實(shí)時熒光跨越式滾環(huán)等溫擴(kuò)增熔解曲線法檢測復(fù)合調(diào)味料中的沙門氏菌

陳秀玲，楊倩，郭威，張?zhí)N哲，袁耀武，張偉,,*

(1.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 食品科技學(xué)院，河北 保定 071001；2.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 理工學(xué)院，河北 滄州 061100；3.河北農(nóng)業(yè)大學(xué) 生命科學(xué)學(xué)院，河北 保定 071001)

復(fù)合調(diào)味料經(jīng)加工后可制成液態(tài)、半固態(tài)或固態(tài)產(chǎn)品[1]。隨著經(jīng)濟(jì)的發(fā)展，消費(fèi)者對易烹飪和耗時少的食品的需求不斷增加[2]。復(fù)合調(diào)味料因便捷、高效的特點(diǎn)，在餐飲企業(yè)、食品加工業(yè)及家庭廚房中廣受歡迎[3]。其主要原料包括咸味料、香辛料和鮮味料等，原料種類繁多可能會導(dǎo)致復(fù)合調(diào)味料在生產(chǎn)及加工過程中受沙門氏菌污染[4-8]。沙門氏菌易生存，即使在水分活度較低或含鹽環(huán)境中仍能存活，且隨著水分活度降低，熱阻能力增加，更使其難以滅活[9-12]。因此，復(fù)合調(diào)味料中可能存在沙門氏菌污染的風(fēng)險，對公共健康造成威脅。2018年首次發(fā)布關(guān)于復(fù)合調(diào)味料的國家標(biāo)準(zhǔn)(GB 31644-2018)，要求沙門氏菌不得檢出[13]。

沙門氏菌能導(dǎo)致人及動物患病，是引起食源性疾病的最主要因素之一[14-16]。其感染劑量較低，對于高度易感染人群僅需15～20 CFU/g即可引起感染[17]。人體感染沙門氏菌后可能會出現(xiàn)腹瀉、腹痛等癥狀，嚴(yán)重時甚至?xí)?dǎo)致死亡[18-19]。因此，開發(fā)特異、靈敏、快速的檢測新方法，可及時檢出沙門氏菌，避免食物中毒。

本研究團(tuán)隊(duì)發(fā)明的跨越式滾環(huán)擴(kuò)增技術(shù)(saltatory rolling circle amplification，SRCA)，在BstDNA聚合酶的作用下僅需一對引物即可在恒溫條件下實(shí)現(xiàn)擴(kuò)增[20]，其反應(yīng)原理見圖1，在BstDNA聚合酶作用下擴(kuò)增反應(yīng)會跨越線性DNA兩端缺口，隨后置換先前的延伸產(chǎn)物。先前的擴(kuò)增產(chǎn)物像“盒尺一樣不斷被拉長”，最終產(chǎn)生大量不同長度的雙鏈DNA，該方法已成功用于食源性致病菌的檢測[21-23]。

圖1 SRCA反應(yīng)原理圖Fig.1 The schematic diagram of SRCA reaction

本研究將SRCA技術(shù)與熒光技術(shù)相結(jié)合，擬建立實(shí)時熒光跨越式滾環(huán)等溫擴(kuò)增熔解曲線法檢測復(fù)合調(diào)味料中沙門氏菌的方法，為復(fù)合調(diào)味料的質(zhì)量安全保駕護(hù)航。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 復(fù)合調(diào)味料的選擇

沙拉醬：由江蘇亞克西食品有限公司生產(chǎn)。

1.1.2 試驗(yàn)菌株

本研究共采用39株菌進(jìn)行特異性分析，包括14株沙門氏菌和25株非沙門氏菌(見表1)，所有菌株均在-80 ℃下保存于10%(W/V)甘油液中。

表1 試驗(yàn)菌株Table 1 The strains used in the experiment

1.1.3 主要培養(yǎng)基與試劑

營養(yǎng)肉湯、亞硫酸鉍(BS)瓊脂培養(yǎng)基和木糖賴氨酸脫氧膽鹽(XLD)瓊脂培養(yǎng)基：均購于北京陸橋技術(shù)有限公司。8000 U/mLBstDNA聚合酶：購于美國NEB有限公司；20×EvaGreen熒光染料：購于Biotium公司；SRCA引物：購于北京華大基因有限公司；2×EasyTaqPCR SuperMix：購于北京索萊寶科技公司。

