林兆威 牛曉慶 唐慶華 宋薇薇 孟秀利 覃偉權(quán)

摘 ?要：為了建立一種快速、精準(zhǔn)且能定量分析檳榔隱癥病毒1型（Areca palm velarivirus 1， APV1）的檢測方法。本研究參照GenBank中已登錄的APV1全基因組序列，在p21蛋白基因保守區(qū)域和p60蛋白基因保守區(qū)域之間設(shè)計(jì)1對特異性RT-PCR引物，并構(gòu)建陽性重組質(zhì)粒;在p60蛋白基因保守區(qū)域部分設(shè)計(jì)熒光定量PCR特異性引物和TaqMan-MGB探針，利用陽性重組質(zhì)粒，構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對該檢測方法的敏感性、特異性、穩(wěn)定性及其應(yīng)用效果進(jìn)行驗(yàn)證。結(jié)果顯示：該方法對陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品檢測的敏感性達(dá)3.0×101 copies/μL級別，是常規(guī)RT-PCR敏感性的100倍;標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，Ct值與拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=-3.2748x+42.957，擴(kuò)增效率為102%，相關(guān)系數(shù)R2為0.9992;該方法對APV1的檢測具有較好的特異性，其他檳榔病原物及內(nèi)生菌不會對本方法產(chǎn)生非特異性干擾;批內(nèi)與批間重復(fù)性試驗(yàn)結(jié)果顯示，該方法對APV1的檢測具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性;利用該方法對海南萬寧、瓊海、定安、文昌等4個市（縣）采集的181份疑似樣品進(jìn)行檢測，陽性率分別為91.95%、86.95%、89.65%、73.68%，其陽性的病毒拷貝數(shù)最高達(dá)1.59×107 copies/μL，表明海南部分地區(qū)APV1病毒載量較高、流行情況比較嚴(yán)重。

關(guān)鍵詞：檳榔;檳榔隱癥病毒1型;TaqMan實(shí)時熒光定量PCR

中圖分類號：S763.7 ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)識碼：A

Abstract： It is aimed to develop a rapid， precision and quantitative detection method for Areca palm velarivirus 1 （APV1）. A pair of specificity RT-PCR primers were designed based on the APV1 complete genome sequence registered in GenBank to clone the sequence between the conservative region of p21 and the conservative region of p60， and a positive recombinant plasmid was constructed. Fluorescence quantitative PCR specificity primers and TaqMan-MGB probes were designed in the conservative region of p60 and a positive recombinant plasmid was constructed to establish a standard curve to verify the sensitivity， specificity， stability and application effect of the detection method. The sensitivity of this method to the detection of positive plasmid standards was up to 3.0×101 copies /μL， which was 100 times the sensitivity of conventional RT-PCR. The standard curve showed that the Ct value had a linear relationship with the logarithm of the copy number. The standard curve equation was y=-3.2748x+42.957， the amplification efficiency was 102%， and the correlation coefficient R2 was 0.9992. The method has good specificity for the detection of APV1， and other areca pathogens and endophytes will not be affected by this method. The intra batch repeat test and inter batch repeat test results showed that this method had good repeatability and stability in the detection of APV1. This method was used to detect 181 suspected samples collected from 4 cities and counties in Hainan， including Wanning， Qionghai， Ding’an， and Wenchang. The positive rate was 91.95%， 86.95%， 89.65%， and 73.68%， respectively， and the number of positive virus copies was up to 1.59×107 copies/μL. It shows that APV1 virus load is relatively high and the epidemic situation is relatively serious in some areas of Hainan.

