曹 麗，鄂 靜，李 晶，肖紅燕，馬丹娜 ，鄭亞莉

IgA腎病(IgA nephropathy，IgAN)是亞洲人群最常見的原發(fā)性腎小球腎炎，臨床及病理表現(xiàn)多樣，是導(dǎo)致終末期腎病(ESRD)的主要原因之一[1-2]。白細(xì)胞介素-21(IL-21)、白細(xì)胞介素-17(IL-17)是新近發(fā)現(xiàn)的白細(xì)胞介素家族兩個(gè)重要的細(xì)胞和炎癥因子。研究發(fā)現(xiàn)，IL-21、IL-17同處一個(gè)自分泌環(huán)，均受T輔助細(xì)胞17(Th17)分泌和調(diào)控，與IgAN起病及進(jìn)展存在諸多關(guān)聯(lián)[3]。本研究通過觀察IL-21、IL-17在IgAN血清和腎組織中的表達(dá)及與腫瘤壞死因子-α(TNF-α)、轉(zhuǎn)化生長因子-β(TGF-β)、病理分級之間的關(guān)系，來探討IL-21、IL-17與IgAN免疫炎癥活動和疾病進(jìn)展的相關(guān)性，為尋找評估IgAN免疫炎癥活動的生物標(biāo)記物，指導(dǎo)臨床合理治療奠定基礎(chǔ)。

1 資料與方法

1.1 一般資料：IgAN組：納入我院2018年10月-2020年6月經(jīng)腎穿刺活檢首次明確診斷為IgAN的患者73例，其中男性52例，女性21例，平均年齡(37.8±13.1)歲。排除其他急慢性腎炎，合并有糖尿病、高尿酸血癥、高脂血癥等代謝性疾病，合并有自身免疫系統(tǒng)性疾病、感染性疾病、肝病、腫瘤和六個(gè)月內(nèi)曾服用或正在服用糖皮質(zhì)激素或免疫抑制劑的患者。正常對照組：我院泌尿外科既往無任何疾病，因腎外傷行腎切除患者40例，其中男性28例，女性12例，平均年齡(35.6±11.2)歲。2組患者一般情況差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性。

血清及腎組織標(biāo)本：收集2組患者清晨空腹靜脈血，離心后收集血清，分裝保存于-80 ℃冰箱待檢；收集IgAN患者腎穿刺組織標(biāo)本，分別用無菌鹽水紗布包裹，分裝PVC管密封冰盒轉(zhuǎn)運(yùn)至-80℃冰箱保存。其中IgAN組收集到腎組織標(biāo)本17例，正常對照組收集15例。標(biāo)本收集前已征得患者本人及家屬同意，并經(jīng)醫(yī)院倫理委員會審查通過(倫理審批編號：2020-KY-118)。

1.2 方法

1.2.1 實(shí)驗(yàn)試劑:IL-21、IL-17 ELISA檢測試劑盒購自Abcam公司(ab119542、ab100556)，RNA裂解液Trizol試劑購自Invitrogen公司(#15596026)，總RNA提取試劑盒購自Qiagen公司(#DP419)，逆轉(zhuǎn)錄cDNA試劑盒購自Takara公司(#RR036A)，SYBR熒光染料購自Takara公司(#RR820A)。IL-21單克隆抗體購自Abcam公司(ab5978)、IL-17單克隆抗體購自Abcam公司(ab79056)、TNF-α單克隆抗體購自NOVUS公司(NBP1-19532SS)、TGF-β單克隆抗體購自Santa cruz公司(sc-130348)，DAB顯示試劑盒(ZLI-9018)、通用二步法檢測試劑盒(PV-9000)、正常山羊血清(ZLI-9022)、蘇木素染色液(ZLI-9610)均購自北京中杉金橋公司。

1.2.2 ELISA法檢測2組血清IL-21、IL-17的表達(dá):2組備用血清樣本恢復(fù)至室溫，按照ELISA檢測試劑盒的操作步驟，將已制備的標(biāo)準(zhǔn)品工作液和血清待測樣品分別加入已包被抗體的96孔板中，每孔100 μL，且重復(fù)做兩個(gè)復(fù)孔(若樣本濃度高于檢測范圍，需用樣本稀釋液稀釋后取樣)，酶標(biāo)板覆膜，37 ℃孵育90 min；棄去孔內(nèi)液體，甩干后每孔加入生物素化抗體工作液100 μL，酶標(biāo)板覆膜，37 ℃溫育1 h；洗板：甩盡孔內(nèi)液體，每孔加入洗滌液250 μL，浸泡1～2 min，吸去或甩掉酶標(biāo)板內(nèi)液體，在厚的吸水紙上拍干，重復(fù)此洗板步驟3次；加入酶結(jié)合工作液100 μL，加蓋覆膜37 ℃溫育30 min；棄去孔內(nèi)液體，甩干，按照上述洗板步驟洗板5次；加入底物溶液(TMB)90 μL，覆膜后37 ℃避光孵育6 min；加入終止液50 μL終止反應(yīng)；立即用酶標(biāo)儀在波長450 nm處測量各孔的光密度值(OD值)。