DNA提取試劑盒TIANamp Bacteria Genomic DNA Kit：購于天根生化科技公司；基因克隆T4載體試劑盒、基因克隆試劑盒pMD18-T Vector Cloning Kit：均購于大連寶生物工程公司；凝膠回收試劑盒EasyPure?Quick Gel Extraction Kit、感受態(tài)細(xì)胞Trans1-T1 Phage Resistant Chemically Competent Cell：均購于北京全式金生物技術(shù)公司；沙門氏菌生化鑒定試劑盒：購于北京陸橋技術(shù)公司。

1.1.4 試驗(yàn)儀器與設(shè)備

參考鄭陸的動物訓(xùn)練模型[6] ，運(yùn)動組動物均進(jìn)行一次性力竭離心運(yùn)動(持續(xù)下坡跑)，依次進(jìn)行第I級負(fù)荷(0°，8.2m/min)15min(相當(dāng)于53%VO2max)、第II級負(fù)荷(-5°，15m/min)15min(相當(dāng)于64%VO2max)、第III級負(fù)荷(-10°，19.3m/min)(相當(dāng)于76%VO2max)直至力竭。力竭標(biāo)準(zhǔn)為長時間運(yùn)動后，大鼠趴伏于跑臺上，在驅(qū)趕下也不能進(jìn)行移動。

ABI Step One Plus實(shí)時定量PCR儀 美國應(yīng)用生物系統(tǒng)公司；T-Gradient Thermoblock RF-PCR擴(kuò)增儀 德國Biomedizinische Analytik公司；DYY-10C電泳儀 北京市六一儀器廠；JY04S-3E凝膠成像系統(tǒng) 北京君意電泳設(shè)備公司；無菌均質(zhì)機(jī) 西安比朗生物科技公司；Nanodrop 2000分光光度計(jì) 美國Thermo科技公司；電熱恒溫培養(yǎng)箱 天津市泰斯特儀器公司；三孔電熱恒溫水槽 上海一恒科學(xué)儀器公司。

1.2 方法

1.2.1 菌株培養(yǎng)與DNA提取

將鼠傷寒沙門氏菌從凍存管中接種到營養(yǎng)肉湯中，用活化后傳代培養(yǎng)3次的菌株進(jìn)行選擇性分離，從LB瓊脂平板上挑取鼠傷寒沙門氏菌接種到營養(yǎng)肉湯液體培養(yǎng)基中，在37 ℃下，以220 r/min培養(yǎng)過夜，用于提取沙門氏菌基因組DNA。其他菌株在其適宜的培養(yǎng)基上活化完成后，挑取單菌落在斜面上劃線培養(yǎng)，并保存在4 ℃下，備用。

采用商業(yè)試劑盒提取法進(jìn)行模板DNA的提取，所提DNA模板通過Nanodrop 2000分光光度計(jì)對其濃度和純度進(jìn)行測定，選擇質(zhì)量好的模板于-20 ℃?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 引物設(shè)計(jì)

本研究中選擇沙門氏菌高度保守的invA基因設(shè)計(jì)引物。通過NCBI進(jìn)行序列比對，選擇特異性強(qiáng)、高度保守性的序列，最后確定沙門氏菌序列(GenBank：ALFE01000410.1)。利用DNAMAN和Primer Premier 5.0軟件設(shè)計(jì)引物，由北京華大公司進(jìn)行引物合成。RF-SRCA引物序列見表2。

