食管微生態(tài)與食管疾病

李東航 耿慶

既往研究認(rèn)為，食管沒(méi)有常駐菌的定植，僅為經(jīng)口咽或胃來(lái)源的瞬時(shí)微生物，傳統(tǒng)的培養(yǎng)法對(duì)大多數(shù)微生物菌群未能準(zhǔn)確分離、純化和鑒別，隨著高通量測(cè)序和宏基因組學(xué)的發(fā)展，結(jié)合生物信息學(xué)分析，對(duì)微生態(tài)的研究已達(dá)到基因型分類水平[1]。盡管目前對(duì)腸道微生態(tài)已有了比較深入的研究，但對(duì)于食管微生態(tài)的認(rèn)知仍然有限。作為一個(gè)新興研究領(lǐng)域，本文對(duì)目前關(guān)于正常食管、胃食管反流病(gastroesophageal reflux disease,GERD)和Barrett食管(barrett's esophagus,BE)、食管鱗狀細(xì)胞癌(esophageal squamous cell cancer,ESCC)、食管腺癌(esophageal adenocarcinoma,EAC)、嗜酸性粒細(xì)胞性食管炎(eosinophilic esophagitis,EoE)、食管動(dòng)力障礙等食管微生態(tài)的組成及膳食和藥物對(duì)其影響加以概述，為進(jìn)一步理解食管微生態(tài)與食管疾病的關(guān)系及潛在診療策略提供新思路。

一、正常食管微生態(tài)

目前，對(duì)無(wú)癥狀的正常成人食管微生物菌群進(jìn)行表征的研究尚未有統(tǒng)一的定論，但從這些研究中可以梳理出較為一致的結(jié)果，即正常食管存在以鏈球菌為主的復(fù)雜微生物菌群。Pei等[2]在2004年首次對(duì)正常食管遠(yuǎn)端黏膜行16S rDNA序列分析，發(fā)現(xiàn)其菌群主要包含6大門(mén)類，分別為厚壁菌門(mén)、擬桿菌門(mén)、放線菌門(mén)、變形菌門(mén)、梭桿菌門(mén)和TM7，其中鏈球菌屬檢出率最高，為39%，且菌群組成與口咽類似，但未檢出到口咽包含的螺旋體門(mén)和桿菌門(mén)。Liu等[3]對(duì)正常食管遠(yuǎn)端微生物菌群組成的研究與Pei等結(jié)果一致。通過(guò)對(duì)7名健康成人的食管行分段高通量測(cè)序，我們發(fā)現(xiàn)鏈球菌屬占據(jù)主導(dǎo)地位，食管上、中、下段常見(jiàn)微生物菌群沒(méi)有顯著性差異[4]。與Dong等[5]的研究結(jié)果一致，表明正常食管的微生物菌群組成相對(duì)保守，上、中、下段沒(méi)有明顯的微生態(tài)特異性。通過(guò)應(yīng)用16S rRNA技術(shù)，Yang等[6]在一項(xiàng)大規(guī)模測(cè)序中首次將食管微生物組分為2種類型，I型主要分布于正常食管，以革蘭陽(yáng)性(G+)需氧菌為主，多由厚壁菌門(mén)、鏈球菌屬構(gòu)成；Ⅱ型主要分布于食管炎和BE，以革蘭陰性(G-)厭氧菌為主，多由擬桿菌門(mén)、韋榮球菌屬、普氏菌屬、嗜血桿菌屬等構(gòu)成。這些研究表明，食管存在自身的微生態(tài)，其中鏈球菌屬為優(yōu)勢(shì)菌群。