1.2.3 熒光定量PCR(RT-PCR)檢測2組冰凍腎組織IL-21、IL-17、TNF-α、TGF-βmRNA 的表達(dá)：將儲存于-80℃冰箱的腎組織標(biāo)本解凍，在研磨碗中加入1 mL RNA裂解液(Trizol)充分研磨組織呈粉末狀，將液體收集至1.5 mL無酶EP管中，加入200 μL氯仿劇烈振蕩，使其充分乳化，室溫靜置5 min，4 ℃ 12 000 rpm離心15 min。出現(xiàn)分層現(xiàn)象后吸取上清至新的EP管中，加入等體積異丙醇，渦旋混勻，靜置5 min，4 ℃ 12 000 rpm離心20 min。棄去上清保留沉淀，加入1 mL 75%乙醇清洗沉淀，7 500 rpm離心5 min，棄上清后放置超凈工作臺中使乙醇揮發(fā)干燥，根據(jù)沉淀量加入適當(dāng)?shù)臏缇兯芙釸NA沉淀。65 ℃金屬浴作用5 min促使沉淀完全溶解，渦旋混勻后上機(jī)檢測RNA的濃度和純度。利用逆轉(zhuǎn)錄試劑盒將RNA逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，置于-80℃冰箱長期保存?zhèn)溆?。以cDNA作為模板，PCR擴(kuò)增檢測，反應(yīng)條件如下：95 ℃ 30 s，95 ℃ 5 s，60 ℃ 30 s，共40個(gè)循環(huán)。利用2-△△Ct方法計(jì)算各基因mRNA的相對表達(dá)量。

1.2.4 免疫組化法(IHC)檢測IgAN組腎組織中IL-21、IL-17、TNF-α的表達(dá)：將石蠟包埋的IgAN患者腎組織標(biāo)本切成厚度為3 μm的切片，放入100%二甲苯溶液Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ中各作用10 min，常規(guī)脫蠟后依次放入梯度酒精中各作用5 min，自來水清洗干凈。微波爐中加入檸檬酸鈉抗原修復(fù)液對切片進(jìn)行抗原修復(fù)處理，PBS沖洗切片后將其放入3% H2O2溶液中室溫作用10 min，阻斷內(nèi)源性過氧化物酶活性。PBS緩沖液清洗3次，滴加山羊血清封閉液室溫封閉1 h，去除非特異性背景染色。棄去封閉液，滴加適量的一抗釋稀液：抗IL-21單克隆抗體(1∶100，Abcam)、抗IL-17單克隆抗體(1∶100，Abcam)、抗TNF-α單克隆抗體(1∶50，NOVUS)，4 ℃孵育過夜。去除一抗后滴加100 μL反應(yīng)增強(qiáng)液，室溫孵育20 min,PBS溶液清洗后滴加增強(qiáng)酶標(biāo)山羊抗小鼠/兔IgG二抗聚合物溶液，室溫孵育2 h，促使抗原抗體發(fā)生特異性結(jié)合。PBS緩沖液清洗,加入適量新鮮配置的DAB顯色液,顯微鏡下觀察染色程度,適時(shí)終止染色反應(yīng)。自來水沖洗后將切片放蘇木素雜色液中作用30 s，鹽酸酒精分化數(shù)秒，自來水沖洗反藍(lán)。梯度酒精脫水、二甲苯透明，晾干后中性樹膠封片。

2 結(jié)果

2.1 2組患者血清中IL-21、IL-17的表達(dá)：與正常對照組(Control組)相比，IgAN組患者血清中IL-21、IL-17表達(dá)水平明顯升高，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。

2.2 2組患者腎組織中IL-21、IL-17、TNF-α、TGF-β的表達(dá):與Control組相比，IgAN組腎組織中IL-21、IL-17、TNF-α、TGF-β mRNA表達(dá)水平均明顯升高(P<0.05)。

2.3 IgAN組腎組織IL-21、IL-17與TNF-α、TGF-β之間的相關(guān)性: IgAN組腎組織中IL-21表達(dá)與TNF-α呈正相關(guān)(r=0.895，P<0.05)；與TGF-β沒有相關(guān)性(r=0.405，P>0.05)。IL-17表達(dá)與TNF-α呈正相關(guān)(r=0.677，P<0.05)，與TGF-β沒有相關(guān)性(r=0.096，P>0.05)，見表1。

