耿彥梅，高 晗，李雪利，田 方，孫福仁，曾永禎，李軍山,2

(1.神威藥業(yè)集團(tuán)有限公司，河北石家莊 051430；2.楚雄神威施普瑞藥物研究有限公司，云南楚雄675000)

枳實(shí)為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種或甜橙CitrussinensisOsbeck的干燥幼果，于5—6月收集自落的果實(shí)，除去雜質(zhì)，自中部橫切為兩半，曬干或低溫干燥(較小者直接曬干或低溫干燥)而成。枳實(shí)為常用中藥，其性苦、辛、酸、溫，歸脾、胃經(jīng)，能夠破氣消積、化痰散痞，用于治療積滯內(nèi)停、痞滿脹痛、大便不通、胃下垂、脫肛、子宮脫垂等癥[1]。

枳實(shí)主要成分為黃酮、生物堿、揮發(fā)油等，其具體成分隨原植物、部位而異。酸橙果實(shí)含橙皮苷(hesperidin)、新橙皮苷(neohesperidin)、柚皮苷(naringin)、辛弗林(synephrine)、N-甲基酪胺(N-thyltyramine)等；未成熟果皮含柚皮苷、野漆樹苷(rhoifolin)、忍冬苷(lonicerin)、新橙皮苷等；在果實(shí)成熟時(shí)新橙皮苷消失[2-6]。

枳實(shí)具有廣泛的藥理作用，如維生素P樣作用、抗炎、抗菌、抗病毒、抗癌、抗?jié)?、抑制毛?xì)血管脆性等；對(duì)心血管系統(tǒng)、胃腸平滑肌、子宮、泌尿系統(tǒng)、中樞系統(tǒng)等均有一定的藥理作用[7-10]。

日本于20世紀(jì)60年代開始“漢方藥”顆粒研究，80年代納入國民健康保險(xiǎn)范圍；韓國20世紀(jì)90年代初開始生產(chǎn)中藥顆粒；在新加坡等國，配方顆粒已基本取代中藥飲片。中國配方顆粒發(fā)展正在逐步規(guī)范化，2019年11月，國家藥監(jiān)局綜合司公開征求《中藥配方顆粒質(zhì)量控制與標(biāo)準(zhǔn)制定技術(shù)要求(征求意見稿)》意見，這對(duì)促進(jìn)中藥配方顆粒標(biāo)準(zhǔn)統(tǒng)一、規(guī)范中藥配方顆粒生產(chǎn)、推進(jìn)中醫(yī)藥現(xiàn)代化進(jìn)程具有重要意義。隨著中藥配方顆粒研究的日益深入，中藥配方顆粒必將成為中藥發(fā)展的重要組成部分。

中藥配方顆粒是由單味中藥飲片經(jīng)水提、分離、濃縮、干燥、制粒而成的顆粒，在中醫(yī)理論指導(dǎo)下，按照中醫(yī)臨床處方調(diào)配，供患者沖服使用，其臨床效應(yīng)應(yīng)當(dāng)和相應(yīng)飲片保持一致。中藥飲片是中醫(yī)藥發(fā)揮臨床療效的重要藥用物質(zhì)，其安全性、有效性已得到廣泛認(rèn)可。為使中藥配方顆粒能夠承載中藥飲片的安全性、有效性，需要以標(biāo)準(zhǔn)湯劑為橋接，該標(biāo)準(zhǔn)湯劑為衡量中藥配方顆粒是否與臨床湯劑基本一致的物質(zhì)基準(zhǔn)[11]。

截至目前，對(duì)枳實(shí)飲片的化學(xué)成分及特征圖譜的研究已經(jīng)比較透徹，但對(duì)枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的研究寥寥無幾[12-15]。筆者選擇了15批不同產(chǎn)地枳實(shí)飲片制成的標(biāo)準(zhǔn)湯劑，建立了枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑中辛弗林含量、特征圖譜測(cè)定方法，對(duì)它們的制備、出膏率、主成分含量及含量轉(zhuǎn)移率、特征圖譜等進(jìn)行研究，以期為枳實(shí)配方顆粒的質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)研究提供基礎(chǔ)依據(jù)，同時(shí)為批量生產(chǎn)優(yōu)質(zhì)、穩(wěn)定枳實(shí)配方顆粒提供產(chǎn)地參考。