二、食管微生態(tài)與食管疾病

1.食管微生態(tài)與GERD和BE：GERD相關(guān)性食管炎和Barrett化生主要與從胃內(nèi)慢性反流到食管下部的酸性物質(zhì)(胃酸、少量膽汁)有關(guān)。在長(zhǎng)期酸性環(huán)境的刺激下，導(dǎo)致食管黏膜損傷，從而產(chǎn)生炎性環(huán)境，其微生物的組成隨之發(fā)生變化。Loris等[7]應(yīng)用16S擴(kuò)增序列分析了10例BE病人的化生黏膜和鄰近正常黏膜，結(jié)果發(fā)現(xiàn),前者α多樣性降低，鏈球菌減少，擬桿菌、放線桿菌、普氏菌、韋榮氏菌增多，這種以革蘭陰性菌為主的Ⅱ型菌群在BE中占比增多的現(xiàn)象，印證了Yang等[6]提出的食管菌群分類。除此之外，另外幾項(xiàng)研究報(bào)道了在GERD和BE病人的食管菌群中，與正常對(duì)照組相比，彎曲桿菌屬豐度均顯著增加，并進(jìn)一步表明彎曲桿菌屬會(huì)引起前炎癥因子白細(xì)胞(IL)-18升高，并介導(dǎo)TGF-β1下調(diào)，引起NF-κB、STAT3/SHH-BMP4軸/NOD2等細(xì)胞因子通路激活。其中，部分彎曲桿菌具有硝酸鹽還原作用，并參與到EAC的啟動(dòng)和進(jìn)展中[8-11]。然而，Yu等[12]在一項(xiàng)關(guān)于我國(guó)GERD病人食管菌群的調(diào)查中，僅發(fā)現(xiàn)菌群總體豐度和多樣性的降低，但差異并無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。受地理環(huán)境、飲食習(xí)慣、個(gè)體差異、取樣方式、樣本量限制、測(cè)序技術(shù)等眾多因素的影響，可能導(dǎo)致這一結(jié)果不盡相同。從技術(shù)層面更具信服力的是，Gall等[13]率先采用宏基因組測(cè)序揭示了厚壁菌門(mén)鏈球菌屬和擬桿菌門(mén)普氏菌屬在BE病人中為優(yōu)勢(shì)菌群，且二者比例與腰臀比呈正相關(guān)。厚壁菌門(mén)可以更有效地代謝短鏈脂肪酸、增加機(jī)體供能，促進(jìn)宿主肥胖，而肥胖已被證實(shí)與人體GERD、BE和EAC的發(fā)生有關(guān)，尤其是中心性肥胖[14-17]。多項(xiàng)隨機(jī)試驗(yàn)也表明，減輕肥胖可改善GERD癥狀，減少食管酸性環(huán)境的暴露[18-20]。這表明GERD、BE的發(fā)生伴隨著微生物菌群的改變，尤其是肥胖病人，厚壁菌門(mén)的顯著增加可能是其GERD、BE發(fā)生的危險(xiǎn)因素之一。

盡管上述結(jié)果有所差異，但總體而言，與正常食管相比，GERD、BE病人的食管優(yōu)勢(shì)菌群具有從Ⅰ型向Ⅱ型菌群轉(zhuǎn)變且菌群多樣性減少的趨勢(shì)[6,21]。反流造成酸性環(huán)境，使得更易耐酸的革蘭陰性菌增多，而革蘭陰性菌的外膜脂多糖(LPS)通過(guò)激活TLR4，誘導(dǎo)IL-1β 和 TNF-α產(chǎn)生，進(jìn)而以直接和間接兩種方式激活NF-κB炎性通路，并上調(diào)IL-8的表達(dá)，促使BE的發(fā)生；同時(shí)促進(jìn)誘導(dǎo)型一氧化氮合酶(iNOS)和環(huán)氧合酶2(COX-2)的高表達(dá)，導(dǎo)致食管下端括約肌的松弛并延緩胃內(nèi)容物的排空，促進(jìn)了GERD的發(fā)生[14,21-22]。此外，在BE基礎(chǔ)上，LPS也可通過(guò)TLR4通路激活炎性小體NLRP3，促進(jìn)細(xì)胞凋亡和炎性細(xì)胞因子釋放，塑造局部炎性環(huán)境，在長(zhǎng)期慢性刺激下，細(xì)胞出現(xiàn)異性增生甚至惡變，進(jìn)而進(jìn)展為腫瘤[23]。