表2 試驗(yàn)所用引物Table 2 The primers used in the experiment

1.2.3 RF-SRCA及RF-PCR反應(yīng)體系

RF-SRCA熔解曲線方法總反應(yīng)體積為20 μL，包括5 μL dNTPs(終濃度0.625 mmol/L)，3 μL MgSO4(終濃度3.00 mmol/L)，2.5 μL 2×ThermoPol?Reaction Buffer，1 μL上游引物(終0.50 μmol/L)，1 μL下游引物(終0.50 μmol/L)，模板DNA為1 μL(陰性不添加)，8 UBstDNA聚合酶，0.8 μL 20×EvaGreen染料，4.7 μL無菌去離子水。94 ℃下預(yù)變性3 min，冰浴2 min；62 ℃下反應(yīng)60 min，每1 min收集一次熒光信號；反應(yīng)完成后從70 ℃以3.0 ℃/s的速度升溫至95 ℃，繪制成熔解曲線。

為評價RF-SRCA方法，本研究與RF-PCR的靈敏度和檢出限進(jìn)行比較。RF-PCR反應(yīng)體系為：2×EasyTaqPCR SuperMix(11 μL)，沙門氏菌上下游引物各1 μL，DNA模板1 μL(陰性不添加)，EvaGreen染料0.8 μL，加去離子水補(bǔ)至25 μL。RF-PCR的反應(yīng)程序：94 ℃ 預(yù)變性3 min；94 ℃變性30 s，55 ℃退火30 s，72 ℃延伸45 s，共40個循環(huán)；72 ℃再延伸5 min終止反應(yīng)。熔解曲線分析程序：95 ℃加熱15 s，降溫至70 ℃，然后以0.3 ℃/s的速度升溫至95 ℃，生成熔解曲線。

1.2.4 RF-SRCA產(chǎn)物熔解曲線分析

對RF-SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，根據(jù)熔解曲線的熔解峰形及Tm值對擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行分析。陽性結(jié)果為單一尖銳熔解峰且Tm值在穩(wěn)定范圍，陰性無熔解峰。

1.2.5 RF-SRCA產(chǎn)物測序分析

擴(kuò)增試驗(yàn)結(jié)束后，將反應(yīng)產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳試驗(yàn)。紫外燈下選取典型的梯形條帶，按由下至上的順序切膠回收4條目的片段，隨后對RF-SRCA擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行純化測序分析。

1.2.6 RF-SRCA引物特異性分析

為評價RF-SRCA引物的特異性，選取14株沙門氏菌，25株非沙門氏菌(見表1)，以無菌去離子水作為陰性對照，并通過熔解曲線法進(jìn)行引物特異性分析。

1.2.7 靈敏度分析

為評估RF-SRCA熔解曲線方法檢測沙門氏菌的靈敏度，取1 mL上述培養(yǎng)的新鮮菌液，采用試劑盒法提取全基因組DNA。經(jīng)Nanodrop 2000分光光度計(jì)分析，確定沙門氏菌的濃度為60 ng/μL。用無菌去離子水對模板進(jìn)行10倍梯度稀釋，獲得模板濃度范圍為60 ng/μL～0.6 fg/μL。對各個梯度的模板進(jìn)行RF-SRCA反應(yīng)。擴(kuò)增完成后通過熔解曲線法確定其靈敏度，同時與RF-PCR方法的靈敏度做比較。

1.2.8 人工污染沙拉醬中沙門氏菌的檢出限分析

取25 g 不含沙門氏菌的沙拉醬加入到225 mL無菌生理鹽水中均質(zhì)，取1 mL沙門氏菌純菌液加入上述9 mL均質(zhì)液中，吹吸混勻后，用已滅菌的生理鹽水對其進(jìn)行10倍梯度連續(xù)稀釋。根據(jù)平板計(jì)數(shù)法獲得人工污染的沙拉醬中沙門氏菌濃度范圍為4.6×10-1～4.6×108CFU/g。每個稀釋度取1 mL菌懸液用于基因組DNA提取，通過分析，確定RF-SRCA熔解曲線法方法的檢出限，并與RF-PCR方法檢出限進(jìn)行比較。

續(xù) 表

2 結(jié)果分析

2.1 RF-SRCA產(chǎn)物熔解曲線分析

在擴(kuò)增過程中熒光染料EvaGreen會嵌入雙鏈DNA的溝壑中，產(chǎn)生熒光信號。隨著程序溫度升高，DNA雙鏈解開導(dǎo)致熒光染料釋放，熒光信號隨著溫度的變化而發(fā)生改變。不同擴(kuò)增產(chǎn)物根據(jù)產(chǎn)物長度及GC含量不同，會出現(xiàn)不同特征峰。SRCA產(chǎn)物熔解曲線結(jié)果見圖2，沙門氏菌的熔解曲線有單一尖銳熔解峰，無雜峰，表明沙門氏菌擴(kuò)增產(chǎn)物可通過熔解曲線進(jìn)行分析。

