于少帥 宋薇薇 覃偉權(quán)

摘 ?要：由植原體引起的檳榔黃化病是海南特色經(jīng)濟(jì)作物檳榔種植上的一種毀滅性病害。本研究通過(guò)PCR擴(kuò)增測(cè)序、序列多重比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析，對(duì)海南部分代表性地區(qū)檳榔致死性病原植原體的序列信息與系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行檢測(cè)分析。結(jié)果表明：本研究檢測(cè)的保亭、屯昌、萬(wàn)寧等海南部分代表性地區(qū)的檳榔黃化植原體的16S rDNA序列一致;BLAST分析表明各株系16S rDNA與16SrI組植原體同源性為100%。序列多重比對(duì)分析表明，本研究各檳榔黃化植原體株系與海南苦棟叢枝、長(zhǎng)春花綠變、馬松子變?nèi)~、辣椒黃化皺縮、蛇婆子叢枝、細(xì)圓藤叢枝和日本洋蔥黃化、美國(guó)翠菊黃化等植原體同源性為100%;與已報(bào)道的海南萬(wàn)寧、印度、海南三亞的檳榔黃化植原體16S rDNA序列同源性分別為99.9%、99.9%、99.8%。系統(tǒng)發(fā)育分析表明，本研究檳榔黃化植原體與海南苦棟叢枝、長(zhǎng)春花綠變、馬松子變?nèi)~、辣椒黃化皺縮、蛇婆子叢枝、細(xì)圓藤叢枝等株系聚于一個(gè)分枝，支持率為100%。此外，在發(fā)病檳榔葉片、花穗、心葉等組織部位均可檢測(cè)到植原體。研究結(jié)果表明，海南檳榔黃化植原體與海南苦棟叢枝、長(zhǎng)春花綠變、馬松子變?nèi)~、辣椒黃化皺縮、蛇婆子叢枝、細(xì)圓藤叢枝等植原體株系的同源性極高，檳榔黃化病很可能會(huì)以這些寄主植物作為病原傳播載體進(jìn)行傳播擴(kuò)散。

關(guān)鍵詞：植原體;檳榔黃化病;分子檢測(cè);親緣關(guān)系;傳播載體

中圖分類(lèi)號(hào)：S436.67 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識(shí)碼：A

Abstract： Areca palm yellow leaf （AYL） disease caused by phytoplasma is a devastating disease in the cultivation of areca palm， an important economic crop in Hainan. Through PCR amplification and sequencing， multiple sequence alignment and phylogenetic analysis， the sequence information and phylogeny of the lethal pathogen infecting areca palm from part representative regions of Hainan were analyzed. The 16S rDNA sequence of the AYL phytoplasma in part representative areas of Hainan， such as Baoting， Tunchang， Wanning County， were identical. BLAST analysis based on 16S rDNA showed that the phytoplasm in the study was 100% homology with 16SrI group phytoplasma. Multiple sequence alignment indicated that the phytoplasma in the study was 100% homology with the phytoplasma strains of Chinaberry witches’-broom， Periwinkle virescence， Melochia corchorifolia phyllody， Pepper yellow crinkle， Waltheria indica virescence， Pericampylus glaucus witches’-broom in Hainan and Onion yellows in Japan， Aster yellow witches’-broom in USA. Homology with the AYL phytoplasma from Wanning， Sanya （Hainan， China） and India was 99.9%， 99.9% and 99.8%， respectively. Phylogenetic analysis indicated that AYL strains in the study were clustered into one clade with the phytoplasma strains infecting the plant hosts like chinaberry， periwinkle， Melochia corchorifolia， pepper， Waltheria indica， Pericampylus glaucus in Hainan with 100% bootstrap value. Furthermore， the phytoplasma could be detected in the leaves， flower spikes， and heart leaves from the diseased areca palm. The study indicated that the homology of the AYL phytoplasmas was significantly high with the strains of chinaberry witches’-broom， periwinkle virescence， Melochia corchorifolia phyllody， pepper yellow crinkle， Waltheria indica virescence， Pericampylus glaucus witches’-broom. AYL disease is very likely to spread using the host plants as pathogen transmission vectors.