此外，一個(gè)有趣的現(xiàn)象是，盡管Hp被公認(rèn)為是胃癌的I類致癌因子，但對(duì)于GERD病人來(lái)說(shuō)，感染了Cag A陽(yáng)性的Hp 卻是一個(gè)保護(hù)因素，其不僅可降低GERD的嚴(yán)重程度，還可阻止食管黏膜的癌變[20,24]。一方面，Hp具有很強(qiáng)的耐酸性，在反流酸性的環(huán)境中占據(jù)優(yōu)勢(shì)地位，影響著其他微生物菌群的生長(zhǎng)和組成，在Hp免疫應(yīng)答的同時(shí)對(duì)其他致病菌具有交叉免疫效應(yīng)；另一方面，Hp引起IL-8、IL-1β、TNF-α的產(chǎn)生，進(jìn)而破壞胃泌酸細(xì)胞，降低胃酸的產(chǎn)生，對(duì)BE、GERD起到保護(hù)作用，減少了細(xì)胞惡變的發(fā)生率[25]。

2.食管微生態(tài)與食管癌：食管癌的發(fā)生是一個(gè)慢性漸進(jìn)過(guò)程，盡管與吸煙飲酒等因素有關(guān)，但這些因素并不能用來(lái)解釋全部食管癌的流行病學(xué)，如同理解結(jié)直腸癌多步驟模型一般，食管癌多從癌前病變的進(jìn)展來(lái)揭示微生物菌群變化。具體而言，探究ESCC的微生態(tài)組成，揭示食管鱗狀細(xì)胞不典型增生(ESD)就尤為重要。同樣，探究從正常食管轉(zhuǎn)變?yōu)镋AC過(guò)程中微生態(tài)的變化就需要從GERD和BE的微生物菌群組成入手。

Yu等[26]的研究發(fā)現(xiàn)，食管微生物的多樣性和ESCC、ESD之間存在負(fù)相關(guān)，Nasrollahzade等[27]進(jìn)一步的研究表明，與對(duì)照組相比，ESD病人胃體微生物群中梭菌屬和丹毒桿菌屬更為富集，這與最近劉曉波等[28]和我們關(guān)于ESCC的研究結(jié)論相一致[4]。McColl等[29]對(duì)慢性萎縮性胃炎病人的研究中發(fā)現(xiàn)，其胃黏膜的微生態(tài)環(huán)境更利于產(chǎn)亞硝基細(xì)菌的生長(zhǎng)，而硝酸鹽的增加又反過(guò)來(lái)促進(jìn)厭氧菌的富集，亞硝酸基的不斷積累促進(jìn)了ESD向ESCC的轉(zhuǎn)變[29-30]。此外，有研究發(fā)現(xiàn)，與口腔疾病特別是牙周炎相關(guān)的福賽斯坦納菌(T.forsythia)和牙齦卟啉單胞菌(P.gingivali)兩種革蘭陰性菌，可選擇性地感染食管鱗癌黏膜和鄰近組織，而不易感染正常對(duì)照組的食管黏膜[31-32]。尤其是P.gingivali，不僅與口腔鱗癌密切相關(guān)，也與ESCC的局部復(fù)發(fā)、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和總體生存率較低顯著相關(guān)[33-34]。其具體機(jī)制為牙齦卟啉單胞菌通過(guò)促進(jìn)Smads/YAP/TAZ/TEA域轉(zhuǎn)錄因子1(TEAD1)復(fù)合體的形成，啟動(dòng)下游靶基因表達(dá)、誘導(dǎo)上皮-間質(zhì)轉(zhuǎn)化(EMT)和維持腫瘤干細(xì)胞特性，增強(qiáng)ESCC細(xì)胞的增殖、遷移、侵襲和轉(zhuǎn)移能力[34]。此外，P.gingivali的感染可激活自噬，誘導(dǎo)IL-6等促炎因子的表達(dá)，通過(guò)STAT3通路，促進(jìn)腫瘤進(jìn)展[35-37]。

有研究發(fā)現(xiàn)，不論是與正常食管，還是食管胃交界處腺癌相比，梭桿菌屬在ESCC中顯示出更高比例的富集，這種富集程度還與腫瘤的分化呈負(fù)相關(guān)[4，28]。其中，已被證實(shí)與結(jié)直腸癌的發(fā)生發(fā)展有著密切聯(lián)系的具核梭桿菌，在ESCC瘤內(nèi)的高豐度也與其不良預(yù)后、對(duì)新輔助化療的不良反應(yīng)密切相關(guān)，有研究表明，具核梭桿菌可作為食管癌潛在的預(yù)后標(biāo)志物[38-40]。具核梭桿菌可通過(guò)激活CCL20等特定趨化因子，從而增強(qiáng)腫瘤侵襲，通過(guò)調(diào)節(jié)ESCC的自噬導(dǎo)致化療耐藥[41-42]。在未來(lái)，對(duì)于具核梭桿菌在ESCC中的具體分子機(jī)制研究、作為不良預(yù)后的微生物標(biāo)志物及針對(duì)性抗生素干預(yù)策略的研究仍需要可靠的數(shù)據(jù)支持和臨床驗(yàn)證。