Keywords： areca; Areca palm velarivirus 1; TaqMan RT-qPCR

DOI： 10.3969/j.issn.1000-2561.2021.11.006

檳榔（Areca cathecu L.）是棕櫚科檳榔屬多年生熱帶喬木，原產(chǎn)于馬來西亞，是我國的“四大南藥”（檳榔、砂仁、益智、巴戟天）之首，現(xiàn)主要分布在印度、中國、緬甸、孟加拉國及印度尼西亞等熱帶及亞熱帶國家與地區(qū);在我國，檳榔主要栽培于海南、臺灣及云南等地，其中海南省檳榔種植面積占全國的95%以上，產(chǎn)量位居世界第二位，是海南省第二大熱帶經(jīng)濟(jì)作物、海南省政府重點(diǎn)發(fā)展的“三棵樹”（橡膠、檳榔、椰子）之一[1-2]。近年來，國內(nèi)檳榔消費(fèi)市場迅速擴(kuò)張，效益日益增長，據(jù)《海南省統(tǒng)計(jì)年鑒（2020）》統(tǒng)計(jì)，海南檳榔種植面積逐年擴(kuò)大，2019年種植面積達(dá)11.52萬hm2。檳榔已成為海南省中東部地區(qū)230多萬農(nóng)民的主要收入來源。

隨著檳榔種植面積的不斷擴(kuò)大，植保問題日趨嚴(yán)重，檳榔黃化現(xiàn)象倍受關(guān)注。Wang等[3]研究指出，檳榔隱癥病毒1型（Areca palm velarivirus 1， APV1）是造成檳榔黃化現(xiàn)象的病害因子之一，且該病毒引發(fā)的癥狀與檳榔黃化病（arecanut yellow leaf disease， AYLD）的癥狀極其相似。隨后，本研究團(tuán)隊(duì)對海南省檳榔黃化現(xiàn)象進(jìn)行調(diào)查，并對APV1進(jìn)行RT-PCR檢測分析，發(fā)現(xiàn)APV1在海南檳榔種植地區(qū)危害范圍廣，且為害面積較大，對檳榔產(chǎn)業(yè)健康發(fā)展構(gòu)成潛在的威脅，引起本研究團(tuán)隊(duì)的高度重視（該結(jié)果待發(fā)表）。然而，快速、精準(zhǔn)的檢測技術(shù)對APV1的診斷尤為重要，當(dāng)前對于該病毒的檢測主要采用RT-PCR技術(shù)[4]。由于TaqMan實(shí)時熒光定量PCR檢測技術(shù)具有較高的特異性、靈敏性及穩(wěn)定性，并可對檢測的病原物進(jìn)行定量分析，目前該方法廣泛應(yīng)用于動植物的病原檢測[5-9]。因此，本研究根據(jù)APV1基因組序列，在p60蛋白基因保守序列中設(shè)計(jì)TaqMan- MGB探針，建立TaqMan RT-qPCR檢測方法，并對該方法的敏感性、特異性、穩(wěn)定性及其應(yīng)用效果進(jìn)行了驗(yàn)證，以期為APV1精準(zhǔn)診斷、病原監(jiān)測及分子流行病學(xué)的研究提供可靠的技術(shù)手段。

1 ?材料與方法

1.1 ?材料

1.1.1 ?供試樣品 ?檳榔隱癥病毒1型（Areca palm velarivirus 1， APV1）、檳榔壞死環(huán)斑病毒（Areca palm necrotic ringspot virus， ANRSV）及檳榔黃化植原體（arecanut yellow leaf phytoplasma， AYL）由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所提供，并分別采用RT-PCR、巢氏PCR技術(shù)檢測為陽性;檳榔炭疽菌、檳榔葉片分離的內(nèi)生或致病細(xì)菌：Burkholderia andropogonis、Pantoea ananatis、Sphingomonas yantingensis、Curtobacterium al-bidum、Bacillus cereus、Frondihabitans australicus由中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所提供;健康檳榔葉片樣品采自中國熱帶農(nóng)業(yè)科學(xué)院椰子研究所檳榔苗圃，經(jīng)RT-PCR對APV1檢測為陰性;疑似APV1樣品采自海南萬寧87份、瓊海46份、定安29份及文昌19份等4個市（縣）檳榔園，共181份。