1 主要儀器與材料

1.1 儀 器

LC-20A型高效液相色譜儀，InertSustain AQ-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)(日本島津公司提供)；分析天平(0.000 01 g，德國賽多利斯公司提供)；JM-A5002電子天平(0.01 g，余姚市紀(jì)銘稱重校驗(yàn)設(shè)備有限公司提供)；水循環(huán)真空泵(上海申生科技有限公司提供)；DHG-9140A熱風(fēng)循環(huán)鼓風(fēng)干燥箱(上海精宏實(shí)驗(yàn)設(shè)備有限公司、太倉精宏儀器設(shè)備有限公司提供)；KH3200E型超聲波清洗器(昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司提供)。

1.2 試 劑

辛弗林對(duì)照品，批號(hào)為110727-201809，純度為99.5%；橙皮苷對(duì)照品，批號(hào)為110721-201818，純度為96.2%；新橙皮苷對(duì)照品，批號(hào)為111857-201804，純度為99.4%，均由中國食品藥品檢定研究院提供。甲醇、乙醇，均為分析純，由天津市科密歐化學(xué)試劑有限公司提供；水為自制純化水；磷酸為HPLC級(jí)，由美國ACS恩科化學(xué)公司提供。

1.3 飲 片

15批枳實(shí)飲片經(jīng)原河北省藥品檢驗(yàn)研究院孫寶惠主任鑒定為蕓香科植物酸橙CitrusaurantiumL.及其栽培變種的干燥幼果。樣品詳細(xì)信息見表1。

表1 枳實(shí)飲片產(chǎn)地批號(hào)信息Tab.1 Origin and batch number information of Aurantii Fructus Immaturus decoction pieces

2 實(shí)驗(yàn)部分

2.1 標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

2.1.1 制備方法

1)煎煮 取枳實(shí)飲片50 g于煎藥壺中，第1次加飲片量8倍飲用水，浸泡30 min，加熱煎煮30 min，藥液趁熱過300目(48 μm，下同)濾布，第2次加飲片量6倍飲用水，煎煮20 min，藥液趁熱過300目濾布，合并2次煎液。

2)濃縮 將提取液放入旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀中低溫(65 ℃)濃縮至生藥量與藥液體積比為1∶3。

3)干燥 采用冷凍干燥，將濃縮液搖勻倒入不銹鋼盤中(注意確保盤內(nèi)濃縮液薄厚一致，一般不超過0.5 mm)，放于冷凍干燥機(jī)內(nèi)，進(jìn)行干燥，即得枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.1.2 制備工藝驗(yàn)證

取枳實(shí)飲片(批號(hào)20010816)6份，每份50 g，按照2.1.1進(jìn)行標(biāo)準(zhǔn)湯劑制備，測(cè)定出膏率及辛弗林含量，驗(yàn)證信息見表2。

表2 工藝驗(yàn)證信息Tab.2 Information of process validation

由表2可看出，6批飲片出膏率及辛弗林含量RSD均小于10%，說明此工藝穩(wěn)定。

2.1.3 15批枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的制備

分別取15批不同產(chǎn)地、不同批號(hào)的枳實(shí)飲片按2.1.1項(xiàng)下的制備方法進(jìn)行制備，即得15批枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑。

2.2 辛弗林的色譜分析

實(shí)驗(yàn)選用InertSustain AQ-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm，5.0 μm)，流動(dòng)相為甲醇-磷酸二氫鉀溶液(體積比為50∶50，取磷酸二氫鉀0.6 g，十二烷基磺酸鈉1.0 g，冰醋酸1 mL，加水溶解并稀釋至1 000 mL)等度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長為225 nm，柱溫為28 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，進(jìn)行色譜分析。

2.2.1 對(duì)照品溶液的制備

取辛弗林對(duì)照品適量，精密稱定。加純化水制成每1 mL含30 μg的溶液，即得(10 ℃以下保存)。

2.2.2 供試品溶液的制備

取枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑膏粉適量，研細(xì)，取約0.2 g，精密稱定。置具塞錐形瓶中，精密加入95%乙醇25 mL，稱定質(zhì)量，超聲20 min，放冷，再稱定質(zhì)量，用95%乙醇補(bǔ)足減失的質(zhì)量，搖勻，過0.45 μm濾膜，即得。

2.2.3 方法學(xué)考察

1)專屬性考察

使用空白溶劑作為陰性對(duì)照，通過對(duì)照品溶液指認(rèn)枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑樣品中辛弗林峰(參照峰)，進(jìn)行專屬性試驗(yàn)，見圖1。在辛弗林出峰位置處，陰性樣品未見有明顯干擾，說明本方法的專屬性良好。

圖1 枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的色譜圖Fig.1 Chromatogram of Aurantii Fructus Immaturus standard decoction

