貝小歌， 陳金軍， 黎倍伶

南方醫(yī)科大學(xué)南方醫(yī)院 肝病中心， 廣州 510515

肝臟結(jié)構(gòu)破壞、系統(tǒng)免疫失調(diào)以及內(nèi)在和外周血流動力學(xué)異常導(dǎo)致肝硬化患者比普通人群容易發(fā)生感染，進(jìn)展為膿毒癥比例更高[1]。據(jù)統(tǒng)計，25%～40%肝硬化住院患者存在細(xì)菌感染[2]，若發(fā)生膿毒癥，肝硬化患者的死亡率將增加4倍[3]。耐藥病原體的出現(xiàn)、對疾病的認(rèn)識不足及診斷延誤是導(dǎo)致膿毒癥高死亡率的常見原因[4]。精準(zhǔn)抗生素治療依賴于致病病原體的早期識別。近年來，宏基因組學(xué)測序技術(shù)(metagenomic next generation sequencing，mNGS)作為分子診斷的新技術(shù)，已成為檢測和鑒別臨床樣本中微生物的有效方法，在膿毒癥的診療中廣泛應(yīng)用[5]。本文將總結(jié)肝硬化相關(guān)膿毒癥的發(fā)病機(jī)制和診療的最新進(jìn)展。

1 肝硬化膿毒癥發(fā)生機(jī)制

1.1 肝硬化免疫缺陷 肝硬化是一種以多方面免疫功能障礙為特征的終末期器質(zhì)性疾病。持續(xù)性免疫系統(tǒng)刺激和進(jìn)行性免疫缺陷會引起肝硬化相關(guān)免疫功能障礙，增加死亡風(fēng)險[6]。肝硬化相關(guān)免疫功能障礙狀態(tài)在先天性和適應(yīng)性免疫障礙方面已被廣泛描述。Lebossé等[7]首次報道了肝硬化患者在循環(huán)系統(tǒng)中表達(dá)免疫抑制性HLA-DR的CD8+T淋巴細(xì)胞亞群的擴(kuò)增，該亞群會增加感染的易感性并與疾病不良預(yù)后相關(guān)。既往研究[8]發(fā)現(xiàn)，慢性肝病患者中MERTK+單核細(xì)胞數(shù)量會增加并將抑制對微生物的先天性免疫應(yīng)答，中性粒細(xì)胞的抑菌活性和殺菌蛋白的釋放在酒精性肝硬化患者中受到嚴(yán)重?fù)p害[9]。肝硬化患者最常見的感染類型是腹腔感染，包括自發(fā)性細(xì)菌性腹膜炎和細(xì)菌性腹水[10]。有研究[11]指出腹水的中性粒細(xì)胞比外周血中性粒細(xì)胞的吞噬和氧化爆發(fā)率分別下降50%和70%。

1.2 腸道菌群移位 肝臟的解剖位置和血液供應(yīng)經(jīng)常使肝臟暴露于腸道來源的細(xì)菌及其產(chǎn)物。肝硬化出現(xiàn)感染與腸道穩(wěn)態(tài)的變化有關(guān)，包括腸道通透性增加、運(yùn)動減少、菌群紊亂和小腸細(xì)菌過度生長[12]。健康人群中，腸腔中的微生物與黏膜相互作用，形成黏液[13]，不僅吸收營養(yǎng)物質(zhì)，還阻隔病原微生物、毒素等有害物質(zhì)的入侵。在肝硬化失代償期，門靜脈高壓會導(dǎo)致腸道水腫，表現(xiàn)為組織缺氧和細(xì)胞間上皮間隙擴(kuò)張[14]。另外，某些炎癥因子(例如TNFα)則可以通過下調(diào)緊密連接蛋白和抗生素凝集素來降低腸屏障的完整性[15]。所以，肝硬化腸道炎癥和門靜脈高壓都使腸道通透性增加，均為菌群移位的基礎(chǔ)。腸道屏障通透性增加會使細(xì)菌片段或病原體相關(guān)分子模式(例如脂多糖、鞭毛蛋白或肽聚糖)移位至血液中，激活免疫系統(tǒng)。另一方面，晚期肝病患者常出現(xiàn)胃腸動力障礙，小腸輸送時間延長與小腸細(xì)菌過度生長有明確的相關(guān)性[16]。酒精、病毒、藥物的使用等各種刺激因素也會加劇腸道菌群紊亂。許多研究[17]已證實(shí)，腸道微生物群豐度及組成在肝硬化病情進(jìn)展過程中發(fā)生明顯變化。