圖2 熔解曲線分析Fig.2 The analysis of melting curve

2.2 RF-SRCA產(chǎn)物測序分析

為驗(yàn)證RF-SRCA擴(kuò)增反應(yīng)結(jié)果，對圖3中A擴(kuò)增產(chǎn)物的電泳條帶(1～4)進(jìn)行測序分析。沙門氏菌擴(kuò)增產(chǎn)物測序結(jié)果見圖3中C，通過分析可知，RF-SRCA產(chǎn)物由多條重復(fù)序列串聯(lián)構(gòu)成，且擴(kuò)增產(chǎn)物由長度不同的片段組成，與凝膠電泳梯度條帶相符。因此，可以驗(yàn)證本研究建立的RF-SRCA體系檢測沙門氏菌擴(kuò)增結(jié)果的正確性。

圖3 RF-SRCA反應(yīng)的測序分析Fig.3 The sequencing analysis of RF-SRCA reaction注：圖A為RF-SRCA陽性擴(kuò)增電泳結(jié)果，M為100 bp ladder marker，泳道1為沙門氏菌RF-SRCA陽性擴(kuò)增結(jié)果；圖B為設(shè)計(jì)沙門氏菌FWP及RVP的invA基因序列；圖C為沙門氏菌的陽性擴(kuò)增反應(yīng)產(chǎn)物測序結(jié)果，1～4分別對應(yīng)圖A中從下至上的1～4條帶；圖B，C中橫線標(biāo)記部分為正向引物FWP，波浪線標(biāo)記部分為反向引物RVP的反向互補(bǔ)序列，灰色部分為FWP互補(bǔ)序列上游的一段序列。

2.3 RF-SRCA引物特異性

本研究選擇39株菌株進(jìn)行特異性分析，擴(kuò)增曲線結(jié)果見圖4中A，14株沙門氏菌擴(kuò)增曲線明顯起峰，非沙門氏菌無擴(kuò)增。熔解曲線見圖4中B，14株沙門氏菌在89.20 ℃左右形成單一熔解峰，無引物二聚體和非特異性擴(kuò)增產(chǎn)生，表明設(shè)計(jì)的RF-SRCA引物特異性良好。

圖4 引物特異性分析Fig.4 The specificity analysis of primers注：圖A為RF-SRCA特異性分析擴(kuò)增曲線，NC為陰性對照，1～14為表1中1～14號沙門氏菌，15～39為表1中15～39號非沙門氏菌；圖B為RF-SRCA特異性分析熔解曲線。

2.4 靈敏度結(jié)果分析

以1.2.7中梯度稀釋后的模板進(jìn)行RF-SRCA反應(yīng)，擴(kuò)增完成后對其產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，結(jié)果見圖5。模板DNA濃度范圍為60 ng/μL～6 fg/μL時，沙門氏菌擴(kuò)增曲線(見圖5中A)起峰時間出現(xiàn)梯度遞增，熔解曲線(見圖5中B)為熒光強(qiáng)度遞增的特異性熔解峰。模板DNA濃度為0.6 fg/μL時，擴(kuò)增曲線無起峰現(xiàn)象，熔解曲線無明顯熔解峰，為陰性結(jié)果。因此，RF-SRCA熔解曲線方法檢測沙門氏菌的靈敏度為6 fg/μL。以同樣的模板進(jìn)行RF-PCR反應(yīng)，擴(kuò)增結(jié)果見圖6中A和B。當(dāng)模板DNA濃度范圍為60 ng/μL～600 fg/μL時出現(xiàn)起峰時間梯度的擴(kuò)增曲線，熔解曲線出現(xiàn)梯度特異性熔解峰。當(dāng)模板濃度為60 fg/μL時無擴(kuò)增曲線及特征熔解峰產(chǎn)生。因此，RF-PCR方法檢測沙門氏菌的靈敏度為600 fg/μL。由此可知，RT-SRCA熔解曲線法檢測沙門氏菌的靈敏度比RF-PCR方法靈敏度高100倍。

