王秋珍 鄧自騰 劉雪連 閆 雪 宋維平 韓德平 馬云飛*

(1.中國農(nóng)業(yè)大學(xué) 動物醫(yī)學(xué)院，北京 100193；2.北京大北農(nóng)科技集團(tuán)股份有限公司 飼用微生物工程國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，北京 100192)

雞白痢是一種由沙門菌感染引發(fā)的危害較大的傳染性疾病。沙門菌為革蘭氏陰性菌，可感染多種動物，在感染過程中依靠其毒力島和黏附素對腸上皮進(jìn)行黏附和侵襲，進(jìn)入腸道進(jìn)一步造成全身性的感染[1]。通過在日糧中添加抗生素可防治雞白痢，但隨著飼料中抗生素的禁用，益生菌逐漸成為一種飼用抗生素替代品。益生菌是一種能保持宿主腸道健康的微生態(tài)制劑，可以通過其代謝作用調(diào)節(jié)腸道菌群，維持腸道菌群的穩(wěn)態(tài)，提升優(yōu)勢菌群的比例，進(jìn)而提高動物體的免疫力。干酪乳桿菌(Lactobacilluscasei)作為重要的益生菌，具有生長速度快、耐酸耐膽鹽能力強(qiáng)、口服后能在消化道大量存活等特點(diǎn)。干酪乳桿菌不僅能通過TLR4信號通路調(diào)節(jié)腸道的免疫炎癥和氧化應(yīng)激，還對腸道內(nèi)多種病原菌如空腸彎曲菌、腸炎沙門菌和腸出血性大腸桿菌等有較強(qiáng)的抗菌活性[2-3]。在日糧中添加干酪乳桿菌代田株可提高斷奶仔豬的生長性能和抗氧化功能，具有替代抗生素的功效[4]。干酪乳桿菌合成的生物硒納米顆粒通過Nrf 2介導(dǎo)的信號通路保護(hù)小鼠腸道屏障功能[5]。干酪乳桿菌通過抑制NF-κB的活化，降低IL-1β和TNF-αmRNA的表達(dá)，抑制小鼠腸炎的發(fā)展過程[6]。以上研究結(jié)果表明干酪乳桿菌能增強(qiáng)機(jī)體腸道免疫并抑制腸道炎癥的發(fā)生發(fā)展過程。小腸不僅是雛雞營養(yǎng)物質(zhì)消化吸收的重要器官也是機(jī)體抵御外來病原入侵的重要防線。本實(shí)驗(yàn)室前期研究表明干酪乳桿菌能夠保護(hù)腹瀉型大鼠回腸和斷奶仔豬十二指腸的健康[7-8]，但干酪乳桿菌對感染沙門菌雛雞空腸炎癥的作用機(jī)制仍不清楚。本研究以1日齡雛雞作為研究對象，采用HE染色和ELISA法，檢測正常和沙門菌攻毒后的雛雞在飼喂干酪乳桿菌后的空腸組織形態(tài)學(xué)和炎性因子表達(dá)量的變化，分析干酪乳桿菌對沙門菌感染雛雞空腸黏膜上皮的損傷的保護(hù)作用，從而為干酪乳桿菌替代抗生素作為新型飼料添加劑提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及樣品采集

本研究所用干酪乳桿菌(LactobacilluscaseiDBN023)和沙門菌(SalmonellapullorumCMCC-533)分別由大北農(nóng)飼用微生物國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室和中國醫(yī)學(xué)微生物菌種保藏中心提供，分別作為益生菌和致病菌模式菌株。試驗(yàn)動物為SPF白來航初生雛雞(購自：北京梅里亞維通實(shí)驗(yàn)動物技術(shù)有限公司；實(shí)驗(yàn)雞場：國家糧食局科學(xué)研究院實(shí)驗(yàn)基地)將450只1日齡SPF健康雛雞隨機(jī)分為6個處理組，每個處理組5個重復(fù)，每個重復(fù)15只雞，分組處理如下：

表1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table 1 Experimental designing