對(duì)于EAC微生態(tài)的理解，除了上文提到的從GERD和BE層面的探究，在這兩者轉(zhuǎn)變?yōu)橄侔┑倪^(guò)程中伴隨著微生態(tài)變化的揭示也十分重要。與正常食管相比，BE的微生物菌群在組成上表現(xiàn)為鏈球菌的減少，普氏桿菌相應(yīng)增加，而在EAC的微生物菌群組成上，這一改變更為顯著，這也與EAC的發(fā)生通常是GER-GERD-BE-EAC這一漸進(jìn)癌癥模型不謀而合[7，13]。在GER相關(guān)炎癥環(huán)境下，微生物的失調(diào)可誘導(dǎo)化生反應(yīng)的增強(qiáng)，從而進(jìn)展為BE和EAC。相比GERD和BE，EAC更加富集了耐酸菌，如發(fā)酵乳桿菌，乳酸的產(chǎn)生進(jìn)一步改變了食管內(nèi)環(huán)境，產(chǎn)生過(guò)氧化氫等有害物質(zhì)，從而抑制其他細(xì)菌的生長(zhǎng)，使得乳酸桿菌在食管下部成為優(yōu)勢(shì)菌群[43-44]。此外，核酸桿菌在EAC中也發(fā)揮著重要作用，其不僅可以黏附食管上皮，誘導(dǎo)炎性因子激活TLR4、NF-κB 炎性通路，還可抑制T細(xì)胞的免疫殺傷，產(chǎn)生免疫逃逸[7,45]?？傮w來(lái)說(shuō)，EAC發(fā)生過(guò)程中，革蘭陰性菌的增多和共聚集的產(chǎn)生，通過(guò)LPS激活天然免疫反應(yīng)，刺激NF-κB的表達(dá)和炎性細(xì)胞因子的釋放，同時(shí)擬桿菌通過(guò)代謝短鏈脂肪酸與提供CO2等因子協(xié)助其他厭氧菌的生存，維持BE向EAC轉(zhuǎn)化的炎性環(huán)境和促瘤條件[21,46]。這與總體上食管癌微生物菌群的多樣性降低，革蘭陰性厭氧菌逐漸成為優(yōu)勢(shì)菌群的論斷也相一致。然而，從BE到EAC的過(guò)程中，食管微生物菌群組成的改變并不顯著，能夠區(qū)分二者的特定菌群尚未可知，與這二者相關(guān)的菌群是BE或EAC的病因還是結(jié)果，如何在高危人群中尋找可作為早期診斷的生物標(biāo)志物或作為亞型分類依據(jù)的菌屬，及實(shí)施相應(yīng)的微生物干預(yù)策略，仍需大樣本的、質(zhì)量可控的、更具信服力的研究。