1.1.2 ?主要試劑與儀器 ?主要試劑：RNAprep Pure多酚多糖植物總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成試劑盒、2×Taq PCR mix、瓊脂糖凝膠回收試劑盒、質(zhì)粒小提試劑盒及實(shí)時熒光定量PCR（探針法）試劑盒購于天根生化科技（北京）有限公司，pMDTM18-T Vector購自TaKaRa公司;DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司。主要儀器：Bio-Rad T100 PCR儀器，QuanStudio 6 Flex Real-time定量PCR儀，QuantStudio 3 Real-time定量PCR儀，超微量分光光度計(jì) Thermo ND2000。

1.2 ?方法

1.2.1 ?引物與探針設(shè)計(jì)與合成 ?根據(jù)APV1基因組序列（GenBank登錄號：MK956940.2），利用DNAMAN軟件，在p21蛋白基因保守區(qū)域和p60蛋白基因保守區(qū)域設(shè)計(jì)上下游引物APV1-F/ APV1-R，該擴(kuò)增片段用于構(gòu)建陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品;并利用Primer Express 3.0軟件在p60蛋白基因保守的區(qū)域部分設(shè)計(jì)實(shí)時熒光定量PCR特異性引物APV1-F1/APV1-R1和探針APV1-Probe（表1）。引物與探針由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

1.2.2 ?RNA提取及反轉(zhuǎn)錄cDNA合成 ?利用RNAprep Pure多酚多糖植物總RNA提取試劑盒，參照說明書，提取樣品總RNA，并利用反轉(zhuǎn)錄cDNA第一鏈合成試劑盒，將提取的總RNA進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄，獲得cDNA，?20 ℃保存。

1.2.3 ?實(shí)時熒光定量PCR引物驗(yàn)證 ?使用引物APV1-F1/APV1-R1和探針APV1-Probe，以3份陽性樣品cDNA為模板，健康檳榔樣品cDNA陰性對照，ddH2O為空白對照進(jìn)行TaqMan RT- qPCR，參照試劑盒說明書，20 μL反應(yīng)體系：2×SuperReal PreMix （Probe） 10μL，正反向引物（10 μmol/L）各0.6 μL，熒光探針（10 μmol/L）0.4 μL，cDNA模板2 μL，50×ROX Reference Dye3 0.2 μL，RNase-Free ddH2O 6.5 μL。使用QuantStudio 3 Real-time定量PCR儀，設(shè)置TaqMan RT-qPCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性15 min;95 ℃變性3 s，60 ℃退火/延伸30 s，40個循環(huán)。

1.2.4 ?陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品的制備 ?使用引物APV1-F/APV1-R，以APV1 cDNA為模板，健康檳榔樣品cDNA陰性對照，ddH2O為空白對照進(jìn)行RT-PCR，PCR產(chǎn)物進(jìn)行瓊脂糖凝膠電泳檢測，切下目的條帶，利用瓊脂糖凝膠回收試劑盒進(jìn)行目的條帶純化，純化后產(chǎn)物連接到pMDTM18-T Vector，并轉(zhuǎn)化進(jìn)DH5α感受態(tài)細(xì)胞中，篩選并提取陽性克隆子的質(zhì)粒，送生工生物工程（上海）股份有限公司進(jìn)行測序。將測序正確的質(zhì)粒使用超微量分光光度計(jì)測定濃度，置于?20 ℃保存?zhèn)溆?。運(yùn)用Shirima等[10]的方法計(jì)算重組質(zhì)粒中的拷貝數(shù)，重組質(zhì)?？截悢?shù)（copies/μL）=（阿伏伽德羅常數(shù)×C）/（109×重組質(zhì)粒堿基對數(shù)×660 dalton/bp）。其中阿伏伽德羅常數(shù)為6.02×1023;C為重組質(zhì)粒的濃度（ng/μL）。最終計(jì)算得到重組質(zhì)粒的拷貝數(shù)為3.0×1010 copies/μL。RT-PCR反應(yīng)體系：2×Taq PCR mix 12.5 μL，上下游引物（10 μmol/L）各1.0 μL，cDNA模板2.0 μL，ddH2O 8.5 μL。目的片段RT-PCR反應(yīng)程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃變性45 s，53 ℃退火45 s，72 ℃延伸40 s，35個循環(huán);72 ℃延伸10 min。