1.3 肝硬化全身性炎癥 肝臟是調(diào)節(jié)免疫系統(tǒng)動態(tài)平衡和防御感染的重要器官，肝臟中30%的細(xì)胞成分(包括內(nèi)皮細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、Kupffer細(xì)胞和膽管上皮細(xì)胞)負(fù)責(zé)器官免疫功能。肝硬化的發(fā)生導(dǎo)致肝臟免疫系統(tǒng)的動態(tài)平衡被打破，其抗感染的功能隨之受到影響。肝硬化患者發(fā)生感染時，其全身性炎癥主要是通過所有先天性和適應(yīng)性免疫細(xì)胞的活化來介導(dǎo)的。內(nèi)皮細(xì)胞是肝損傷早期反應(yīng)的第一道防御屏障，激活的內(nèi)皮細(xì)胞將上調(diào)黏附分子的表達(dá)，誘導(dǎo)有關(guān)促炎反應(yīng)的細(xì)胞因子、趨化因子、細(xì)胞因子的分泌[18]。而Kupffer細(xì)胞是肝臟中第一個與腸道細(xì)菌接觸的免疫細(xì)胞，它能激活肝星狀細(xì)胞，進(jìn)而募集成纖維細(xì)胞并啟動肝纖維化[19]。與健康者相比，肝硬化患者的促炎細(xì)胞因子顯著升高，包括IL-6、IL-8、TNFα等，并且全身性炎癥強(qiáng)度與慢加急性肝衰竭的嚴(yán)重程度相關(guān)[20]。在代償性肝硬化中，損傷的肝細(xì)胞會釋放損傷相關(guān)的分子模式，激活免疫系統(tǒng)，誘發(fā)全身性炎癥，導(dǎo)致肝內(nèi)肝外的器官損傷或衰竭。

總之，即使沒有感染，代償性肝硬化也處于全身持續(xù)炎癥狀態(tài)，失代償性肝硬化則表現(xiàn)出更高的炎癥水平。在失代償期肝硬化中，門靜脈高壓的惡化會導(dǎo)致細(xì)菌移位，使病原體相關(guān)分子模式從腸腔釋放入循環(huán)系統(tǒng)。肝硬化和慢加急性肝衰竭患者由于持續(xù)暴露于損傷相關(guān)的分子模式和病原體相關(guān)分子模式，最終會導(dǎo)致肝硬化相關(guān)免疫功能障礙，即全身性炎癥與免疫抑制共存的狀態(tài)。肝硬化相關(guān)免疫功能障礙狀態(tài)增加了肝硬化患者對感染的敏感性。細(xì)菌移位所致的菌血癥以及細(xì)胞免疫受損與膿毒癥發(fā)生率增加有關(guān)。

2 膿毒癥診療

2.1 膿毒癥的全新定義 膿毒癥-3(sepsis 3.0)的定義為宿主對感染反應(yīng)失調(diào)引起的致命性器官功能障礙。診斷標(biāo)準(zhǔn)為感染引起的序貫性器官功能衰竭評價(sequential organ failure assessment, SOFA)評分≥2分，即“膿毒癥=感染+SOFA≥2”，并衍生出快速SOFA(quick SOFA，qSOFA)評分作為膿毒癥篩查的主要工具[21]。膿毒癥-3的定義強(qiáng)調(diào)了非穩(wěn)態(tài)宿主對感染的反應(yīng)以及對緊急識別的需求，系統(tǒng)的評分標(biāo)準(zhǔn)也便于臨床醫(yī)生對膿毒癥盡早地診斷和治療。

2.2 早期識別和治療膿毒癥的重要性 目前尚無經(jīng)許可用于膿毒癥的藥理學(xué)治療方法，但早期使用有效的抗生素可以降低死亡率[22-23]。研究發(fā)現(xiàn)，抗生素治療延遲12 h的患者院內(nèi)死亡率為28%，而在1 h內(nèi)接受抗生素治療的院內(nèi)死亡率減少為23%[24]，膿毒癥患者每延遲1 h使用抗菌藥物，將增加8%感染性休克的風(fēng)險[25]。因此，“存活膿毒癥”運(yùn)動指南建議在1 h內(nèi)進(jìn)行抗生素治療，而且要在抗生素治療前進(jìn)行血液培養(yǎng)[26]。

最近多個全球性前瞻性研究[27-28]發(fā)現(xiàn)，肝硬化血流感染中耐多藥菌達(dá)三分之一。 耐藥病原體會嚴(yán)重影響到抗生素的治療效果。不恰當(dāng)?shù)目股刂委熞炎C實(shí)與膿毒癥死亡率增加有關(guān)[29]。不合適的抗生素使用將導(dǎo)致膿毒癥患者生存率降低5倍[30]。但也有學(xué)者[31]質(zhì)疑目前抗生素的濫用，并提出應(yīng)該基于病原體的檢測，進(jìn)行精準(zhǔn)的抗生素治療。因此，需要改進(jìn)膿毒癥的診斷手段，從而指導(dǎo)抗生素的使用。