基礎(chǔ)日糧中添加的干酪乳桿菌的劑量為108CFU/g，7日齡時灌服沙門菌液的濃度為109CFU/mL，劑量為1 mL。

在28日齡時，每組每個重復(fù)隨機(jī)選取1只雛雞，頸動脈放血致死，剖開腹腔，取兩段空腸中段2 cm 腸段，用PBS沖洗以除去腸內(nèi)容物。一段在4%多聚甲醛溶液中固定48 h，期間換一次固定液，用于蘇木精和伊紅(HE)染色；另一段放入裝有RNA store(DP408，天根生化科技有限公司，中國)液體的小管里，置于-80 ℃冰箱保存，用于進(jìn)一步分析細(xì)胞因子水平。

1.2 空腸黏膜結(jié)構(gòu)觀察

取出固定液中的腸道，采用HE染色法觀察腸道黏膜結(jié)構(gòu)的變化。將固定好的組織塊進(jìn)行常規(guī)脫水、透明、浸蠟和石蠟包埋，制備4 μm厚的連續(xù)切片，進(jìn)行HE染色。石蠟切片依次浸入二甲苯、梯度酒精進(jìn)行常規(guī)脫蠟至蒸餾水；蘇木素染色15 min后蒸餾水漂洗；1%鹽酸-酒精溶液分色后，用自來水藍(lán)化15 min；梯度酒精逐級脫水；浸入1%伊紅染色50 s；常規(guī)脫水，二甲苯透明，中性樹膠封片。Nikon Ni-U顯微鏡觀察、拍照并記錄。

1.3 空腸中炎性因子的測定

取出-80 ℃冰箱保存的空腸腸段，用全自動樣品研磨儀將組織破碎，離心，取上清。按照說明書用ELISA試劑盒檢測空腸中細(xì)胞因子的含量。試驗(yàn)中所用的ELISA試劑盒均購自于上海江萊生物科技有限公司，分別是雞白細(xì)胞介素-17(IL-17)ELISA檢測試劑盒(JL21621)、雞γ干擾素(IFN-γ)ELISA試劑盒(JL16053)、雞腫瘤壞死因子(TNF-α)ELISA試劑盒(JL21706)、雞白細(xì)胞介素-10(IL-10)ELISA試劑盒(JL21618)。

1.4 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析

本試驗(yàn)取得的數(shù)據(jù)采用GraphPad PrismTM5 (GraphPad Software,Inc.California,USA) 軟件進(jìn)行One-Way ANOVA單因素方差分析，結(jié)果用平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤表示。P<0.05表示差異顯著，P<0.01表示差異極顯著，P>0.05表示差異不顯著。

2 結(jié)果與分析

2.1 干酪乳桿菌處理對腸道組織結(jié)構(gòu)的影響

從組織學(xué)的角度觀察沙門菌和干酪乳桿菌作用后對雛雞空腸造成的影響，結(jié)果顯示：正常對照組與干酪乳桿菌組可見腸絨毛上皮杯狀細(xì)胞與柱狀細(xì)胞排列整齊，腸絨毛完整(圖1(a)和1(c))；沙門菌組可見腸絨毛上皮杯狀細(xì)胞嚴(yán)重脫落，柱狀細(xì)胞排列不整齊，腸絨毛不完整(圖1(b))；預(yù)防組和預(yù)防治療組與沙門菌組相比，可見腸絨毛上皮杯狀細(xì)胞部分脫落，柱狀細(xì)胞排列更加整齊，腸絨毛更完整(圖1(b)，1(d)和1(f))。

(a) 正常對照組；(b) 沙門菌組；(c) 干酪乳桿菌組；(d) 預(yù)防組；(e) 治療組；(f) 預(yù)防治療組(a) Control group; (b) Salmonella group; (c) Lactobacillus casei group; (d) Prevention group; (e) Treatment group;(f) Prevention plus treatment group圖1 不同處理組中雛雞空腸黏膜的形態(tài)學(xué)結(jié)構(gòu)Fig.1 Morphological structure of jejunum tunica mucosa in chicks of different treatment groups