Keywords： phytoplasma; areca palm yellow leaf disease; molecular detection; genetic relationship; transmission vector

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.003

植原體（phytoplasma）是一類(lèi)寄生于植物韌皮部通過(guò)刺吸式口器昆蟲(chóng)傳播的植物毀滅性病原菌，1967年由日本學(xué)者土居養(yǎng)二首次發(fā)現(xiàn)[1]。植原體很難從植物或昆蟲(chóng)寄主中分離純化培養(yǎng)，對(duì)其遺傳信息及表達(dá)代謝等了解相對(duì)不足，嚴(yán)重制約植原體研究[2-3]。植原體引起的病害寄主種類(lèi)多、分布范圍廣、危害程度大，對(duì)社會(huì)經(jīng)濟(jì)、生態(tài)環(huán)境等影響嚴(yán)重，該病害目前尚無(wú)有效的治療藥劑，以防為主。海南省植原體病害種類(lèi)十分豐富，約占我國(guó)已鑒定植原體病害的五分之一，海南植原體病害遍及整個(gè)海南島且危害程度嚴(yán)重，給海南省農(nóng)林業(yè)造成巨大損失[4]。海南省受植原體病害影響的作物有檳榔（Areca catechu L.）、花生（Arachis hypogaea）、苦楝（Melia azedarach）、長(zhǎng)春花（Catharanthus roseus）、辣椒（Capsicum annuum）、細(xì)圓藤（Pericampylus glaucus）、山黃麻（Trema tomentosa）等海南特色經(jīng)濟(jì)作物或綠化植物，對(duì)海南的社會(huì)經(jīng)濟(jì)和生態(tài)環(huán)境等造成嚴(yán)重的影響[4-8]，其中檳榔黃化?。╝reca palm yellow leaf disease， AYL）在海南發(fā)生普遍且嚴(yán)重，影響巨大。

檳榔是我國(guó)“四大南藥”之首和海南省重要特色經(jīng)濟(jì)作物，具有很高的藥用價(jià)值和經(jīng)濟(jì)價(jià)值。由植原體引起的檳榔黃化病是海南檳榔種植上的一種毀滅性病害，對(duì)海南的社會(huì)經(jīng)濟(jì)和生態(tài)環(huán)境造成嚴(yán)重影響。海南檳榔黃化病于1981年首次發(fā)現(xiàn)于屯昌縣，目前已由發(fā)病初期的屯昌縣蔓延至海口、文昌、瓊海、萬(wàn)寧、陵水、瓊中、定安、樂(lè)東、保亭、三亞、五指山等多個(gè)市（縣）[4， 9]。金開(kāi)璇等[10]通過(guò)超薄電鏡切片在檳榔黃化病染病組織中觀察到了植原體。車(chē)海彥[4]、羅大全等[11]、通過(guò)超薄電鏡切片觀察、四環(huán)素注射處理、PCR擴(kuò)增檢測(cè)等技術(shù)進(jìn)一步證實(shí)植原體是海南檳榔黃化病的病原。近年來(lái)，在海南不同檳榔種植區(qū)均有不同程度的發(fā)生，且發(fā)病地區(qū)及面積仍在不斷擴(kuò)大，嚴(yán)重影響海南檳榔產(chǎn)業(yè)的健康可持續(xù)發(fā)展[4， 9]。目前，海南植原體病害的發(fā)生傳播、擴(kuò)散流行等問(wèn)題尚不清楚，海南不同縣（市）、不同生境、不同發(fā)病區(qū)植原體的來(lái)源、傳播途徑等問(wèn)題尚不明確，這些問(wèn)題嚴(yán)重制約海南相關(guān)植原體病害的防控管理。