2.4 免疫組化法檢測2組腎組織中IL-21、IL-17、TNF-α的表達(dá):對照組IL-21、IL-17、TNF-α表達(dá)呈陰性，IgAN組IL-21、IL-17、TNF-α表達(dá)呈陽性，主要定位于腎小管上皮細(xì)胞，腎小球細(xì)胞中基本不表達(dá)，且IL-21、IL-17、TNF-α隨病理分級加重,表達(dá)強(qiáng)度逐漸升高，見圖1(封三)。

3 討論

CD4+T細(xì)胞亞群的主要效應(yīng)細(xì)胞Th17所介導(dǎo)的免疫炎癥反應(yīng)和慢性腎炎及IgAN的起病及進(jìn)展已廣受關(guān)注[4]。已有研究顯示，Th17及其主要效應(yīng)因子IL-17可通過調(diào)控核轉(zhuǎn)錄因子NF-kB信號通路參與并加劇免疫炎癥反應(yīng),導(dǎo)致腎小球內(nèi)皮細(xì)胞和腎小管上皮細(xì)胞損傷，腎功能惡化[5]。Zeng R等研究也發(fā)現(xiàn)，Th17可分泌和調(diào)控IL-21，IL-21通過JAK-STAT3信號通路誘導(dǎo)腎臟上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞增殖，促進(jìn)炎癥反應(yīng)和腎組織纖維化的形成[6]。同處Th17分泌和調(diào)控的自分泌環(huán)中的IL-21、IL-17一旦激活可相互協(xié)同，相互促進(jìn)，并逆向激活加速Th17增殖和分化，共同參與和促進(jìn)免疫系統(tǒng)疾病的發(fā)生和進(jìn)展[7-8]。我們前期的研究中也發(fā)現(xiàn)[9]，IL-21、IL-17在IgAN患者血清中表達(dá)與蛋白尿、腎功能、血尿酸呈正相關(guān)，提示IL-21、IL-17可能參與IgAN臨床免疫炎癥活動的發(fā)生。本研究顯示，IgAN患者血清及腎組織中IL-21、IL-17、TNF-α、TGF-β表達(dá)均較對照組明顯升高，且IL-21、IL-17表達(dá)和傳統(tǒng)的對炎癥刺激反應(yīng)最快，產(chǎn)生最早的促炎因子TNF-α呈正相關(guān)，與TGF-β沒有相關(guān)性，表明IL-21、IL-17可能和IgAN患者炎癥反應(yīng)關(guān)系密切，尤其可能和IgAN患者的早期炎癥反應(yīng)相關(guān)。

TGF-β是傳統(tǒng)的免疫穩(wěn)態(tài)炎癥調(diào)控因子和纖維化因子[10]，正常生理情況下，當(dāng)機(jī)體存在異常免疫炎癥反應(yīng)時(shí)，激活T調(diào)節(jié)細(xì)胞(Treg)分泌TGF-β發(fā)揮負(fù)向免疫穩(wěn)態(tài)調(diào)控作用，防止免疫反應(yīng)過激。但當(dāng)調(diào)控失效，免疫炎癥反應(yīng)持續(xù)存在時(shí)，TGF-β則反向激活Th17并介導(dǎo)其下游炎癥因子IL-21誘導(dǎo)B淋巴細(xì)胞持續(xù)轉(zhuǎn)分化為IgA型漿母細(xì)胞，促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖分化，導(dǎo)致IgAN腎小管萎縮，腎間質(zhì)纖維化，腎功能惡化[11-12]。以上研究結(jié)果說明TGF-β可能是較為晚期的免疫炎癥調(diào)控因子，當(dāng)免疫炎癥反應(yīng)過激時(shí)最終以纖維化形式終止炎癥反應(yīng)。本研究結(jié)果中IL-21、IL-17的表達(dá)與TNF-α呈正相關(guān)，與TGF-β沒有相關(guān)性，進(jìn)一步通過免疫組化技術(shù)檢查顯示盡管腎小球未發(fā)現(xiàn)IL-21、IL-17、TNF-α的表達(dá)，但在腎小管上皮細(xì)胞均呈陽性表達(dá)，且病理分級越高表達(dá)越強(qiáng)，由此驗(yàn)證了既往研究結(jié)果，也從側(cè)面說明IL-21、IL-17可能是較早期敏感的評估IgAN免疫炎癥活動的生物標(biāo)志物。

IgAN的病理顯示主要為腎小球病變，本研究未發(fā)現(xiàn)IL-21、IL-17、TNF-α在腎小球表達(dá)，可能和其信號通路有關(guān)。在后續(xù)研究中我們將進(jìn)一步擴(kuò)大樣本量，增加研究方法，并結(jié)合其他基礎(chǔ)研究尋找其作用的信號通路深入探討IL-21、IL-17和IgAN免疫炎癥活動的關(guān)系，為后續(xù)尋找評估IgAN炎癥活動生物標(biāo)志物奠定基礎(chǔ)。