)育區(qū)別于機體其他組織器官，是哺乳動物出生后可繼續(xù)生長發(fā)育的動態(tài)變化的器官。泌乳過程以乳腺發(fā)育為基礎(chǔ)，發(fā)育完善的乳腺在PRL等作用下開始泌乳的發(fā)動和維持，而泌乳的每個階段受不同激素的影響，參與調(diào)節(jié)的主要激素包括PRL[26]、生長激素 (Growth homorne,GH)[27]、雌性激素[28]，在乳腺發(fā)育階段受雌激素和孕激素的影響，泌乳發(fā)動階段主要受PRL和糖皮質(zhì)激素的影響，乳腺泌乳的維持階段受PRL和GH的調(diào)控[29]。乳汁的分泌過程首先是乳腺組織的分泌細(xì)胞從血液中吸取各種營養(yǎng)成分，隨后細(xì)胞利用這些養(yǎng)分合成乳汁，乳汁合成后分泌到腺泡中，最后經(jīng)過導(dǎo)管等分泌到體外。腺泡可以理解為暫時儲存乳汁的空間[30]，所以腺泡腔體大小可反映泌乳能力，腺泡腔體越大，泌乳量越多。乳腺上皮細(xì)胞在PRL的作用下，其新陳代謝速度加快，乳蛋白mRNA濃度也相應(yīng)增加[31]。王一飛等[32]通過研究發(fā)現(xiàn)“米酒雞”食療方可使產(chǎn)后缺乳母鼠的催乳素受體 (PRLR) 及β酪蛋白陽性表達(dá)增強，促進(jìn)乳腺上皮細(xì)胞增殖和乳腺發(fā)育。張榮慶等[33]通過研究大豆黃酮對妊娠大鼠乳腺發(fā)育和泌乳作用的影響，發(fā)現(xiàn)大豆黃酮能夠顯著促進(jìn)妊娠期大鼠乳腺的發(fā)育，明顯提高其泌乳量、血清GH和PRL濃度以及乳腺胞漿雌二醇受體數(shù)目。本實驗測定了哺乳母鼠血清PRL濃度，結(jié)果表明OEHP高、中劑量組能夠促進(jìn)超負(fù)荷哺乳母鼠泌乳且效果顯著，但缺少對母鼠乳腺組織中PRL水平分析，后續(xù)實驗可通過增加此項來完善OEHP對超負(fù)荷哺乳母鼠泌乳效果及機制的研究。

4 結(jié)論

OEHP對超負(fù)荷哺乳母鼠泌乳的影響與灌胃劑量呈正相關(guān)，高劑量組可顯著增加哺乳期母鼠的泌乳量；OEHP高、中、低劑量組仔鼠體增重與對照組相比分別增加13.62%、12.28%、11.99%，且差異極顯著 (P＜0.01)，OEHP高劑量組與中、低劑量組相比，仔鼠體增重有顯著差異 (P＜0.05)；OEHP各劑量組母鼠乳腺指數(shù)與對照組相比有顯著差異(P＜0.05)；OEHP高、中劑量組哺乳母鼠血清PRL水平與對照組相比差異顯著，且與灌胃劑量呈正相關(guān)。OEHP組與對照組的臟器指數(shù)相比均有不同程度增加，表明OEHP能夠增強哺乳期母鼠的臟器負(fù)荷能力，有利于其哺育仔鼠；在顯微鏡下觀察，OEHP組母鼠乳腺腺泡組織比對照組多且集中，泡腔充盈，導(dǎo)管數(shù)量多，導(dǎo)管腔較粗，腺泡有明顯擴大，表明OEHP能促進(jìn)超負(fù)荷哺乳母鼠乳腺發(fā)育，改善其乳腺結(jié)構(gòu)，提高哺乳母鼠泌乳量，促進(jìn)泌乳。