本研究對(duì)海南不同代表性地區(qū)的檳榔黃化病進(jìn)行調(diào)查，采集檳榔黃化病及疑似植原體引起的其他植物病害樣品，通過(guò)PCR擴(kuò)增檢測(cè)、序列多重比對(duì)、系統(tǒng)發(fā)育分析等技術(shù)方法，從分子水平上對(duì)海南檳榔黃化植原體進(jìn)行檢測(cè)鑒定，豐富對(duì)檳榔黃化植原體分子水平上的認(rèn)知。對(duì)本研究中檳榔黃化植原體與前期已報(bào)道的檳榔黃化植原體及親緣關(guān)系或地理分布密切相關(guān)的植原體株系間的系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系進(jìn)行分析，揭示不同寄主植原體株系間遺傳變異水平和系統(tǒng)發(fā)育關(guān)系。為檳榔黃化病在海南的傳播擴(kuò)散、流行監(jiān)測(cè)和科學(xué)防控等研究提供科學(xué)參考，以促進(jìn)海南該類(lèi)病害防控理念的發(fā)展與提升。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?樣品采集 ?實(shí)驗(yàn)材料于2019—2020年采自海南保亭、屯昌、萬(wàn)寧等地疑似檳榔黃化植原體引起的檳榔黃化病植株，每個(gè)地點(diǎn)采集3份葉片樣品;針對(duì)同一株發(fā)病檳榔，采集葉片、花穗、心葉、莖皮、根等不同組織部位，每個(gè)組織部位采集3份樣品，同時(shí)采集健康的檳榔樣品作為對(duì)照，用作陽(yáng)性對(duì)照的泡桐叢枝植原體樣品取自中國(guó)林業(yè)科學(xué)研究院，所采樣品低溫保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 ?試劑 ?植物基因組DNA提取試劑盒（離心柱型）、2×PCR Master Mix預(yù)混液、50×TAE、SYBR Green I染料、6×Loading Buffer、DNA分子量標(biāo)準(zhǔn)DL2000購(gòu)自天根生化科技（北京）有限公司，其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。PCR擴(kuò)增引物由生工生物（上海）工程股份有限公司合成。

1.2 ?方法

1.2.1 ?總DNA提取 ?葉片、花穗、心葉、莖皮、根等樣品取樣量均為0.1 g，利用CTAB法提取染病檳榔組織中的總DNA，植原體總DNA提取方法參考天根植物基因組DNA提取試劑盒說(shuō)明書(shū)方法。

1.2.2 ?PCR擴(kuò)增測(cè)序 ?檳榔黃化植原體通過(guò)植原體通用引物R16mF2/R16mR1、R16F2n/R16R2[2]進(jìn)行擴(kuò)增。用引物R16mF2/R16mR1擴(kuò)增的PCR產(chǎn)物稀釋50倍后用作引物R16F2n/R16R2進(jìn)行巢式PCR擴(kuò)增的模板，引物序列信息見(jiàn)表1。PCR反應(yīng)體系和條件如下：PCR反應(yīng)體系為25 μL，包括1.0 μL DNA模板，1.0 μL上游引物和下游引物（10 μmol/L），12.5 μL 2×PCR Master Mix（包含0.05 U/μL Taq DNA聚合酶，4 mmol/L MgCl2和0.4 mmol/L dNTPs），用ddH2O補(bǔ)至25 μL。反應(yīng)條件為94.0 ℃，5 min;94.0 ℃，30 s，53.0 ℃，40 s，72.0 ℃，1 min 30 s（直接PCR）或1 min 20 s（巢式PCR），共35個(gè)循環(huán);72.0 ℃，10 min。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用SYBR Green I染色、經(jīng)1.0%（w/V）瓊脂糖凝膠、凝膠成像系統(tǒng)檢測(cè)。相關(guān)PCR擴(kuò)增引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用1.0%瓊脂糖凝膠檢測(cè)，有明顯目的條帶的擴(kuò)增產(chǎn)物送生工生物工程（上海）股份有限公司測(cè)序。本研究所得核苷酸序列均上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)。