圖5 RF-SRCA靈敏度分析Fig.5 The sensitivity analysis of RF-SRCA注：圖A為RF-SRCA靈敏度分析擴(kuò)增曲線，NC為陰性對照，1～9模板濃度為60 ng/μL～0.6 fg/μL；圖B為RF-SRCA靈敏度熔解曲線。

圖6 RF-PCR靈敏度分析Fig.6 The sensitivity analysis of RF-PCR注：圖A為RF-PCR靈敏度擴(kuò)增曲線，NC為陰性對照，1～9模板濃度為60 ng/μL～0.6 fg/μL；圖B為RF-PCR靈敏度熔解曲線。

2.5 人工污染沙拉醬中沙門氏菌檢出限分析

分別用RF-SRCA和RF-PCR方法檢測人工污染沙拉醬中的沙門氏菌。RF-SRCA結(jié)果見圖7中A和B，菌液濃度為4.6×100～4.6×108CFU/g，擴(kuò)增曲線起峰時間出現(xiàn)梯度遞增，熔解曲線出現(xiàn)熒光信號梯度遞增的特異性熔解峰，當(dāng)菌液濃度為4.6×10-1CFU/g時無擴(kuò)增曲線和熔解峰產(chǎn)生。因此，人工污染沙拉醬中沙門氏菌的檢出限為4.6×100CFU/g。PCR方法檢測結(jié)果見圖8中A和B，當(dāng)人工污染樣品中菌液濃度為4.6×102～4.6×108CFU/g，出現(xiàn)陽性擴(kuò)增，當(dāng)菌液濃度小于4.6×102CFU/g時未出現(xiàn)陽性擴(kuò)增。因此，RT-PCR方法檢測污染沙拉醬中沙門氏菌的檢出限為4.6×102CFU/g。由此可知，RF-SRCA熔解曲線法比RT-PCR方法檢出限低100倍。

圖7 RF-SRCA檢出限分析Fig.7 The detection limit analysis of RF-SRCA注：圖A為RF-SRCA檢出限擴(kuò)增曲線，NC為陰性對照，1～10菌液濃度為4.6×10-1～4.6×108 CFU/g；圖B為RF-SRCA檢出限熔解曲線。

圖8 RF-PCR檢出限分析Fig.8 The detection limit analysis of RF-PCR注：A為RF-PCR檢出限擴(kuò)增曲線，NC為陰性對照，1～10菌液濃度為4.6×10-1～4.6×108 CFU/g ；B為RF-PCR檢出限熔解曲線。

3 結(jié)論

本研究建立了RF-SRCA熔解曲線法檢測復(fù)合調(diào)味品中沙門氏菌的方法，擴(kuò)增完成后對產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，可排除引物二聚體或非特異產(chǎn)物對檢測結(jié)果的影響，通過峰形和Tm值驗(yàn)證了擴(kuò)增結(jié)果的準(zhǔn)確性。本研究對沙門氏菌的擴(kuò)增產(chǎn)物進(jìn)行熔解曲線分析，結(jié)果顯示熔解峰值穩(wěn)定在一定范圍(Tm值為(89.20±0.08)℃)，無二聚體或非特異產(chǎn)物出現(xiàn)。利用RF-SRCA熔解曲線進(jìn)行特異性檢測，14株沙門氏菌為陽性，25株非沙門氏菌為陰性，結(jié)果表明引物特異性良好。RF-SRCA熔解曲線法檢測沙門氏菌的靈敏度為6 fg/μL，較RF-PCR方法高100倍；人工污染沙拉醬中沙門氏菌的檢出限為4.6×100CFU/g，較RF-PCR方法低100倍。綜上所述，利用RF-SRCA檢測食品中沙門氏菌切實(shí)可行，且該方法具有操作簡便、靈敏、高效、結(jié)果可直接判定等優(yōu)點(diǎn)，在食品安全檢測領(lǐng)域具有良好的應(yīng)用前景。