2.2 干酪乳桿菌處理對腸道IL-17和IL-10表達(dá)量的變化

不同處理組IL-17的表達(dá)量分析結(jié)果如圖2(a)，與正常對照組相比，沙門菌組和預(yù)防組IL-17的表達(dá)量顯著升高。治療組和預(yù)防治療組與沙門菌組相比IL-17的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。從圖2(b)可以看出，在28日齡的雛雞空腸中，各組與正常對照組相比IL-10的表達(dá)量均顯著降低。干酪乳桿菌組、預(yù)防組、預(yù)防治療組與沙門菌組相比，IL-10 的表達(dá)量顯著升高(P<0.05)。

A 正常對照組；B 沙門菌組；C 干酪乳桿菌組；D 預(yù)防組；E 治療組；F 預(yù)防治療組；柱上不同字母表示組間差異顯著(P<0.05)。下同。A Control group; B Salmonella group; C Lactobacillus casei group; D Prevention group; E Treatment group; F Prevention plus treatment group; Columns marked with no common letters are significantly different (P<0.05) within groups. The same below.圖2 不同處理對雛雞空腸IL-17(a)和IL-10(b)表達(dá)的影響Fig.2 Effects of different treatments on IL-17 (a) and IL-10 (b) expression in jejunum of chicks

2.3 干酪乳桿菌處理對腸道IFN-γ和TNF-α表達(dá)量的變化

從圖3(a)可以看出，各組與正常對照組相比IFN-γ的表達(dá)量均升高，差異均顯著。與沙門菌組相比，干酪乳桿菌組和預(yù)防治療組IFN-γ的表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。不同處理組雛雞空腸TNF-α的表達(dá)量分析結(jié)果如圖3(b)，各組與正常對照組相比TNF-α的表達(dá)量均顯著升高。與沙門菌組相比，干酪乳桿菌組、預(yù)防組、預(yù)防治療組的TNF-α表達(dá)量顯著降低(P<0.05)。

圖3 不同處理對雛雞空腸IFN-γ (a)和TNF-α (b)表達(dá)的影響Fig.3 Effects of different treatments on the expression of IFN- γ (a) and TNF-α (b) in jejunum of chicks

3 討 論

3.1 干酪乳桿菌對腸道發(fā)育的影響

腸道屏障主要包含4個方面：腸道物理屏障、免疫屏障、化學(xué)屏障和微生物屏障。腸道物理屏障能夠阻止腸道中的細(xì)菌、內(nèi)毒素等有害物質(zhì)進(jìn)入血液，在維持腸道穩(wěn)態(tài)中起重要作用[9]。空腸是雛雞營養(yǎng)物質(zhì)吸收消化的主要場所，對雛雞的生長發(fā)育有著重要作用?？漳c的消化吸收主要依賴于腸絨毛，腸絨毛越完整，腸道的消化吸收能力越強(qiáng)。干酪乳桿菌作為一種益生菌，具有良好的益生特性，如耐酸性、膽汁抗性、抑制病原菌定植等[10]。研究表明，采食雙歧桿菌和乳桿菌等能夠在腸道定居的益生菌有望增加腸道中有益細(xì)菌種群，抑制大腸桿菌、葡萄球菌等病原體[11]。在北京黑豬育肥階段日糧中添加干酪乳桿菌能減少空腸中埃希氏菌屬-志賀氏菌屬的相對豐度，有利于提高豬的生長性能[12]。將干酪乳桿菌、嗜酸乳桿菌和雙歧桿菌按比例混合后添加至肉雞飲水中可以增強(qiáng)空腸中消化酶的活性，改善消化道結(jié)構(gòu)[13]。本研究結(jié)果表明，沙門菌攻毒后的雛雞腸黏膜結(jié)構(gòu)損傷，腸絨毛上皮細(xì)胞嚴(yán)重脫落；使用干酪乳桿菌預(yù)防和預(yù)防治療的雛雞腸黏膜完整性增加，腸絨毛上皮細(xì)胞脫落減輕，提示干酪乳桿菌可以減輕沙門菌對雛雞腸黏膜的破壞作用。本研究與前人研究結(jié)果一致，干酪乳桿菌能夠改善腸道形態(tài)?？赡苁怯捎诟衫胰闂U菌發(fā)酵降低腸道pH，抑制有害微生物繁殖，改變腸道滲透壓，刺激黏膜發(fā)育[14]。