1.2.3 ?序列比對(duì)分析 ?獲得的核苷酸序列采用DNAMAN 6.0軟件（Lynnon Corporation， Vau-dreuil-Dorion， Quebec， Canada）進(jìn)行編輯，并進(jìn)行多重序列比對(duì)，通過(guò)多重序列比對(duì)揭示不同植原體株系間的相似性及其變異位點(diǎn)。基于檳榔黃化植原體16S rDNA序列進(jìn)行BLAST分析（https：//blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi）。

1.2.4 ?系統(tǒng)發(fā)育分析 ?利用MEGA 7.0軟件的鄰接法（neighbor-joining， NJ）構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)[12]。自展值（bootstrap value）設(shè)為1000，用以評(píng)估軟件生成的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)的穩(wěn)定性和支持率[13]。洋蔥黃化植原體（onion yellows phytoplasma）OY-M（AP006628）、翠菊黃化植原體（aster yellow phytoplasma）AYWB（CP000061）、蘋(píng)果簇生植原體（apple proliferation phytoplasma）CPM（CU469464）、澳大利亞葡萄黃化植原體（Australia grape yellow phytoplasma）CPA（AM422018）和草莓致死黃化植原體（strawberry lethal yellow phytoplasma）SLY（CP002548）等全基因組測(cè)序已完成的植原體株系作為構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)的外類(lèi)群。

1.3 ?數(shù)據(jù)處理

本研究所得核苷酸序列均通過(guò)Submission Portal（https：//submit.ncbi.nlm.nih.g-ov/subs/genb-ank/）上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)并獲得序列號(hào)。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?檳榔黃化植原體分子檢測(cè)

在海南保亭、屯昌、萬(wàn)寧等3個(gè)地點(diǎn)采集的9份檳榔黃化病樣品中，均擴(kuò)增到植原體目的條帶，在健康的檳榔樣品中未擴(kuò)增到目的條帶，檳榔黃化病癥狀及其擴(kuò)增檢測(cè)結(jié)果見(jiàn)圖1。部分樣品PCR擴(kuò)增產(chǎn)物送測(cè)序，均獲得植原體靶標(biāo)基因序列。所得靶標(biāo)基因序列經(jīng)BLAST比對(duì)分析表明：所得序列為植原體16S rDNA序列，與16SrI組植原體的16S rDNA序列同源性極高甚至一致，如本研究所得植原體的16S rDNA序列與GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)中的16SrI組油菜變?nèi)~病植原體（rapeseed phyllody phytoplasma）（CP055264）的16S rDNA序列的同源性為100%，覆蓋率為100%。所得序列已上傳至GenBank數(shù)據(jù)庫(kù)，采自海南省保亭縣的檳榔黃化植原體株系A(chǔ)YL-hnbt的16S rDNA基因序列號(hào)為MZ427307，采自海南省屯昌縣的檳榔黃化植原體株系A(chǔ)YL-hntc的16S rDNA基因序列號(hào)為MZ427308，采自海南省萬(wàn)寧市的2個(gè)檳榔黃化植原體株系A(chǔ)YL-hnwn1和AYL-hnwn2的16S rDNA基因序列號(hào)分別為MZ427309和MZ427310。

2.2 ?序列同源性分析

基于植原體16S rDNA序列多重比對(duì)分析表明：海南保亭、屯昌、萬(wàn)寧等3個(gè)地點(diǎn)9份樣品中檢測(cè)到的檳榔黃化植原體16S rDNA序列一致，無(wú)變異位點(diǎn)，序列同源性為100%（表2）。同源比對(duì)分析表明：本研究采自海南保亭、屯昌、萬(wàn)寧等3個(gè)地點(diǎn)的檳榔黃化植原體株系A(chǔ)YL-hnbt、AYL-hntc、AYL-hnwn1、AYL-hnwn2與前期已鑒定的來(lái)自海南萬(wàn)寧（FJ998269）、印度（KF728948）的檳榔黃化植原體株系的16S rDNA序列同源性為99.9%，與來(lái)自海南三亞（FJ694685）的檳榔黃化植原體株系的16S rDNA序列同源性為99.8%。本研究采自海南保亭、屯昌、萬(wàn)寧等3個(gè)地點(diǎn)的檳榔黃化植原體株系與前期已鑒定的來(lái)自海南的苦楝叢枝植原體（chinaberry witches’- broom phytoplasma）（KP662119、KP662120）、長(zhǎng)春花綠變植原體（periwinkle virescence phytoplasma）（KP662136）、馬松子變?nèi)~植原體（Melochia corchorifolia phyllody phytoplasma）（KX150461）、辣椒黃化皺縮植原體（pepper yellow crinkle phytoplasma）（MT760793）、細(xì)圓藤叢枝植原體（Pericampylus glaucus witches’- broom phytoplasma）（MT872515）、蛇婆子綠變植原體（Waltheria indica virescence phytoplasma）（MW353909）及來(lái)自日本的洋蔥黃化植原體（AP006628）、來(lái)自美國(guó)的翠菊黃化叢枝植原體（CP000061）等各個(gè)植原體株系間的同源性為100%（表2）。