1.2.5 ?敏感性試驗(yàn)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立 ?將1.2.4獲得的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為初始模板，按10倍梯度稀釋出10個標(biāo)準(zhǔn)品濃度，拷貝數(shù)依次為3.0×109、3.0×108、3.0×107、3.0×106、3.0×105、3.0×104、3.0×103、3.0×102、3.0×101、3.0×100 copies/μL。以上10個梯度濃度陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，健康檳榔樣品為陰性對照，進(jìn)行TaqMan RT-qPCR。使用QuanStudio 6 Flex Real-time定量PCR儀，反應(yīng)體系和程序參照1.2.3，得到動力學(xué)擴(kuò)增曲線和PCR擴(kuò)增循環(huán)閾值（Ct值）。運(yùn)用Excel 2020軟件，以Ct值為縱坐標(biāo)，10為底質(zhì)?？截悢?shù)的對數(shù)值為橫坐標(biāo)作標(biāo)準(zhǔn)曲線，獲得回歸直線方程，并計(jì)算該組體系的擴(kuò)增效率：擴(kuò)增效率（%）= 10（?1/斜率）?1。并將上述稀釋的10個濃度梯度的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，健康檳榔樣品為陰性對照，使用APV1-F1/APV1-R1引物進(jìn)行RT-PCR，PCR產(chǎn)物經(jīng)凝膠電泳后驗(yàn)證，與TaqMan RT-qPCR敏感性的結(jié)果比較。

1.2.6 ?特異性試驗(yàn) ?以檳榔APV1的cDNA為陽性對照、健康檳榔cDNA為陰性對照，ANRSV、檳榔黃化植原體、Burkholderia andropogonis、Pantoea ananatis、Sphingomonas yantingensis、Curtobacterium albidum、Bacillus cereus、Frondihabitans australicus的cDNA為模板進(jìn)行TaqMan RT-qPCR，檢測其特異性，使用QuantStudio 3 Real-time定量PCR儀，反應(yīng)體系和設(shè)置程序參照1.2.3。

1.2.7 ?重復(fù)性試驗(yàn) ?選取3.0×109、3.0×108、3.0×107、3.0×106 copies/μL 4個濃度的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行TaqMan RT-qPCR檢測，每個濃度重復(fù)3次，共檢測3次，進(jìn)行批內(nèi)重復(fù)性試驗(yàn)，計(jì)算Ct值的變異系數(shù)。同時，將上述濃度的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品保存在?20 ℃ 3、6、9 d后，以相同反應(yīng)條件重復(fù)進(jìn)行批間試驗(yàn)，計(jì)算Ct值的變異系數(shù)，驗(yàn)證該方法的重復(fù)性和穩(wěn)定性。使用QuanStudio 6 Flex Real-time定量PCR儀，反應(yīng)體系和設(shè)置程序參照1.2.3。

1.2.8 ?田間樣本檢測 ?從海南萬寧、瓊海、定安、文昌等4個市（縣）檳榔園中分別采集87、46、29、19份疑似APV1病樣，并將這181份疑似樣品進(jìn)行總RNA提取，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，運(yùn)用本研究建立的TaqMan RT-qPCR方法進(jìn)行檢測，健康檳榔樣品為陰性對照，獲得該4個市（縣）檳榔APV1的檢出率，并根據(jù)1.2.5的標(biāo)準(zhǔn)曲線回歸方程，計(jì)算田間樣品病毒的最高、最低拷貝數(shù)。使用QuanStudio 6 Flex Real-time定量PCR儀，反應(yīng)體系和設(shè)置程序參照1.2.3。