3.食管微生態(tài)與EoE：EoE是一種以慢性免疫介導(dǎo)的食管功能障礙和食管黏膜產(chǎn)生嗜酸性粒細(xì)胞為主的炎性疾病[47-48]。有幾項(xiàng)證據(jù)表明，先天免疫系統(tǒng)及微生物模式識(shí)別受體在EoE中發(fā)揮著潛在作用[49-50]。2015年Benitez等[51]對(duì)33例患EoE和35例不患EoE的兒童食管黏膜進(jìn)行了16S rRNA測(cè)序表征，結(jié)果顯示，兩組食管菌群均以鏈球菌為主，進(jìn)一步評(píng)估活動(dòng)期和非活動(dòng)期EoE病人的微生物組成，結(jié)果表明活動(dòng)期EoE顯著富集變形桿菌，而非活動(dòng)期EoE和不患EoE的食管微生物組成沒(méi)有顯著差異。當(dāng)然，這一研究存在著局限：取樣時(shí)68例病人中66例正接受質(zhì)子泵抑制劑的治療，因此無(wú)法排除非EoE介導(dǎo)的食管炎的影響。另外一項(xiàng)內(nèi)窺鏡下調(diào)查EoE病人食管微生物群的前瞻性研究顯示，與正常對(duì)照相比，EoE病人的總細(xì)菌負(fù)荷增加，嗜血桿菌豐度顯著提升[52]。Benitez等[53]采用16SrRNA基因測(cè)序分別對(duì)活動(dòng)期和非活動(dòng)期EoE病人及非EoE對(duì)照組的食管微生物進(jìn)行比較分析發(fā)現(xiàn)，鏈球菌屬、普雷沃菌屬和擬普雷沃菌屬在三組食管活檢組織中豐度較高，這種以鏈球菌屬為主革蘭陽(yáng)性菌的高豐度，與之前在沒(méi)有食管炎的成人和兒童的研究中結(jié)論一致[51,54-55]。與非EoE對(duì)照組相比，嗜血桿菌屬的豐度從EoE的非活動(dòng)期到活動(dòng)期，呈現(xiàn)逐步增加的趨勢(shì)，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義[51,53]。此外，一項(xiàng)薈萃分析評(píng)估了11項(xiàng)的大樣本觀察性研究結(jié)果顯示，與未暴露組相比，在Hp暴露下EoE的發(fā)生率降低了37%，食道嗜酸性粒細(xì)胞增多癥的幾率降低了38%，這可能與Hp誘導(dǎo)的免疫調(diào)節(jié)有關(guān)[56]。然而，前瞻性研究中很少得到Hp與EoE具有顯著相關(guān)的結(jié)論，因此，Hp的作用仍需更多的證據(jù)。

總之，這些研究表明，EoE病人的食管微生物組成不同于正常食管黏膜微生態(tài)。而細(xì)菌負(fù)荷的增加可能并不是EoE直接影響的結(jié)果，因?yàn)殡S著防御素的釋放，嗜酸性粒細(xì)胞具有細(xì)胞外DNA陷阱和抗微生物特性，局部環(huán)境的變化和菌群之間協(xié)作互存可能導(dǎo)致了細(xì)菌負(fù)荷的增加[57-58]。與GERD類似，EoE的微生物菌群顯示出從革蘭陽(yáng)性菌向革蘭陰性菌轉(zhuǎn)變的趨勢(shì)，考慮到革蘭陰性菌在GERD中作用，我們推測(cè)嗜血桿菌和變形桿菌在EoE的嗜酸性粒細(xì)胞增多中發(fā)揮著潛在作用[6]。

4.食管微生態(tài)與食管動(dòng)力障礙：目前還沒(méi)有關(guān)于食管微生物群在食管動(dòng)力障礙(如賁門(mén)失弛緩癥)的詳細(xì)報(bào)道，僅有少數(shù)研究提及了Chagas病和ESCC中伴有食管動(dòng)力障礙時(shí)的微生物群組成[59-61]。一項(xiàng)關(guān)于繼發(fā)于Chagas病的巨食管癥病人的前瞻性研究，將食管抽吸物進(jìn)行培養(yǎng)發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照組病人相比，巨食管癥病人具有更高濃度的細(xì)菌，尤其是硝酸鹽還原相關(guān)的細(xì)菌更為顯著[62]。此外的幾項(xiàng)研究發(fā)現(xiàn)，賁門(mén)失弛緩癥病人的ESCC發(fā)病率增加[43,61]。這種潛在的原因可能是食管腔內(nèi)長(zhǎng)期慢性炎癥所致，食管下端括約肌功能失調(diào)改變了微生物菌群的生存環(huán)境。食管微生態(tài)與食管運(yùn)動(dòng)障礙之間相互作用的探究，對(duì)于揭示微生物群如何影響食管運(yùn)動(dòng)功能仍具有較高探索價(jià)值。

三、膳食與食管微生態(tài)