2.3 ?系統(tǒng)發(fā)育分析

采用MEGA 7.0軟件基于鄰接法構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹(shù)。本研究中采自海南保亭、屯昌、萬(wàn)寧等地的檳榔黃化植原體與車(chē)海彥[4]檢測(cè)的海南三亞檳榔黃化植原體株系（FJ694685）、周亞奎等[9]檢測(cè)的海南萬(wàn)寧檳榔黃化植原體株系（FJ998269）、Muddumadiah等[14]檢測(cè)的印度檳榔黃化植原體株系（KF728948）聚于一個(gè)進(jìn)化分枝，支持率為100%，均為16SrI組植原體（圖2）。Ramaswamy等[15]通過(guò)16S rRNA基因序列分析發(fā)現(xiàn)印度Sullia地區(qū)引起檳榔黃化病的檳榔黃化植原體屬于16SrXI組植原體株系（JN967909），與海南檳榔黃化植原體區(qū)別明顯（圖2，表2）。由此可見(jiàn)，檳榔黃化病可以由不同組或亞組的植原體導(dǎo)致，但目前未見(jiàn)2種以上植原體復(fù)合侵染引起檳榔黃化病的報(bào)道。此外，本研究鑒定的海南檳榔黃化植原體AYL-hnbt、AYL-hntc、AYL- hnwn1、AYL-hnwn2與海南引起苦楝叢枝（KP662119、KP662120）、長(zhǎng)春黃花綠變（KP662136）、馬松子變?nèi)~（KX150461）、辣椒黃化皺縮（MT760793）、細(xì)圓藤叢枝（MT872515）、蛇婆子綠變（MW353909）等相關(guān)病害的植原體株系聚于一個(gè)進(jìn)化分枝，支持率為100%（圖2）。

2.4 ?發(fā)病檳榔不同組織部位植原體檢測(cè)

在海南保亭、屯昌、萬(wàn)寧采集表現(xiàn)黃化癥狀的同一株檳榔的不同組織部位進(jìn)行檢測(cè)，基于植原體16S rRNA基因序列擴(kuò)增分析表明：在發(fā)病檳榔的葉片、花穗、心葉這3個(gè)組織部位中均檢測(cè)到植原體16S rRNA基因序列目的條帶，目的條帶約為1200 bp;在發(fā)病檳榔的根、莖皮這2個(gè)組織部位均未檢測(cè)到植原體16S rRNA基因序列目的條帶;在健康無(wú)癥狀的檳榔葉片、花穗、心葉、莖皮、根等不同組織部位以及去離子水陰性對(duì)照中均未檢測(cè)到植原體16S rRNA基因序列的目的條帶（圖3）。