3.2 干酪乳桿菌對腸道免疫的影響

腸道免疫屏障可保護(hù)腸道免受外來微生物的侵?jǐn)_，維持腸道穩(wěn)態(tài)。腸上皮淋巴細(xì)胞位于腸上皮細(xì)胞之間，可分泌促炎因子和抗炎因子，是腸道免疫屏障的重要組成部分。腸上皮淋巴細(xì)胞是由CD4+和CD8+構(gòu)成的T細(xì)胞群。腸上皮淋巴細(xì)胞刺激腸角質(zhì)細(xì)胞生長因子的產(chǎn)生，調(diào)節(jié)腸上皮細(xì)胞的產(chǎn)生和分化[15]。本研究發(fā)現(xiàn)，與對照組相比，干酪乳桿菌組和預(yù)防組的腸上皮淋巴細(xì)胞數(shù)量增加，表明干酪乳桿菌能夠提高腸道免疫，維持腸道穩(wěn)態(tài)。與沙門菌組相比，預(yù)防組的腸上皮淋巴細(xì)胞數(shù)量增加，表明干酪乳桿菌可減輕沙門菌感染造成的雛雞腸道損傷。IL-17是Th17細(xì)胞分泌的，主要作用是參與炎癥反應(yīng)并對其做出調(diào)整，它通過使腸黏膜上皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞產(chǎn)生趨化因子來調(diào)節(jié)粒細(xì)胞生成和中性粒細(xì)胞向腸固有層募集[16]。IFN-γ是腸上皮細(xì)胞穩(wěn)態(tài)的負(fù)性調(diào)節(jié)因子，IFN-γ處理腸間質(zhì)干細(xì)胞后可引發(fā)腸間質(zhì)干細(xì)胞凋亡[17]。TNF-α屬于TNF類細(xì)胞因子，由激活的巨噬細(xì)胞、樹突狀細(xì)胞、上皮細(xì)胞產(chǎn)生，是炎性腸病發(fā)病機(jī)制中最重要的介質(zhì)之一。有研究表明TNF-α能誘導(dǎo)炎性腸病炎癥組織中上皮細(xì)胞的凋亡和屏障的破壞、潘氏細(xì)胞的壞死，以及巨噬細(xì)胞產(chǎn)生炎性細(xì)胞因子[18-19]。研究結(jié)果表明，與沙門菌組相比，干酪乳桿菌組、預(yù)防組和預(yù)防治療組雛雞空腸中的IL-17、IFN-γ和TNF-α的表達(dá)量均下降，說明干酪乳桿菌可以減輕沙門菌對雛雞腸道造成的炎性作用。IL-10是一類抗炎性細(xì)胞因子，大部分由淋巴細(xì)胞分泌，發(fā)揮免疫抑制的能力，它對于具有產(chǎn)生分泌促炎癥因子的作用多種細(xì)胞有明顯抑止作用，減少TNF-α和IL-6等細(xì)胞因子生成，調(diào)節(jié)多種免疫相關(guān)細(xì)胞等的生成與分化，降低炎癥發(fā)生的概率[20-21]。本研究結(jié)果表明，與沙門菌組相比，干酪乳桿菌預(yù)防治療后IL-10的表達(dá)量顯著增加，表明干酪乳桿菌可以通過增加抗炎因子 IL-10 的分泌來維持雛雞腸道健康。

4 結(jié) 論

飼糧添加干酪乳桿菌可提高雛雞空腸黏膜的完整性，調(diào)節(jié)炎性因子的表達(dá)，減輕腸道炎癥損傷，從而改善腸黏膜的屏障功能。