2)線性考察

精密稱定辛弗林對(duì)照品7.52 mg，置250 mL容量瓶中，加純化水稀釋至刻度，搖勻，備用。分別吸取上述儲(chǔ)備液1，2，4，6，8，10 mL于20 mL容量瓶中，加純化水稀釋至刻度，搖勻，備用。分別吸取以上各對(duì)照品溶液10 μL注入液相色譜儀，按上述色譜條件測(cè)定峰面積，以辛弗林含量為橫坐標(biāo)，峰面積積分值為縱坐標(biāo)，繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線(見圖2)，回歸方程為y=453x+317.2，R=0.999 99，表明辛弗林在0.015 0～0.150 4 mg/g范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖2 辛弗林的線性關(guān)系考察Fig.2 Linear investigation of Synephrine

3)準(zhǔn)確度考察

精密稱取枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑(批號(hào)為20010816，質(zhì)量分?jǐn)?shù)為11.33 mg/g)6份，每份約0.1 g，精密加入一定量的辛弗林對(duì)照品溶液，按上述供試品溶液制備方法制備，精密吸取供試品溶液10 μL，以上述色譜條件測(cè)定，結(jié)果辛弗林的平均回收率為100.20%(n=6)。

4)精密度考察

取枳實(shí)膏粉按2.2.2項(xiàng)下制備方法制備供試品1份，重復(fù)測(cè)定6次，得到枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑中辛弗林的平均含量為2.42 mg/g(質(zhì)量分?jǐn)?shù)，下同)，RSD為0.63%，表明儀器符合精密度要求。

5)重復(fù)性考察

取枳實(shí)膏粉按2.2.2項(xiàng)下制備方法平行制備供試樣品6份，測(cè)定枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑中辛弗林的平均含量，結(jié)果為2.43 mg/g，RSD為1.26%，符合2015年版《中華人民共和國藥典》的規(guī)定(≤1.5%)。

6)穩(wěn)定性考察

取2.2.2項(xiàng)下供試品分別在0，3，6，9，12 h測(cè)定辛弗林的含量，枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑膏粉供試品在12 h內(nèi)的辛弗林平均含量為2.40 mg/g，RSD為1.21%，表明供試品在12 h內(nèi)穩(wěn)定。

2.3 特征圖譜的測(cè)定

實(shí)驗(yàn)選用InertSustain AQ-C18色譜柱(4.6 mm×250 mm,5.0 μm)，流動(dòng)相為甲醇(A)-磷酸二氫鉀溶液(B)(取磷酸二氫鉀0.6 g，十二烷基磺酸鈉1.0 g，冰醋酸1 mL，加水溶解并稀釋至1 000 mL)梯度洗脫，流速為1.0 mL/min，檢測(cè)波長為225 nm，柱溫為28 ℃，進(jìn)樣量為10 μL，測(cè)定特征圖譜。梯度洗脫程序詳見表3。

表3 梯度洗脫程序Tab.3 Gradient elution procedure

2.3.1 對(duì)照品溶液制備

取辛弗林對(duì)照品適量，精密稱定，加水制成每1 mL含30 μg的溶液，即得；取橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含40 μg的溶液，即得；取新橙皮苷對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL含柚皮苷和新橙皮苷80 μg的溶液，即得。

2.3.2 供試品溶液制備

同2.2.2。

2.3.3 方法學(xué)考察

1)精密度考察

取枳實(shí)膏粉按2.2.2項(xiàng)下制備方法制備供試品1份，重復(fù)測(cè)定6次，6次測(cè)定枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑中各峰的RSD均小于1.0%，說明此方法精密度良好，儀器符合精密度要求。

2)重復(fù)性考察

取枳實(shí)膏粉按2.2.2項(xiàng)下制備方法平行制備供試樣品6份，6次測(cè)定枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑中各峰的RSD均小于1.0%，說明此方法重復(fù)性良好，符合2015年版《中華人民共和國藥典》的規(guī)定(≤1.5%)。

3)穩(wěn)定性考察

取2.2.2項(xiàng)下供試品分別在0，3，6，9，12 h測(cè)定特征圖譜，結(jié)果顯示，在12 h內(nèi)各峰的RSD均小于1.0%，表明供試品在12 h內(nèi)較穩(wěn)定。

3 結(jié)果及分析

3.1 15批枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑辛弗林含量測(cè)定

取15批枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑膏粉，分別按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.2項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。結(jié)果如表4所示。

表4 15批標(biāo)準(zhǔn)湯劑中辛弗林含量及含量轉(zhuǎn)移率(n=2)Tab.4 Synephrine content and content transfer rate in 15 batches of standard decoction(n=2)