2 ?結(jié)果與分析

2.1 ?熒光定量PCR引物的驗(yàn)證

使用引物APV1-F1/APV1-R1和探針APV1- Probe對3份APV1陽性樣品和1份陰性樣品進(jìn)行TaqMan RT-qPCR。如圖1所示，3份陽性樣品均出現(xiàn)“S”形擴(kuò)增曲線，而陰性樣品和空白對照未出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，說明該TaqMan RT-qPCR的引物/探針組合能檢測到APV1，可進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)。

2.2 ?陽性標(biāo)準(zhǔn)品的制備

以3份APV1陽性樣品為模板，使用引物APV1-F/APV1-R進(jìn)行RT-PCR，經(jīng)凝膠電泳，結(jié)果如圖2，獲得約490 bp的擴(kuò)增片段。經(jīng)純化后的產(chǎn)物進(jìn)行載體連接、感受態(tài)細(xì)胞轉(zhuǎn)化，并將重組質(zhì)粒測序后進(jìn)行NCBI blast比對，與報道的APV1序列（GenBank登錄號：MK956940.2）一致性達(dá)100%，說明已獲得陽性標(biāo)準(zhǔn)品。

2.3 ?敏感性試驗(yàn)與標(biāo)準(zhǔn)曲線的建立

將3.0×109～3.0×100 copies/μL 10個濃度梯度的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品為模板，健康檳榔樣品為陰性對照，進(jìn)行TaqMan RT-qPCR和RT-PCR，并利用Ct值與拷貝數(shù)的對數(shù)構(gòu)建標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，該引物/探針對10個濃度梯度的陽性質(zhì)粒標(biāo)準(zhǔn)品最低能檢測到3.0×101 copies/μL（圖3），而RT-PCR最低能檢測到3.0×103 copies/μL（圖4），TaqMan RT-qPCR檢測APV1的敏感性是常規(guī)RT-PCR的100倍。標(biāo)準(zhǔn)曲線顯示，Ct值與拷貝數(shù)的對數(shù)呈線性關(guān)系，其標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=?3.2748x+42.957，擴(kuò)增效率為102%，相關(guān)系數(shù)R2為0.9992（圖5）。

2.4 ?特異性試驗(yàn)

使用檳榔APV1及葉片中主要的病原菌和內(nèi)生細(xì)菌進(jìn)行TaqMan RT-qPCR特異性驗(yàn)證，結(jié)果如圖6所示，僅APV1出現(xiàn)擴(kuò)增曲線，健康檳榔陰性對照、檳榔植原體、ANRSV、檳榔炭疽菌、Burkholderia andropogonis、Pantoea ananatis、Sph-i?ngomonas yantingensis、Curtobacterium albid?um、Bacillus cereus、Frondihabitans australicus均未擴(kuò)增出，說明該TaqMan RT-qPCR方法對APV1的檢測具有較好的特異性，其他檳榔病原物和內(nèi)生菌不會對本檢測方法產(chǎn)生非特異性干擾。

2.5 ?重復(fù)性試驗(yàn)

選取3.0×109、3.0×108、3.0×107及3.0×106 copies/L 4個濃度的陽性標(biāo)準(zhǔn)品為模板，進(jìn)行TaqMan RT-qPCR檢測，分別驗(yàn)證該方法的批內(nèi)和批間的重復(fù)性和穩(wěn)定性。結(jié)果如表2所示，批內(nèi)變異系數(shù)小于1%，批間變異系數(shù)小于2%，表明該方法對APV1的檢測具有較好的重復(fù)性和穩(wěn)定性。