關(guān)于膳食對(duì)食管微生態(tài)直接影響的報(bào)道有限。一項(xiàng)對(duì)47例BE病人經(jīng)內(nèi)鏡下活檢行高通量測(cè)序的回顧性研究發(fā)現(xiàn)，膳食纖維攝入增加與厚壁菌門(mén)豐度升高和變形菌門(mén)比例減少有關(guān)，而脂肪膳食對(duì)食管菌群的組成沒(méi)有顯著影響[63]。然而，一項(xiàng)動(dòng)物模型顯示，高脂肪乳制品飲食較低脂肪組的動(dòng)物有更高的BE和Barrette發(fā)育不良的發(fā)生率，并指出脂肪消耗過(guò)程中，膽汁內(nèi)?；撬峤Y(jié)合物濃度的增加可促進(jìn)BE的發(fā)展[64]，高脂飲食可加速異型增生，并與食管組織中中性粒細(xì)胞和自然殺傷細(xì)胞比率增加有關(guān)[65]。另外，一項(xiàng)基于攝入食物頻率問(wèn)卷的研究顯示，飲食中高攝入β-胡羅卜素與Barrette發(fā)育不良的風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)，高抗氧化指數(shù)得分與EAC風(fēng)險(xiǎn)呈負(fù)相關(guān)[66]。攝入大量精制糖等食物也會(huì)導(dǎo)致食管微生物群的改變，增加短鏈脂肪酸和膽汁酸的產(chǎn)生[67]。鑒于類似于腸道的能量代謝及食管腸上皮化生過(guò)程，影響這些代謝產(chǎn)物的食管微生物群可能也參與其中。

四、藥物與食管微生態(tài)

抗生素、PPI、非甾體抗炎藥和益生菌等藥物也可影響食管微生物群組成，進(jìn)而使機(jī)會(huì)致病菌或病原菌參與到食管疾病的發(fā)生發(fā)展中[3,68-69]。Sawada等[70]采用末端限制性片段長(zhǎng)度多態(tài)性分析法，探究了EAC根治術(shù)后抗生素(青霉素、鏈霉素)對(duì)大鼠食管微生物組的影響，結(jié)果顯示與對(duì)照組比較，抗生素組大鼠食管乳酸桿菌相對(duì)豐度降低，而梭狀桿菌豐度顯著升高。由于PPI的廣泛使用，在早期食管微生態(tài)的研究中，多數(shù)并未排除PPI這一變量的影響。在Amir等[71]的研究中，調(diào)查了暴露于PPI前后的食管微生物菌群變化，在經(jīng)過(guò)8周的蘭索拉唑每天2次治療后行食管活檢，結(jié)果表明，在PPI暴露后，叢毛單胞菌科減少，而多種梭狀芽孢桿菌增加。Deshpande等[72]采用兩種測(cè)序方法對(duì)食管微生物組行代謝組學(xué)分析，發(fā)現(xiàn)PPI可使抗生素合成和產(chǎn)乙酸鹽途徑增加，進(jìn)而影響食管菌群的生存環(huán)境。此外，有研究指出，在包括鏈球菌等細(xì)菌或真菌中，PPI可直接與三磷酸腺甙酶(ATP-ases)家族結(jié)合，改善機(jī)體能量代謝[72]。PPI對(duì)食管微生態(tài)的影響是多種機(jī)制的作用結(jié)果，盡管這些機(jī)制尚不清楚，但鑒于PPI的長(zhǎng)期廣泛使用，這種影響機(jī)制仍值得深入探索。毫無(wú)疑問(wèn)，最近興起火熱的微生態(tài)制劑，也會(huì)不同程度地影響到食管微生態(tài)的組成，這種綜合效應(yīng)仍需進(jìn)一步地評(píng)估。

五、展望

目前正常食管微生物菌群的組成已基本清晰，即由鏈球菌屬為主導(dǎo)的復(fù)雜菌群組成，但涉及到地理環(huán)境、種族差異、飲食習(xí)慣等因素仍不能忽視。食管微生物菌群與食管疾病之間存在密切關(guān)聯(lián)，但這種具體的因果關(guān)系、特定致病菌、潛在機(jī)制等仍需要大樣本的宏基因組學(xué)分析及實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證，進(jìn)而尋求疾病的微生態(tài)靶點(diǎn)，更為精準(zhǔn)地實(shí)施微生態(tài)靶向治療。