3.2 辛弗林含量及含量轉(zhuǎn)移率結(jié)果分析

15批枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率均值為15.14%，RSD為19.31%，表明不同產(chǎn)地枳實(shí)的出膏率差異較大，范圍為10.50%～19.91%；辛弗林含量均值為9.07 mg/g，RSD為33.05%，表明不同產(chǎn)地枳實(shí)的辛弗林含量差異較大，范圍為5.92～15.21 mg/g；辛弗林含量的轉(zhuǎn)移率均值為22.65%，RSD為45.92%，表明不同產(chǎn)地枳實(shí)間的辛弗林含量轉(zhuǎn)移率差異較大，范圍為10.24%～47.70%，辛弗林含量轉(zhuǎn)移率差異較大主要是因?yàn)椴煌a(chǎn)地枳實(shí)的出膏率及含量差異較大引起的。

綜合出膏率、辛弗林含量及含量轉(zhuǎn)移率，可知湖南的永州、常德，江西的井岡山、景德鎮(zhèn)等地的枳實(shí)質(zhì)量較佳。

3.3 15批枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜測(cè)定

取15批枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑膏粉，分別按2.2.2項(xiàng)下方法制備供試品溶液，按2.3項(xiàng)下色譜條件進(jìn)行測(cè)定，結(jié)果如圖3、圖4所示。

圖3 枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC對(duì)照?qǐng)D譜Fig.3 HPLC control of Aurantii Fructus Immaturus standard decoction

圖4 15批枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑HPLC圖譜Fig.4 HPLC spectrum of 15 batches of Aurantii Fructus Immaturus standard decoction

3.4 特征圖譜結(jié)果分析

比對(duì)15批枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑膏粉特征圖譜，共得到7個(gè)共有峰，其相對(duì)峰面積見表5，可以看出峰面積的RSD差異較大，表明不同產(chǎn)地、不同批次枳實(shí)間的化學(xué)成分含量存在較大差異；而相對(duì)保留時(shí)間(見表6)的RSD都比較小，表明出峰時(shí)間比較穩(wěn)定；特征圖譜相似度的比對(duì)結(jié)果見表7。與對(duì)照譜圖比對(duì)，相似度為0.655～0.936，總體來說不同產(chǎn)地、不同批次間枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑膏粉的特征圖譜與對(duì)照特征圖譜相似度欠佳，表明枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑各產(chǎn)地、各批次間的化學(xué)成分種類及含量差異較大。

表5 15批枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜相對(duì)峰面積Tab.5 Relative peak areas of characteristic spectrum of 15 batches of Aurantii Fructus Immaturus standard decoction

表6 15批枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜相對(duì)保留時(shí)間Tab.6 Relative retention time of characteristic spectrum of 15 batches of Aurantii Fructus Immaturus standard decoction

表7 15批枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑特征圖譜相似度Tab.7 Similarities of characteristic spectrum of 15 batches of Aurantii Fructus Immaturus standard decoction

4 結(jié) 語

本研究通過選取具有代表性的15批不同產(chǎn)地的枳實(shí)飲片制成的標(biāo)準(zhǔn)湯劑，建立了枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑中辛弗林含量、特征圖譜的測(cè)定方法，此方法已通過方法學(xué)驗(yàn)證，具有較高的穩(wěn)定性，可用于枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的質(zhì)量研究。

15批枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑出膏率均值為15.14%，范圍為10.50%～19.91%；辛弗林含量均值為9.07 mg/g，范圍為5.92～15.21 mg/g；辛弗林含量的轉(zhuǎn)移率均值為22.65%，范圍為10.24%～47.70%。綜合出膏率、辛弗林含量及含量轉(zhuǎn)移率，可知湖南永州、常德，江西井岡山、景德鎮(zhèn)等地的枳實(shí)質(zhì)量較佳。

本次研究選取4個(gè)產(chǎn)地的枳實(shí)藥材為研究對(duì)象，其中江西為道地產(chǎn)區(qū)，其余產(chǎn)地為主產(chǎn)區(qū)。標(biāo)準(zhǔn)湯劑研究發(fā)現(xiàn)，枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑含量、含量轉(zhuǎn)移率的RSD分別為33.05%，45.92%，表明不同產(chǎn)地間枳實(shí)中的辛弗林含量差異較大，需要收集更多批次樣品進(jìn)行研究，以確保枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑更具代表性、適用性。今后將會(huì)收集更多主產(chǎn)區(qū)不同批次的樣品，進(jìn)一步補(bǔ)充完善枳實(shí)標(biāo)準(zhǔn)湯劑的相關(guān)數(shù)據(jù)。