2.6 ?田間樣本檢測

運(yùn)用建立的TaqMan qRT-PCR方法對海南萬寧、瓊海、定安、文昌等4個市（縣）的檳榔園中采集的181份疑似樣品進(jìn)行檢測。結(jié)果顯示，萬寧、瓊海、定安、文昌的陽性率分別為91.95%、86.95%、89.65%、73.68%，其陽性的病毒拷貝數(shù)在11.23 copies/μL～1.59×107 copies/μL之間，表明海南部分地區(qū)APV1病毒載量較高、流行情況比較嚴(yán)重。

3 ?討論

3.1 ?TaqMan RT-qPCR檢測APV1方法的建立

目前對APV1的檢測主要有RT-PCR技術(shù)和酶聯(lián)免疫檢測技術(shù)[4， 11]。相較于TaqMan RT-qPCR技術(shù)，傳統(tǒng)的RT-PCR技術(shù)敏感性較低，且耗時久;雖然酶聯(lián)免疫檢測具有便捷、快速及直觀的特點(diǎn)，但該技術(shù)敏感性未能達(dá)到更高的檢測要求，并且準(zhǔn)確性往往依賴于抗血清的品質(zhì)[12]。TaqMan RT-qPCR技術(shù)具有較高的特異性和敏感性，該技術(shù)不僅可用于定性檢測，也可用于定量分析。在本研究中，該TaqMan RT-qPCR檢測方法的敏感性可達(dá)3.0×101 copies/μL級別，比RT-PCR的敏感性高100倍，在實(shí)際應(yīng)用中，可檢測含量最低至11.23 copies/μL的病毒，并且具有較高的穩(wěn)定性和特異性。因此，該TaqMan RT-qPCR檢測方法的建立，對APV1的病原監(jiān)測及分子流行病學(xué)的研究提供了可靠的技術(shù)手段。

3.2 ?APV1對檳榔產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有潛在的威脅性

隱癥病毒屬可為害甜菜、葡萄、柑橘、小麥及胡蘿卜等多種經(jīng)濟(jì)作物，屬于正義ssRNA病毒[13]。由隱癥病毒屬引起的甜菜黃化病毒（Beet yellows virus， BYV）一般年份的發(fā)病率達(dá)50%～60%，塊根減產(chǎn)20%～25%，含糖率下降2%～3%，染病種子減產(chǎn)30%[14];葡萄卷葉伴隨病毒2（Grapevine leafroll-associated virus 2， GLRaV-2）是我國葡萄卷葉病的主要病原之一，該病毒嚴(yán)重影響葡萄產(chǎn)量和質(zhì)量[15];柑橘衰退病毒（Citrus tristeza virus， CTV）則嚴(yán)重為害世界柑橘生產(chǎn)的重要病原物之一[16]。檳榔隱癥病毒1型（APV1）為長線形病毒科、隱癥病毒屬病毒，2015年Yu等[17]首次報道在國內(nèi)發(fā)生流行，并對APV1-HN株進(jìn)行全基因組測序，此后關(guān)于APV1的報道較少。至2020年Wang等[3]對APV1-WNY株進(jìn)行全基因組測序，并闡述APV1與檳榔黃化病存在相關(guān)性和APV1的潛在傳播媒介為粉蚧。隨后，本研究團(tuán)隊(duì)于2020年對海南省檳榔黃化現(xiàn)象進(jìn)行調(diào)查，并檢測APV1，發(fā)現(xiàn)APV1在全省檳榔中分布廣，并且發(fā)病率較高。在本研究中，應(yīng)用TaqMan RT-qPCR檢測方法對海南萬寧、瓊海、定安、文昌等4個市（縣）的檳榔園中采集的181份疑似樣品進(jìn)行檢測，其陽性率分別為91.95%、86.95%、89.65%、73.68%，表明APV1病毒在海南檳榔主栽區(qū)發(fā)病率高，對海南檳榔產(chǎn)業(yè)發(fā)展具有潛在的威脅性，需提高重視，加強(qiáng)該病害的監(jiān)測、檢測及其流行病學(xué)的研究。

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