2.3 傳統(tǒng)診斷技術(shù)的局限性 體液樣本的培養(yǎng)技術(shù)目前仍然是診斷感染和膿毒癥的金標(biāo)準(zhǔn)[32]。然而，培養(yǎng)技術(shù)有許多缺點(diǎn)，例如培養(yǎng)周期時間長 (微生物需要6 h～5 d才能培養(yǎng)至可檢測水平，測試抗生素敏感性需要額外24～48 h)、低靈敏度、大樣本量、頻繁重復(fù)檢測、抗生素治療后的假陰性結(jié)果風(fēng)險(30%～63%)增高等[33]。基于培養(yǎng)結(jié)果的診斷過程是非常緩慢的，往往需要實(shí)驗(yàn)室檢查來輔助診斷膿毒癥。目前研究較多的生物學(xué)標(biāo)志物一般與炎癥機(jī)制有關(guān)，它們還能用于評估療效和預(yù)后。通常包括CRP、降鈣素原、前胰蛋白酶、IL-6、脂多糖結(jié)合蛋白、中性粒細(xì)胞CD64等[33]。在SOFA評分的基礎(chǔ)上增加CRP、WBC等生物學(xué)標(biāo)志物的檢測可以提高評估預(yù)后的價值[34]。但是，生物學(xué)標(biāo)志物在非感染性疾病中也會異常升高，無法區(qū)分感染源性和非感染源性炎癥，也就不能可靠地鑒別感染的存在和判斷疾病的嚴(yán)重程度。因此，上述標(biāo)志物未能在臨床上廣泛使用。

2.4 mNGS應(yīng)用于膿毒癥診斷 有效的診斷學(xué)方法應(yīng)能快速而廣泛地檢測病原體，同時能檢測病原體的耐藥性。Palacios等[35]及Xu等[36]分別于2008年、2011年首次運(yùn)用mNGS在臨床病例中檢測出新型沙粒病毒、新型布尼亞病毒，開啟了mNGS技術(shù)在感染中的應(yīng)用。mNGS的出現(xiàn)克服了培養(yǎng)技術(shù)的局限性，廣泛應(yīng)用于遺傳病、腫瘤、感染性疾病?；蚪M學(xué)主要分析體細(xì)胞中的遺傳物質(zhì)，可以通過整個個體基因組的外顯子編碼區(qū)或常見的單核酸多態(tài)性來進(jìn)行測量[37]。其中，運(yùn)用PCR分析16S rRNA的方法已被用于細(xì)菌感染物種/屬水平的鑒定。

與培養(yǎng)技術(shù)相比，mNGS的優(yōu)勢顯而易見。Rozo等[38]觀察了200例膿毒癥患者，結(jié)合培養(yǎng)、血清學(xué)、PCR、mNGS診斷方法，46.5%患者找到了致病原因，證明了基于mNGS的檢測可以對一些培養(yǎng)陰性、缺乏配對血清學(xué)分析的恢復(fù)期血清標(biāo)本，或其他傳統(tǒng)方法無法診斷的患者進(jìn)行診斷。Grumaz等[39]更是發(fā)現(xiàn)mNGS的陽性率比血培養(yǎng)高6倍以上，96%的mNGS診斷結(jié)果為可信的，53%的mNGS診斷結(jié)果將改變抗生素治療方案。Grumaz等[40]還證實(shí)基于cfDNA的mNGS完整工作流程在大約30 h內(nèi)完成，可以在較短時間內(nèi)作出有效治療干預(yù)。因此，mNGS可能為優(yōu)化肝硬化膿毒癥診斷和治療的有效手段。

早期識別和治療對于減少并發(fā)癥和降低死亡率至關(guān)重要?；诮M學(xué)的方法有助于膿毒癥的快速病因診斷，在樣本收集后僅幾個小時就能做出臨床決策。也許在未來可以將膿毒癥管理限制在有效的治療時間窗內(nèi)。然而，受限于昂貴成本、報銷制度未完善、測序結(jié)果判讀的復(fù)雜性、樣本污染和定植菌等影響因素[41]，目前mNGS還不能替代傳統(tǒng)的微生物檢測方法。該技術(shù)如果能突破成本、技術(shù)平臺、敏感度等局限性，未來有望成為臨床一線檢測手段。

3 總結(jié)

肝硬化患者免疫功能缺陷，腸道菌群移位嚴(yán)重，感染后容易發(fā)生膿毒癥。目前膿毒癥的診斷主要基于常規(guī)的臨床實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)，其病原體診斷主要依賴于培養(yǎng)，但培養(yǎng)時間長、陽性率低，限制了膿毒癥患者的早期診斷和治療。mNGS可提高病原體的檢出，可能為優(yōu)化膿毒癥病原體診斷的有效手段。肝硬化膿毒癥未來治療方向可能從以下幾點(diǎn)進(jìn)行干預(yù)：疾病早期，提高對病原體的識別能力；疾病中期，抑制快速發(fā)展的炎癥反應(yīng)；疾病晚期，改善免疫功能并消除免疫抑制狀態(tài)。

利益沖突聲明：所有作者均聲明不存在利益沖突。

作者貢獻(xiàn)聲明：貝小歌負(fù)責(zé)擬定寫作思路，撰寫論文；陳金軍、黎倍伶參與修改論文，指導(dǎo)撰寫文章并最后定稿。