3 ?討論

本研究對(duì)我國(guó)海南保亭、屯昌、萬(wàn)寧等地的檳榔黃化植原體檢測(cè)鑒定表明不同地區(qū)檳榔黃化植原體同源性很高甚至一致，本研究中不同檳榔黃化植原體株系間序列相似性為100%，均歸類(lèi)于16SrI組植原體。研究結(jié)論與海南前期已報(bào)道的檳榔黃化植原體株系為同一組，但存在一定程度的變異。車(chē)海彥[4]基于16S rRNA基因在海南屯昌、瓊海、定安、萬(wàn)寧、三亞等地均檢測(cè)到檳榔黃化植原體，通過(guò)序列比對(duì)和系統(tǒng)發(fā)育分析確定其鑒定的檳榔黃化植原體歸屬于16SrI組;周亞奎等[9]基于16S rRNA基因PCR擴(kuò)增分析也表明海南檳榔黃化病是由16SrI組檳榔黃化植原體引起的。本研究中來(lái)自海南的檳榔黃化植原體與車(chē)海彥[4]、周亞奎等[9]檢測(cè)的海南檳榔黃化植原體的16S rDNA序列同源性極高，分別為99.9%和99.8%。

與國(guó)外檳榔黃化植原體檢測(cè)鑒定研究相比，本研究報(bào)道的檳榔黃化植原體與Muddumadiah等[14]報(bào)道的印度檳榔黃化植原體均屬于16SrI組植原體，16S rDNA序列同源高達(dá)99.9%。Ramaswamy等[15]基于16S rRNA基因序列分析表明印度檳榔黃化病可以由16SrXI組檳榔黃化植原體引起;Silva等[16]基于16S rRNA基因序列分析表明斯里蘭卡檳榔黃化病由16SrXIV組檳榔黃化植原體引起。目前，海南已報(bào)道的檳榔黃化植原體均為16SrI組植原體，未見(jiàn)其他16Sr組的植原體株系或2種以上的植原體復(fù)合侵染而引起檳榔黃化病的報(bào)道

海南屬熱帶島嶼，具有獨(dú)特的生物多樣性與地理生態(tài)特征。已有報(bào)道表明海南的植原體及其相關(guān)病害的種類(lèi)十分豐富，數(shù)量相對(duì)較多，地理分布幾乎遍及整個(gè)海南，對(duì)海南一些主要的經(jīng)濟(jì)作物、生態(tài)植物危害十分嚴(yán)重[3-4]。本研究表明海南引起檳榔黃化病的檳榔黃化植原體株系與海南引起苦楝叢枝、長(zhǎng)春黃花綠變、馬松子叢枝、辣椒黃化皺縮、細(xì)圓藤叢枝、蛇婆子綠變等病害[5-7]的植原體株系同源性極高，親緣關(guān)系很近，相關(guān)植原體株系間的16Sr DNA序列的同源性高達(dá)100%，極有可能是同一種植原體侵染不同的植物寄主引起相應(yīng)的植物病害癥狀。

植原體主要通過(guò)寄主種苗、媒介昆蟲(chóng)、菟絲子（Cuscuta chinensis）等傳播介體進(jìn)行長(zhǎng)距離或短距離傳播。本研究發(fā)現(xiàn)海南檳榔黃化植原體與海南苦楝叢枝、長(zhǎng)春黃花綠變、馬松子叢枝、辣椒黃化皺縮、細(xì)圓藤叢枝等植原體[5-7]同源性高達(dá)100%，相關(guān)植原體株系親緣關(guān)系極近，侵染檳榔引起檳榔黃化病的植原體可能侵染苦楝、長(zhǎng)春花、馬松子（Melochia corchorifolia）等寄主植物引起相關(guān)植物叢枝、綠變等癥狀，即檳榔黃化植原體的傳播除了可以通過(guò)檳榔種苗、媒介昆蟲(chóng)、菟絲子等載體進(jìn)行傳播，也可能會(huì)通過(guò)苦楝、辣椒、長(zhǎng)春花等植原體寄主植物的運(yùn)輸流通而進(jìn)行傳播擴(kuò)散。因此，在檳榔黃化病的防控過(guò)程中，除了對(duì)檳榔種苗、媒介昆蟲(chóng)等進(jìn)行防控管理外，也應(yīng)對(duì)苦楝、辣椒、長(zhǎng)春花等相關(guān)植原體寄主植物的運(yùn)輸流通加強(qiáng)檢疫管理，從源頭上切斷病原傳播途徑，杜絕病害傳播擴(kuò)散。

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